控制大白菜叶数的BrGRF12基因及其应用的制作方法

本发明涉及一种控制大白菜叶数的BrGRF12基因及其应用，特别是一种促进大白菜叶数增加的BrGRF12基因及其应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术：

大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)起源于中国，是我国乃至世界性的重要蔬菜作物之一。叶数的多少是大白菜的重要农艺性状之一，其多寡直接关系到大白菜产量的高低。但到目前为止，关于大白菜叶数多少的分子调控机制仍未知。

生长调控因子(growth-regulating factors,GRFs)是植物特有的一类转录因子。它可以通过N-末端QLQ结构域与GIF(GRF-interaction factor)蛋白中的SNH结构域互作，形成功能复合体，共同参与下游基因的表达调控。GRF蛋白在植物生长发育过程中起到重要的调控作用。研究发现，在拟南芥中过量表达OsGRF1基因可明显抑制花序轴的伸长。但随后对拟南芥GRF基因的研究发现，在拟南芥中过量表达AtGRF1和AtGRF2基因可明显促进转基因植株叶片和子叶的增大，并抑制花序轴的伸长；相反，AtGRF1–AtGRF3基因功能同时缺失则可导致叶片和子叶变小，但单独突变上述任何一个基因对植株的表型都无显著影响，而同时突变上述任意两个基因时只能轻微影响植株的表型。进一步的研究发现，过量表达AtGRF2基因可促进转基因植株细胞体积的增大，而AtGRF1–AtGRF3基因功能缺失体的细胞体积则明显变小，这说明拟南芥GRF1-3基因是通过调控细胞的大小来促进或抑制器官的增大。但Kim和Lee对AtGRF4的研究表明，其在调控细胞分裂过程中具有重要作用。Horiguchi等和Vercruyssen等对AtGRF5基因的研究也发现，AtGRF5可通过维持或者促进细胞的分裂能力来促进植株器官的增大，并且过量表达AtGRF5还可促进叶绿体增殖、抑制暗处理条件下叶片的衰老。而对于AtGRF1和AtGRF3基因来说，只有同时突变掉AtGIF1基因时，Atgrf1/Atgrf3双突变体才会显著影响植株细胞的增值。另外，Horiguchi等对AtGRF9基因的研究发现，其在调控植物生长发育过程中无明显作用。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供一种控制大白菜叶数的BrGRF12基因及其应用。

一种控制大白菜叶数的BrGRF12基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

上述BrGRF12基因全长1281bp，编码426个氨基酸，在进化上，与BrGRF12基因具有较近亲缘关系的为拟南芥AtGRF9基因；二者的核苷酸序列一致性仅为78.59％，氨基酸序列一致性仅为70.09％，种间差异较大。另外，对拟南芥AtGRF9基因的研究发现，其在调控植物生长发育中无明显作用，而发明人对大白菜BrGRF12的研究则发现其在调控叶数发育中具有重要作用，并且这一功能在其他GRF基因上未见报道。

一种上述BrGRF12基因编码的调控因子，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

一种插入上述SEQ ID No.1所示核苷酸序列的重组载体。

上述BrGRF12基因、重组载体在经济作物生产改良中的应用。

根据本发明优选的，所述的经济作物为大白菜。

有益效果

本发明从大白菜中克隆了BrGRF12基因，并验证了该基因具有促进叶片数目增多的功能，经试验，通过过量表达该基因，可以获得比野生型植株叶数增多的转基因植株。本发明的基因可为培育农作物新品种提供理论依据和基因来源。

附图说明

图1为蛭石上生长40天的野生型和转基因拟南芥植株的对比照片；

图中：A、野生型和转基因植株整体表型，B、为野生型和转基因植株不同叶位叶片的分解表型。

具体实施方式

下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例

大白菜mRNA的提取

以大白菜品种福山包头10天苗龄幼苗的地上部分为材料，置于液氮预冷的研钵中，加入液氮快速磨成粉末，将100mg粉末装入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol(购自Invitrogen公司)颠倒混匀，室温静置10分钟。在4℃，12000rpm离心10分钟，取上清液移至新的1.5ml离心管中。加入200μl氯仿，用手剧烈摇晃15秒钟，室温静置2～3分钟。4℃，12000rpm离心10分钟。取无色上层水相至一新的离心管中，加入600μl～20℃冰箱预冷异丙醇，颠倒混匀，室温静置10分钟。4℃，12000rpm离心10分钟，除上清液。加入1ml 75％(v/v)乙醇，涡旋震荡。4℃，7500rpm离心3分钟。室温干燥3～5分钟，加入30μl的无RNase的水溶解沉淀，然后置于55℃水浴中溶解10分钟，迅速冰浴5分钟后瞬时离心，制得mRNA。

