一种膜蛋白CD14的抗体的制备方法及应用与流程

本发明涉及重组抗体技术领域，具体涉及一种膜蛋白CD14的抗体的制备方法及应用。

背景技术：

CD14有mCD14和sCD14两种类型，是细胞表面的糖蛋白，其生物学功能主要是识别、结合LPS或LPS/LBP复合物，介导LPS所致的细胞反应，在LPS性炎症反应、内毒素休克等病理反应中起重要作用。筛选出能识别CD14分子的抗体，对研究CD14分子的功能及整个通路都具有重要作用。若能够完全封闭CD14的功能，特异性的阻断CD14与LPS及LPS/LBP复合物结合，就能够防止或中止LPS性炎症反应、内毒素休克等病理反应的发生，对于临床治疗内毒素血症、内毒素休克等也将会较好的应用前景。

噬菌体展示单链抗体将抗体可变区基因片段插入到噬菌体外壳蛋白基因中，表达的抗体可变区与噬菌体外壳蛋白融合并展示于噬菌体表面，从而实现了抗体基因表现型和基因型的联系。通过对目的抗原的淘选，从抗体库中筛选出识别目的抗原的抗体，获得的抗体基因可以用于进一步改造。

膜蛋白表达成本较高，常规的抗体制备方法，无论是单克隆抗体还是多克隆抗体，均需要制备大量的膜蛋白用于免疫和检测。用噬菌体展示的抗体库的筛选方法，只需要少量的抗原就可以完成筛选和检测。同时，由于膜蛋白本身结构的复杂性，外源表达的膜蛋白在构象上并不能完全模拟细胞表面的膜蛋白，导致用外源蛋白免疫的方法制备的抗体不能很好识别细胞表达的膜蛋白。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种膜蛋白CD14的抗体的制备方法及应用，以解决现有技术中用外源蛋白免疫的方法制备的抗体不能很好识别细胞表达的膜蛋白的技术问题。

本发明通过以下技术方案实现：一种膜蛋白CD14的抗体的制备方法，包括如下步骤：

步骤(1)：获取CD14抗体重链及轻链可变区序列：

以人外周血单核细胞(PBMC)为免疫原对小鼠进行免疫后，提取脾脏mRNA，反转录得到抗体cDNA，根据抗体可变区两端的保守序列设计特异性引物，引物序列见核苷酸序列表，分别以引物VH对和引物VL对扩增重链可变区和轻链可变区，在重链可变区的上游和轻链可变区下游分别引入双酶切位点，以linker序列为接头，通过重叠延伸PCR技术将重链可变区和轻链可变区的片段连接起来，以此为连接产物为模板，以引物scFv for和scFv back进行二次PCR，得到单链抗体scFv基因片段；对scFv基因和pCAN TAB5E噬菌粒载体进行双酶切并连接，转化大肠杆菌TG1感受态细胞中，加入M13KO7辅助噬菌体超感染后，得到噬菌体展示的抗体库；将噬菌体展示的抗体库加入CD14蛋白包被的免疫管中进行富集筛选得到鼠抗CD14抗体的重链可变区和轻链可变区序列；

步骤(2)：构建重链轻链表达载体：

以筛选得到的鼠抗CD14抗体的重链可变区和轻链可变区序列作为模板进行PCR扩增，将PCR扩增得到的带胶回收并用内切酶进行双酶切，回收目的片段，载体pFUSEss-CHIg-hG1用同样的内切酶双酶切，然后用T4DNA连接酶连接载体和目的片段，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行菌落PCR，筛选阳性单克隆菌落扩增提取得到pFUSEss_CHIg重链表达质粒和pFUSE2ss_CLIg轻链表达质粒；

步骤(3)：共转293T细胞表达CD14抗体：

将获得的pFUSEss_CHIg重链表达质粒和pFUSE2ss_CLIg轻链表达质粒质粒混合，通过PEI缓释液转染至293T细胞中，用抗性筛选含有两种质粒的细胞株293T细胞，诱导后获得含有人类抗体恒定区的膜蛋白CD14抗体。

