病毒基因组中的高度保守区序列作为设计治疗性sliRNA模板的应用
【专利说明】病毒基因组中的高度保守区序列作为设计治疗性sIiRNA 模板的应用
[0001] 本申请是申请号为201180050847. 5、申请日为2011年9月19日、2013年4月22日 进入中国国家阶段、发明名称为"病毒基因组中的高度保守区序列作为设计治疗性sliRNA 模板的应用"的发明专利申请的分案申请。
[0002] 夺叉引用
[0003] 本申请要求2010年9月20日提交的美国申请第12/886, 446号的权益，该美国申 请的全部内容在此通过引用并入本文。
[0004] 对序列表的引用
[0005] 本申请包括通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表并且该序列表的全部内容在 此通过引用并入本文。在2011年9月19日创建的ASCII副本的名称为Doc.No. 4170050_1. txt，大小为 9. 28KB。
【背景技术】
[0006] 小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)是带有特定基因密码的短双链RNA 片段，功能长度一般为21-23核苷酸。siRNA与互补mRNA特异性结合，使靶定的mRNA降解 并失去功能。这种由siRNA有效介导的转录后的基因沉默现象称之为RNAi(RNA干扰），其 为自然存在于细胞中的防御机制。当双链RNA进入细胞内时，其被切割成带有21-25个核 苷酸的siRNA片段。所述片段先与细胞内的其它成分结合以形成核酸蛋白复合体，称之为 RNA诱导的沉默复合物（RISC)。激活的RISC通过碱基配对靶向到同源mRNA上，从而切割 并降解mRNA，由此阻止细胞内特定的基因表达。siRNA不仅广泛应用于生物医学研宄，而且 在治疗多种疾病如病毒感染、癌症、血管疾病、神经系统疾病等具有广阔的前景。
[0007] 年龄相关性黄斑变性（AMD)是50岁以上的人视力不可逆性损害的主要原因之一。 AMD在临床上分为"干性"和"湿性"两型，湿性AMD发展快，是引起失明的主要原因。其病 理变化导致严重的视力障碍。AMD的表现包括视网膜色素上皮细胞（RPE)功能受损和黄斑 部脉络膜新生血管（CNV)。在一些严重病例中还会出现液体渗出，RPE或神经上皮的脱离， 血管破裂造成出血性脱离。已发现许多细胞因子在CNV的生成过程中发挥着重要的调控 作用，所述细胞因子包括血管内皮细胞生长因子（VEGF)、VEGF受体（VEGFR)、缺氧诱导因子 (HIF)、血管生成素（Ang)和其它细胞因子，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK)及其它。
[0008] 已对RNAi在抑制CNV方面的效力做了测试，Cashman等的研宄表明（CashmanSM 等人，InvestOphthalmolVisSci，2006;47(8) :3496-3504)，将构建在腺病毒表达载体中 的VEGF短发夹RNA(shRNA)玻璃体腔内注射于VEGF165诱导的CNV小鼠模型。该注射治疗 可有效地抑制VEGF的过表达并且成功地阻止CNV的形成。证据显示shRNA腺病毒载体被递 送（跨膜）至细胞质并引发RISC的活化，使目标RNA降解。由于人们对腺病毒载体在临床 应用上的顾虑，尝试使用裸露（无传输介质）的VEGFsiRNA使目标基因沉默。结果显示通 过裸露的"siRNA"抑制VEGF表达确实降低了在小鼠模型中CNV的形成（Reich，S.J等人， Mol.Vis. 2003 ;9 :210 - 216)。
[0009] 本领域仍然需要改良的、基于RNA的抑制剂，用于治疗如AMD和CNV的疾病。
【发明内容】
[0010] 一方面，本发明提供了一种调节Toll样受体（TLR)的sliRNA，该sliRNA含有与病 毒基因组序列的高度保守区的片段具有至少80%同源性的核苷酸序列。在一些实施方式 中，所述核苷酸序列与高度保守区的片段具有至少85%、90%、95%、100%的同源性。在一 些实施方式中，Toll样受体是Toll样受体3 (TLR3)。在一些实施方式中，高度保守区位于 病毒基因组的选自5'非翻译区（UTR)、3'UTR及开放阅读框（0RF)的区域。在一些实施方 式中，病毒是选自脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、人肠道孤病毒、微小核糖核酸病毒、肠道病 毒的人类病毒。在一些实施方式中，高度保守区序列位于SEQIDNO: 1的241-263位。在 一些实施方式中，sliRNA包括双链RNA，该双链RNA可为平末端或可具有3'或5'突出端。 在一些实施方式中，sliRNA的长度为14-25核苷酸。在一些实施方式中，sliRNA包括位于 核苷酸序列的3'端的1~2个DNA碱基。