BrGRF12基因的获得

利用RT-PCR方法扩增BrGRF12基因的编码序列，具体操作方法如下：

将制得的mRNA反转录成第一链cDNA，所用反转录酶为Takara公司生产的M-MLV reverse transcriptase，反应体系为20μl。依次加入1μl oligo dT、2μg RNA和无RNase水至13.5μl，在70℃水浴中变性5分钟，迅速冰浴5分钟，瞬时离心，然后依次加入1μl 10mM dNTP，4μl 5×RT缓冲液，0.5μl RNase inhibitor和1μl反转录酶。混合均匀，42℃反应60分钟，70℃水浴10分钟使酶失活，制得第一链cDNA。

以第一链cDNA为模板扩增目的基因，所用引物核苷酸序列如下：

BrGRF12-F:5'-GGGGTACCTTACAAAGTAACAAGATGCAGAGC-3'(SEQ ID NO.3)

BrGRF12-R:5'-GCGTCGACTGTTTTTTTAAACACCTGAAGAAC-3'(SEQ ID NO.4)

PCR反应体系为25μl，依次加入10×PCR缓冲液2.5μl，2.5mM dNTP 2μl，第一链cDNA 2μl，10mM正向引物0.5μl，10mM反向引物0.5μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.25μl，最后加水至25μl。

PCR反应条件：预变性94℃3分钟；变性94℃30秒，退火58℃30秒，延伸72℃2分钟，30个循环；最后延伸10分钟，4℃保存。

将上述PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，加入pUC18 DNA vector中，pUC18 DNA vector由Takara公司产售，经连接反应，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞进行检测，取阳性菌株，制得连接好的载体；

上述连接体系10μl，各组分为1μl pUC18 DNA vector，2μl PCR产物，1μl T4 DNA连接酶，1μl 10×反应缓冲液，加水补至10μl；上述连接条件为：16℃水浴中反应12-16小时。

将连接好的载体进行测序，确认正确无误，经检测，BrGRF12基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，全长1281bp，编码426个氨基酸。

转基因植株的获得

将上述连接好的载体用Takara公司生产的KpnI和SalI内切酶酶切，操作如下：

反应体系50μl，包括7.5μl 10×T缓冲液，20μl连接好的载体，2μl KpnI内切酶，2μl SalI内切酶和18.5μl水；反应条件为：在37℃水浴4个小时；

将酶切后的BrGRF12基因经琼脂糖凝胶电泳后，用杭州博日科技有限公司产售的Biospin Gel Extraction Kit回收基因片段，操作如下：用干净、锋利的手术刀，将含有BrGRF12基因的琼脂糖凝胶切下，并放入1.5ml离心管中。按1:3的比例加入Extraction buffer。于50℃恒温水浴中直到凝胶融化。将混合液全部转入Spin column内，于6000rpm离心1分钟，弃去接液管内液体。向Spin column中加入500μl Extraction buffer，于12000rpm离心1分钟，弃去接液管内液体。向Spin column中加入750μl Wash Buffer，于12000rpm离心1分钟，弃去接液管内液体。再次于12000rpm离心1分钟，然后将Spin column转移至无菌的1.5ml离心管内。向Spin column中加入50μl Elution Buffer，并于室温放置1分钟。12000rpm离心1分钟，收集含有BrGRF12基因的溶液。上述详细操作可参见Biospin Gel Extraction Kit的产品使用说明书。

将上述含有BrGRF12基因的溶液中的BrGRF12基因连接入植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS(购自Biovector公司)中，操作如下：

反应体系10μl，包括1μl pCAMBIA2300-35S-OCS，5μl含有BrGRF12基因的溶液，1μl 10×T4连接酶缓冲液和1μl T4连接酶，加水至10μl；反应条件为：在16℃下连接12-16小时；

经上述反应，制得质粒DNA，然后将质粒DNA转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒进行鉴定，制得构建好的质粒DNA。