上述技术方案中，所述步骤(1)中，linker序列为4个甘氨酸和1个丝氨酸((Gly4Ser)3)的15肽序列对应的45bp的基因序列。

上述技术方案中，所述步骤(1)中，噬菌体展示的抗体库的富集筛选的具体过程如下：将所得初级噬菌体抗体库加入CD14蛋白包被的免疫管中，于37℃下静置孵育1h，洗涤，用100mmol/L三乙胺洗脱，加入1mol/L Tris(pH8.5)进行中和,以此感染对数生长期TG1,经培养后收集菌体细胞，再次加入M13KO7辅助噬菌体进行感染，重复上述富集程序3次，挑取单菌落扩大培养，进行菌液PCR鉴定和单克隆Phage-ELISA鉴定后进行测序，得到重链和轻链可变区的序列。

上述技术方案中，所述步骤(2)中，PCR扩增具体过程如下：分别设计用于扩增重轻链可变区的引物，上游：5’-CTTGGAATTCGAGGTGAAGCTCAAGGAGTCT-3’，下游：5’-GAATCTCGAGTGTCGACACGGTGACCGTGG-3’，以筛选得到的鼠抗CD14抗体的重链可变区和轻链可变区序列作为模板，用上述引物及Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，反应条件如下：94℃预变性2min、94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s，共35个循环，最后72℃终延伸5min，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析回收纯化。

上述技术方案中，所述步骤(3)中，细胞转染的具体过程如下：转染前将293T细胞传代，保证细胞汇合度达到80％～85％，将DNA稀释液和PEI稀释液混合，静置5min后加入293T细胞中，放于37℃的二氧化碳培养箱中培养，转染48h取样检测抗体是否表达，根据检测情况确定收样时间。

本发明还提供了一种上述所述的重组CD14抗体的纯化方法，包括如下步骤：1)取亲和层析柱，先用水洗柱床，再用乙酸钠缓冲液洗涤层析柱；2)取细胞培养液，于4℃、转速12000rpm下离心10min,收集上清，用0.45μm的滤膜过滤；3)取5mL细胞培养基上清与等量的乙酸钠缓冲液混合，以0.5mL/min的速度上样，收集穿透；4)上样结束后，继续以乙酸钠缓冲冲洗至G250检测无色，用冰乙酸洗脱缓冲冲洗柱床，搜集洗脱峰，迅速用饱和碳酸钠调洗脱峰pH至中性；5)用10倍体积的超纯水洗涤层析柱，再用10mL NaCl-叠氮钠缓冲封闭层析柱，置于4℃备用；6)将洗脱峰超滤浓缩到血清等体积，装入透析袋4℃透析过夜；7)取出样品，于4℃、12000rpm下离心10min，收集上清，即为纯化后的膜蛋白CD14抗体。

本发明还提供了一种膜蛋白CD14的抗体的应用，该抗体用于识别CD14膜蛋白。

本发明的有益效果为：用细胞直接作为抗原免疫小鼠后，小鼠的免疫系统直接识别细胞表面的膜蛋白，这个天然状态的膜蛋白诱导产生的抗体能更好地识别膜蛋白，结合噬菌体展示抗体库可以高通量筛选的优点，可以细胞免疫后的抗体库中快速筛选出识别膜蛋白的抗体。

附图说明

图1为实施例1制备的重组CD14抗体的WB验证结果图；

图2为实施例1制备的重组抗体IF验证结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的详细说明。以下实施例仅是范例性的，仅用以对本发明的技术方案做更进一步的详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不偏离本发明技术方案的精神和范围内，对技术方案进行的修改或者替换均应涵盖在本发明的权利要求保护范围内。

实施例1

本实施例的一种膜蛋白CD14的抗体的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)：获取CD14抗体重链及轻链可变区序列：