[0011] 另一方面，本发明提供sliRNA，该sliRNA包含具有以下序列的双链RNA分子：
[0012] 正义链：5' -UAGGUACUUCGAGAAGCCUAGUANn-3'（SEQIDN0:14)
[0013]反义链：5' -UACUAGGCUUCUCGAAGUACCUANn-3'，（SEQIDN0:15)
[0014] 或：
[0015]正义链：5' -AGGUACUUCGAGAAGCCNn-3'（SEQIDN0:28)
[0016]反义链：5' -GGCUUCUCGAAGUACCUNn-3'（SEQIDN0:29)
[0017]其中，N是选自胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶及其脱氧形式的核苷酸，并且，其 中，n是0~2的整数。在一些实施方式中，N是dT，且n为2。在一些实施方式中，n为2。 [0018] 再一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文提供的 sliRNA，以及药学上可接受的载体。
[0019] 另一方面，本发明提供了一种治疗病理性血管生成相关疾病的方法，所述方法包 括将药学有效剂量的本文提供的sliRNA给药至需要这种治疗的受治者。在一些实施方式 中，这些疾病选自：老年性黄斑变性（AMD)、糖尿病视网膜病变及癌症。
[0020] 另一方面，本发明提供了一种设计sliRNA的方法，所述方法包括从病毒基因组序 列中选择高度保守区，并测试包含与高度保守区的片段具有至少80%、85%、90%、95%、 1〇〇%同源性的核苷酸序列的1?仏调节1'1^(如1'1^3)活性的能力。
[0021] 通讨引用并入本f
[0022] 如同将各单独的出版物、专利或专利申请通过引用单独并入本文中一样，本文所 提及的所有出版物、专利和专利申请均以相同的程度通过引用并入本文。
【附图说明】
[0023] 本发明的新特征由所附的权利要求书中的具体内容来阐述。为了更好地理解本发 明的特征和优点，以下将利用本发明原理通过说明书实施例和附图进行详细阐明。
[0024] 图1是巩膜_脉络膜/视网膜色素上皮细胞（RPE)铺片的荧光显微照片（放大40 倍）：绿色通道图片显示鬼笔环肽（Phalloidin)阳性的RPE细胞呈均匀一致的六边形紧密 排列（图la)，红色通道图片显示同工凝集素_B4(iB4)_阳性的血管内皮细胞（图lb)，绿 色-红色-蓝色通道的叠加图像显示出RPE、血管内皮细胞和4'，6'-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)标记的细胞核的重叠（图lc)。
[0025] 图2a为在C57BL/6J小鼠体内通过激光光凝作用诱导的CNV小鼠模型的眼球剖面 图。图右下方箭头指示光凝斑在视乳头旁。图2b为氪激光光凝后5min的眼底照片，箭头 指示光凝斑和视网膜水肿；图2c是显微镜下下观察到的巩膜-脉络膜/RPE的铺片显微照 片（放大100X)，箭头指示光凝斑在视神经旁。
[0026] 图3是用共焦激光视网膜断层扫描仪记录的显微照片：眼底荧光血管造影（FFA) 检查显示C57BL/6J小鼠在氪激光光凝后发生血管改变。光凝后7天，可在盘状荧光素渗漏 处观察到光凝斑（图3a);光凝后14天，可在荧光素渗漏处明显地观察到光凝斑（图3b) (图中箭头所指为光凝部位）。光凝后28天，在荧光渗漏处无明显光凝斑，并且出现瘢痕化 (图 3c)。
[0027]图4是在显微镜下观察到的脉络膜铺片的荧光显微照片（放大100倍）：激光诱 导的灼伤位于如图4d_f所示的环形缺损区内。在光凝后第4天，缺损区内出现一些细胞碎 片以及细胞核碎片（图4g_i)。到第7天时，在激光损伤区可以看到同工凝集素-B4染色 的CNV网。RPE细胞覆盖CNV复合体区域（图4j-l)。第14天和第28天CNV面积无明显 不同，但是与第7天的CNV面积相比明显增加。
[0028]图5是在显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光显微照片（放大100倍）。激光光凝 后第7天的样品用作对照。由荧光DAPI(蓝色）、同工凝集素-B4(红色）及鬼笔环肽（绿 色）分别标记细胞核、内皮细胞和RPE。
[0029] 图6是在显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光显微照片（放大100倍）。用5%葡萄 糖溶液处理的激光光凝后第7天的样品用作对照。由荧光DAPI(蓝色）、同工凝集素-B4 (红 色）及鬼笔环肽（绿色）分别标记细胞核、内皮细胞和RPE。