将构建好的质粒DNA转入农杆菌LBA4404(购自Biovector公司)中，操作如下：

取100μl农杆菌LBA4404细胞溶液经电击制备农杆菌感受态细胞，加入3μl构建好的质粒DNA，冰浴5分钟，液氮冷冻1分钟，37℃水浴5分钟，然后加入1ml LB培养基(1升LB培养基含：5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g氯化钠)，28℃，200rpm振荡3小时。10000rpm离心1分钟，弃上清，加入100μl LB培养基重悬细胞，涂布于含有50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平的LB平板培养基上(1升LB平板培养基含：5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g氯化钠，15g琼脂)，28℃培养2-3天，选取经转化后的农杆菌LBA4404；

通过浸花法将上述经转化后的农杆菌LBA4404转化拟南芥(Columbia ecotype)，操作如下：

将经转化后的农杆菌LBA4404接种于5ml LB培养基中，28℃，200rpm振荡过夜，按2wt％的接种量接种于200ml新鲜LB培养基中，继续培养至OD₆₀₀为1.0，4500rpm离心5分钟收集菌体，重悬于侵染液中，将拟南芥的花序浸入侵染液中30秒，把花盆侧放于托盘中，蒙上地膜避光24小时，第二天取下地膜，将花盆直立；

上述侵染液含有5wt％蔗糖，0.03wt％Tween(吐温)-20。

制备1/2MS筛选平板(1/2MS培养基加50mg/L卡那霉素，100mg/L羧苄青霉素)，T₁代种子用70％(v/v)乙醇消毒5分钟，2wt％次氯酸钠消毒10分钟后播种于1/2MS筛选平板，每板播种100μg的拟南芥种子。4℃春化3天后放于培养箱(22℃，16小时光照/8小时黑暗)中。6天后选出绿色的生长正常的阳性植株，移入蛭石中培养，单株收获T₂代种子。繁殖后获得T₃代，鉴定T₃代，获得纯合的转基因株系10株。

BrGRF12基因功能的鉴定

纯合的转基因株系和野生型拟南芥种子在4℃冰箱中春化3天，消毒后将种子播于1/2MS培养基平板。待1/2MS培养基平板上生长的幼苗的子叶完全张开后，将转基因株系和野生型幼苗转入蛭石中，然后置于培养间(22℃，16小时光照/8小时黑暗)中培养，培养40天后观察纯合的转基因株系和野生型植株的表型(结果如图1所示)。通过观察发现纯合的转基因株系叶片数目明显增多，说明BrGRF12基因的过量表达促进了叶数的增加。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 控制大白菜叶数的BrGRF12基因及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1281