以人外周血单核细胞(PBMC)为免疫原对Balb/c小鼠进行三次免疫，在取小鼠脾脏前3d加强免疫一次，测定抗血清效价，取效价高的小鼠，取脾组织提取mRNA，反转录得到抗体cDNA，根据抗体可变区两端的保守序列设计特异性引物，引物序列见核苷酸序列表，分别以引物VH对和引物VL对扩增重链可变区和轻链可变区，扩增反应条件如下：94℃预变性5min，94℃45s，58℃1min，72℃45s，共进行30个循环，72℃延伸10min；在设计引物时分别在重链可变区的下游引物序列和轻链可变区的上游引物序列引入linker序列，Linker是重复三次排列组合的4个甘氨酸和1个丝氨酸((Gly4Ser)3)的15肽序列对应的45bp的基因序列，详见核苷酸序列表，在重链可变区的上游和轻链可变区下游分别引入酶切位点SfiⅠ和NotⅠ酶切位点，以linker序列为接头，通过重叠延伸SOE-PCR技术将重链可变区和轻链可变区的片段连接起来，PCR反应如下:首先在常规PCR反应体系(50μL)中加入等摩尔VL、VH基因,94℃预变性5min，94℃45s，68℃1min，72℃45s，共进行10个循环，72℃延伸10min；以此连接产物为模板，以引物scFv for和scFv back进行二次PCR，第二次PCR扩增反应如下：94℃预变性5min，94℃45s，60℃1min，72℃45s，共进行30个循环，最后72℃延伸10min，得到单链抗体scFv基因片段；对scFv基因和pCAN TAB5E噬菌粒载体进行SfiⅠ、NotⅠ双酶切并连接，转化大肠杆菌TG1感受态细胞中并涂板，37℃过夜培养后进行菌落计数，估算库容量；将剩余转化菌液扩大培养，加入M13KO7辅助噬菌体37℃静置感染30min后，离心沉淀菌体细胞，用2×YT-AK培养基重悬，37℃震荡培养过夜，离心取上清液，加入PEG/NaCl冰浴1h，离心并重悬沉淀，经0.45μm滤膜过滤后即得到噬菌体展示的抗体库；将所得噬菌体展示的抗体库加入CD14蛋白包被的免疫管中，于37℃下静置孵育1h，洗涤，用100mmol/L三乙胺洗脱，加入1mol/L Tris(pH8.5)进行中和,以此感染对数生长期TG1,经培养后收集菌体细胞，再次加入M13KO7辅助噬菌体进行感染，重复上述富集程序3次，挑取单菌落扩大培养，进行菌液PCR鉴定和单克隆Phage-ELISA鉴定后进行测序，得到鼠抗CD14抗体的重链可变区和轻链可变区序列；

步骤(2)：构建重链轻链表达载体：

以筛选得到的鼠抗CD14抗体的重链可变区和轻链可变区序列作为模板进行PCR扩增，PCR扩增如下：分别设计用于扩增重轻链可变区的引物，上游：5’-CTTGGAATTC_{GAGGTGAAGCTCAAGGAGTCT}-3’，下游：5’-GAATCTCGAGTGTCGACACGGTGACCGTGG-3’(下划线分别为EcoRI和XhoI酶切位点)，以筛选得到的鼠抗CD14抗体的重链可变区和轻链可变区序列作为模板，用上述引物及Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，反应条件如下：94℃预变性2min、94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s，共35个循环，最后72℃终延伸5min，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析回收纯化；

将PCR扩增得到的带胶回收并用内切酶内切酶AgeI和NcoI进行双酶切37℃过夜，回收目的片段，载体pFUSEss-CHIg-hG1用同样的内切酶双酶切37℃过夜，然后用T4DNA连接酶连接载体和目的片段，16℃下过夜，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，转化液涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，次日随机挑取8个平板上单克隆菌落进行菌落PCR，筛选阳性单克隆菌落扩增提取得到pFUSEss_CHIg重链表达质粒和pFUSE2ss_CLIg轻链表达质粒；

步骤(3)：共转293T细胞表达CD14抗体：

将获得的pFUSEss_CHIg重链表达质粒和pFUSE2ss_CLIg轻链表达质粒质粒混合，通过PEI缓释液转染至293T细胞中，转染前将293T细胞传代，保证细胞汇合度达到80％～85％，将DNA稀释液和PEI稀释液混合，静置5min后加入293T细胞中，放于37℃的二氧化碳培养箱中培养，转染48h取样检测抗体是否表达，根据检测情况确定收样时间；用抗性筛选含有两种质粒的细胞株293T细胞，诱导后获得含有人类抗体恒定区的膜蛋白CD14抗体P1A8。