[0030]图7是在显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光显微照片（放大100倍）。用阿瓦斯 汀（Avastin)处理的激光光凝后第7天的样品用作对照。由荧光DAPI(蓝色）、同工凝集 素-B4(红色）及鬼笔环肽（绿色）分别标记细胞核、内皮细胞和RPE。
[0031] 图8是在显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光显微照片（放大100倍）。用siEv70_l 处理的激光光凝后第7天的样品用作对照。由荧光DAPI(蓝色）、同工凝集素-B4 (红色） 及鬼笔环肽（绿色）分别标记细胞核、内皮细胞和RPE。
[0032] 图9是在显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光显微照片（放大100倍）。用siEv70_2 处理的激光光凝后第7天的样品用作对照。由荧光DAPI(蓝色）、同工凝集素-B4 (红色） 及鬼笔环肽（绿色）分别标记细胞核、内皮细胞和RPE。
[0033]图10是在显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光显微照片（放大100倍）。用 siEv70_3处理的激光光凝后第7天的样品用作对照。由荧光DAPI(蓝色）、同工凝集 素-B4(红色）及鬼笔环肽（绿色）分别标记细胞核、内皮细胞和RPE。
[0034]图11是在显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光显微照片（放大100倍）。用 siEv70_4处理的激光光凝后第7天的样品用作对照。由荧光DAPI(蓝色）、同工凝集 素-B4(红色）及鬼笔环肽（绿色）分别标记细胞核、内皮细胞和RPE。
[0035]图12是在显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光显微照片（放大100倍）。用 siEv70_5处理的激光光凝后第7天的样品用作对照。由荧光DAPI(蓝色）、同工凝集 素-B4(红色）及鬼笔环肽（绿色）分别标记细胞核、内皮细胞和RPE。
[0036] 图13显示用ImageJ图像分析软件定量分析CNV的平均面积，图中显示每个处理 组均小于阴性对照组；siEv70_2处理组明显小于其它处理组。
[0037] 图14是不同处理组VEGFmRNA表达水平：激光诱导的未处理的眼内的VEGFmRNA 水平明显高于其它处理组，在处理组中，siEv70_2处理组的VEGFmRNA水平为统计学意义 上的最低水平。
[0038] 图15显示实时PCR检测不同处理组TLR3的mRNA水平：siEv70_2处理组的 TLR3mRNA水平高于对照组。其它处理组与对照组相比没有明显差异。siEv70_6(DNA:RNA 杂交体）激活TLR3能力弱于具有同样序列的dsRNA(siEV70_2)。
[0039] 图16显示实时PCR检测不同处理组IL12amRNA水平：siEv70_2处理组的IL12a mRNA水平高于对照组。其它处理组与对照组相比没有明显差异。siEv70_6(DNA:RNA杂交 体）激活IL12a能力弱于具有同样序列的dSRNA(SiEv70_2)。
[0040] 图17a和17b显示了病毒基因组的高度保守区。
[0041] 图18a是pNF-kB-TA-luc的质粒图谱。图18b是不同处理组激活的NF-kB的不 同水平。
[0042] 图19a显示在显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光显微图片（放大100X)。用 siEv70_6处理的激光光凝后第7天的样品作为对照。细胞核、内皮细胞和RPE分别用荧光 DAPI(蓝色）、同工凝集素-B4 (红色）和鬼笔环肽（绿色）标记。siEv70_6(DNA:RNA杂交 体）的CNV抑制效力弱于具有同样序列的dsRNA(siEv70_2)。图19b显示在显微镜下观察 到的脉络膜铺片荧光显微图片（放大100X)。用siEv70_7处理的激光光凝后第7天的样 品作为对照。细胞核、内皮细胞和RPE分别用荧光DAPI(蓝色）、同工凝集素-B4 (红色）和 鬼笔环肽（绿色）标记。没有观察到明显的CNV抑制。
[0043] 图20显示了经幻以￡￥70_2、8)阿瓦斯汀和〇5%葡萄糖刺激后观察到的主动脉 环内皮发芽情况。