<212> DNA

<213> Brassica rapa L. ssp. pekinensis

<400> 1

atgcagagcc ctaaaacaga ggaggaggat gagtggagga ggaagaagtg gccgtgtatg 60

aaagctgctc agttacaaga gtttagaatg caagctttgg tttatagata catagaagct 120

ggtgttcgcg tgcctaatca tcttgttgtc cctatttgga acagtcttgc tctctcttct 180

tcctcatcct ccggttacct tatccaccac aactatccct cctcttccaa tgcagtgttg 240

aatgataagg tggatcctga acccacaagg tgcaggagaa cagatgggaa gaaatggagg 300

tgtagcaaca aagtcctcct gtttcagaag tactgtgaac ggcacatgca tagaggccgt 360

aaacgttcaa gaaagcttgt ggaatcttct tcttcttatg acgttgcttc gtcctttgct 420

tcaaccaaac gagacaatac tgatggtctt aacagtagca ctgagagtca tagtgtttct 480

catggggcaa tgtcagtttc tagtaatgct caggttgtca ccattgcttc actgcctagt 540

gcaagagtct gtgataacat ccctcgacca tctctagtgg tcaccgagtc cacaaacaaa 600

agtgtgagaa ggaggatcac ggacatgagt tatgatgact tcatcaaaca aagaggcgcg 660

actacgtgtg ttagagggtt tcccgttcaa ggttctgaga ggttaccttc tgttcaaaag 720

ttctttcctg aggcatctga taacacctca gaagctgcaa gaatctcaag caacaggaag 780

aatgagatca ttgcaagaag cagagaatgg aagaacatga atgttaattg cggtggcttg 840

tttcctggca tccacttctc tccagacact gttcttcaag atcgtggtgg gtttggttta 900

cacagagttg aaacagacag cgaaccagga aggtgcagaa gaacagatgg aaagaagtgg 960

agatgcagca aagatgtgtt gtctggtcag aagtattgcg ataggcacat gcatagaggt 1020

agtattaaga agaagcatcc agtggaaacg actcacacac atgagaatac cgtgaaaaca 1080

gctgctagat ctgtgacttg ccaagatgga gatggccaga agctccctgt ttcagtcctg 1140

ggaagagagc agctgtccag agtttcagat gagaagaata ccactaacag ttgcagtacc 1200

gacaccacca tcactgacat agctttaaag ggtgaagaag acaatgagga ggtcttgtca 1260

ttgtgttctt caggtgttta a 1281

<210> 2

<211> 426

<212> PRT

<213> Brassica rapa L. ssp. pekinensis

<400> 2

Met Gln Ser Pro Lys Thr Glu Glu Glu Asp Glu Trp Arg Arg Lys Lys

1 5 10 15

Trp Pro Cys Met Lys Ala Ala Gln Leu Gln Glu Phe Arg Met Gln Ala

20 25 30

Leu Val Tyr Arg Tyr Ile Glu Ala Gly Val Arg Val Pro Asn His Leu

35 40 45

Val Val Pro Ile Trp Asn Ser Leu Ala Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser

50 55 60

Gly Tyr Leu Ile His His Asn Tyr Pro Ser Ser Ser Asn Ala Val Leu

65 70 75 80

Asn Asp Lys Val Asp Pro Glu Pro Thr Arg Cys Arg Arg Thr Asp Gly

85 90 95

Lys Lys Trp Arg Cys Ser Asn Lys Val Leu Leu Phe Gln Lys Tyr Cys

100 105 110

Glu Arg His Met His Arg Gly Arg Lys Arg Ser Arg Lys Leu Val Glu

115 120 125

Ser Ser Ser Ser Tyr Asp Val Ala Ser Ser Phe Ala Ser Thr Lys Arg

130 135 140

Asp Asn Thr Asp Gly Leu Asn Ser Ser Thr Glu Ser His Ser Val Ser

145 150 155 160

His Gly Ala Met Ser Val Ser Ser Asn Ala Gln Val Val Thr Ile Ala

165 170 175

Ser Leu Pro Ser Ala Arg Val Cys Asp Asn Ile Pro Arg Pro Ser Leu

180 185 190

Val Val Thr Glu Ser Thr Asn Lys Ser Val Arg Arg Arg Ile Thr Asp

195 200 205

Met Ser Tyr Asp Asp Phe Ile Lys Gln Arg Gly Ala Thr Thr Cys Val

210 215 220

Arg Gly Phe Pro Val Gln Gly Ser Glu Arg Leu Pro Ser Val Gln Lys

225 230 235 240

Phe Phe Pro Glu Ala Ser Asp Asn Thr Ser Glu Ala Ala Arg Ile Ser

245 250 255

Ser Asn Arg Lys Asn Glu Ile Ile Ala Arg Ser Arg Glu Trp Lys Asn

260 265 270

Met Asn Val Asn Cys Gly Gly Leu Phe Pro Gly Ile His Phe Ser Pro

275 280 285

Asp Thr Val Leu Gln Asp Arg Gly Gly Phe Gly Leu His Arg Val Glu

290 295 300

Thr Asp Ser Glu Pro Gly Arg Cys Arg Arg Thr Asp Gly Lys Lys Trp

305 310 315 320

Arg Cys Ser Lys Asp Val Leu Ser Gly Gln Lys Tyr Cys Asp Arg His

325 330 335

Met His Arg Gly Ser Ile Lys Lys Lys His Pro Val Glu Thr Thr His

340 345 350

Thr His Glu Asn Thr Val Lys Thr Ala Ala Arg Ser Val Thr Cys Gln

355 360 365

Asp Gly Asp Gly Gln Lys Leu Pro Val Ser Val Leu Gly Arg Glu Gln

370 375 380

Leu Ser Arg Val Ser Asp Glu Lys Asn Thr Thr Asn Ser Cys Ser Thr

385 390 395 400

Asp Thr Thr Ile Thr Asp Ile Ala Leu Lys Gly Glu Glu Asp Asn Glu

405 410 415

Glu Val Leu Ser Leu Cys Ser Ser Gly Val

420 425

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ggggtacctt acaaagtaac aagatgcaga gc 32

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gcgtcgactg tttttttaaa cacctgaaga ac 32