表1核苷酸序列表

注:＊VH for中含SfiⅠ酶切位点,VL back中含NotⅠ酶切位点；序列中简并碱基符号为W＝A/T；S＝G/C；M＝A/C；R＝A/G

实施例2

一种实施例1制得的重组CD14抗体的纯化方法，包括如下步骤：

1)取亲和层析柱，先用水洗柱床，再用乙酸钠缓冲液洗涤层析柱；

2)取细胞培养液，于4℃、转速12000rpm下离心10min,收集上清，用0.45μm的滤膜过滤；3)取5mL细胞培养基上清与等量的乙酸钠缓冲液混合，以0.5mL/min的速度上样，收集穿透；4)上样结束后，继续以乙酸钠缓冲冲洗至G250检测无色，用冰乙酸洗脱缓冲冲洗柱床，搜集洗脱峰，迅速用饱和碳酸钠调洗脱峰pH至中性；5)

用10倍体积的超纯水洗涤层析柱，再用10mL NaCl-叠氮钠缓冲封闭层析柱，置于4℃备用；6)将洗脱峰超滤浓缩到血清等体积，装入透析袋4℃透析过夜；7)取出样品，于4℃、12000rpm下离心10min，收集上清，即为纯化后的膜蛋白CD14抗体，取出4μL抗体，用SDS-PAGE检测抗体的纯化，用Nanodrop测定抗体的浓度。

1、用Western blot方法检测实施例1筛选出来的抗体P1A8

1)样品制备，取THP-1细胞，去掉培养基后用PBS进行清洗，加入500微升上述RIPA蛋白抽提液裂解细胞，取上清；

2)取匀浆液加入等体积2×上样缓冲液混匀，煮沸8分钟后上样，进行10％SDS-PAGE电泳分离蛋白，恒定电压140伏，电泳至溴酚蓝染料快到玻璃板边缘时；

3)将变性分离蛋白条带电转移到硝酸纤维素膜(NC膜，美国Millipore产品)上，恒定电流100毫安，持续时间1小时；

4)取出NC膜，用4％PBSM封闭1h，PBS洗三次后，加入用4％PBSM稀释100倍后的本发明的可溶性单链抗体P1A8溶液，37℃保温孵育1小时；

BST和PBS分别洗膜三次，10分钟/次，加入PBSM稀释(1:5000)的HRP/E tag conjugate抗体，37℃保温孵育1小时；

6)PBST和PBS分别洗膜三次，10分钟/次，加入超敏ECL化学发光底物，显色拍照。

结果如图1所示，实施例1的P1A8抗体可以从THP-1细胞裂解液中特异性识别CD14蛋白。

2、用免疫荧光检测实施例1筛选出来的抗体P1A8

1)使用交联剂，4％预冷的多聚甲醛覆盖细胞，室温固定15分钟，避光；

2)吸去多聚甲醛后，用PBS洗4遍，每次3分钟；

3)10％正常非免疫山羊血清(PBS稀释)室温封闭30分钟；

4)配制一抗：用5％正常山羊血清稀释一抗(P1A8)，至终浓度为0.1ug/ul；

5)加入一抗液覆盖细胞，4℃孵育过夜，避光；

6)取出细胞复温至室温，用PBS洗4遍，每次3分钟；

7)配制荧光标记二抗：用5％正常山羊血清稀释二抗，稀释比例为1:300；

8)加入二抗，室温孵育45分钟(避光)；

9)吸去多余二抗，PBS洗4遍，每次3分钟；

10)配制DAPI液：用PBS稀释DAPI原液，稀释比例为1:100；

11)加入DAPI染液覆盖细胞，染色1分钟；

结果如图2所示，本发明的P1A8抗体可以检测HepG2细胞细胞表面的CD14蛋白。

<110> 武汉金开瑞生物工程有限公司

华, 权高

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<170> PatentIn version 3.5

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<212> PRT

<213> Mus musculus

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20 25 30

Asn Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu

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Trp Ile Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu

50 55 60

Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr

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Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

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