[0044] 图21显示在显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光显微图片（放大100X)。在CNV 小鼠中评价注射siEv70_2抑制激光诱导的CNV的剂量效应关系。细胞核、内皮细胞和 RPE分别用荧光DAPI(蓝色）、同工凝集素-B4(红色）和鬼笔环肽（绿色）标记。与未 处理组（图21a-c)和阴性对照组（图21d-f)相比，siEv70_2(2yg)(图21m-〇)处理组， siEv70_2(10yg)(图21p-r)处理组和poly(I:C)阳性对照组（图21g-i)的CNV面积明显 减少。siEv70_2 (0. 2yg)处理组未观察到CNV抑制效果（图21j-1)。
[0045] 图22显示了CNV面积的盒须图。Y轴表示CNV的面积，用平方微米（ym2)表示。 每个点对应一个CNV缺损（总数为 247)，包括siEv70_2(0. 2yg)(n= 41)、siEv70_2(2yg) (n= 52)、siEv70_2 (10yg)(n= 35)、poly(I:C)(n= 39)、GS(n= 40)和未处理组（n= 40) 〇
[0046] 图23显示在显微镜下观察到的脉络膜铺片荧光显微图片（放大100倍）。在激 光诱导的CNV小鼠中评价玻璃体内注射BM01对CNV的抑制效果。细胞核、内皮细胞和RPE 分别用荧光DAPI(蓝色）、同工凝集素-B4(红色）和鬼笔环肽（绿色）标记。与未处理组 (图23&-(：)和阴性对照组（图23(1-0相比，在811〇1处理组和口〇17(1 :〇处理组（图23」-1 和图23g-i)中CNV被明显抑制。
[0047]图24显示CNV面积的盒须图。Y轴表示CNV的面积，用平方微米（ym2)表示。每 个点对应一个CNV缺损（总数为 155)，包括BM01(n= 36)、poly(I:C)(n= 39)、GS(n= 40)和未处理组（n= 40)。
【具体实施方式】
[0048] 下面参考实施例以举例说明的目的对本发明的几个方面进行描述。应当理解的 是，以下列出的许多具体细节、关系和方法用以完整理解本发明。然而，相关领域的普通技 术人员将容易地认识到，本发明可不通过具体描述中的一个或一个以上方法来实施而以其 它方法实施。另外，本发明并不限于所示的行为或事件的顺序，因为一些行为可能以不同的 顺序和/或与其它行为或事件同时出现。此外，并不要求所有示出的动作或事件均根据本 发明的方法来实施。
[0049] 本文使用的术语是用于描述特定实施方式，而无意限定本发明。除非另有明确说 明，本文所用的单数形式（"a"，"an"和"the"）也意在包括复数形式。此外，术语"包括"、 "包含"、"具有"、"有"、"带有"或同类用法用在【具体实施方式】和/或权利要求书中，这些术语 意在包括与术语"包括"类似的方式。
[0050] 术语"约"或"大约"是指由本技术领域普通技术人员所确定的特定值的可接受的 误差范围，该误差范围部分取决于该值是如何被检测或确定的，即，测量系统的限制。例如， 本领域中"大约"可意味着每次实施在1或1个以上标准偏差以内。可选地，"大约"可意味 着高达给定值的20%，优选地为高达给定值的10%，更优选地为高达给定值的5%，并且还 更优选地为高达给定值的1%。可选地，对于生物系统或过程而言，该术语可意味着在一个 数量级之内，优选地为某个值的5倍之内，更优选地为某个值的2倍之内。在本申请和权利 要求书中对具体值进行描述的条件下，除非另有说明，认为术语"约"是指在特定值的可接 受的误差范围内。
[0051]I.小配体RNA
[0052] -方面，本发明提供了与用于调节Toll样受体（TLR)的sliRNA有关的组合物和 方法，该RNA包括与病毒基因组序列的高度保守区的片段具有至少80%同源性的核苷酸序 列。
[0053] 本文所述的小配体RNA(sliRNA)是指作为TLR配体的RNA。
[0054] 术语"调节"或"调节表达"是指编码基因的核酸分子（如DNA或RNA)的量或水 平升高（刺激）或降低（抑制）。抑制通常为调节表达的优选形式，并且mRNA通常为优选 的靶核酸。
[0055]Toll样#体
[0056]Toll样受体（TLR)在识别病原体成分以及随后的激活先天免疫反应中发挥重要 作用，然后所述先天免疫反应的激活引发适应性免疫反应的产生。TLR由引起与病原相关分 子模式（PAMP)结合的大的胞外结构域、跨膜区结构域和与分子结合并启动细胞免疫反应 的细胞内Toll/白介素-1受体（TIR)结构域组成。在哺乳动物体内已鉴别出至少10种特 异性识别所有主要类别的病原体的TLR成员，在小鼠中已鉴别出11种特异性识别所有主要 类别的病原体的分子模式的TLR成员。TLR与亲水性核酸至LPS范围内的多种多样的配体 结合，而且，异源二聚作用扩大了配体范围。TLR2和TLR4识别细菌细胞成分。TLR6与TLR2 结合识别多种细菌细胞壁成分（Mariotti等人，Diversity2009, 1，7-18)。
[0057] 在一些实施方式中，Toll