蝎神经毒素AaIT及其编码基因与应用的制作方法

本发明涉及利用生物技术领域，具体涉及一种蝎神经毒素AaIT及其编码基因与应用。

背景技术：

昆虫神经毒素是一类只作用于昆虫神经系统，有毒杀作用的多肽类神经毒素，主要来自于蝎，其次来自蜘蛛。这类对昆虫有专一毒杀作用的毒素的作用位点是各种离子通道，具有高效昆虫专一性的神经毒素主要是作用于钠离子通道的长链神经毒素，这类长链神经毒素一般由60-70个氨基酸组成，有2-4对链内二硫键。不同种属来源的神经毒素在氨基酸的组成上没有明显的保守性，而同种来源神经毒素在一级结构上具有很高的保守性。AaIT是由Tal Arnon从蝎子Androctonus australis的毒液中分离到的一种对昆虫具有高度选择性的作用于钠离子通道的α-型昆虫神经毒素，该成熟神经毒素由64个氨基酸残基组成，对农业害虫具有很强的毒杀作用，天然毒素对蝗虫的半数瘫痪剂量(PD₅₀)为50ng/g体重，因此该毒素具有重要抗虫价值。

现有技术中将昆虫神经毒素构建表达载体，然后转化到E.coli BL21(DE3)进行表达，但得到的都是无活性的包涵体，通过在体外合适的条件下进行溶解、变性、复性和纯化，从每升培养基仅能得到微量的可溶性蛋白质，生产量低；也存在将构建的表达载体在酵母中表达的方法，但其表达量低且分离纯化困难。目前，还没有通过改造AaIT的DNA序列且优化AaIT表达纯化方法来高效生产AaIT重组蛋白的方式，极大影响了AaIT在抗虫中的应用，因此需开发出一种可以降低成本、实现大量生产且具有生物活性的昆虫神经毒素AaIT的方法。

技术实现要素：

针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种蝎神经毒素AaIT及其编码基因。

本发明提供基因，为编码蝎神经毒素AaIT类蛋白的基因，为如下(1)-(3)中任一一种的DNA分子：

(1)由序列表中序列1所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有毒杀昆虫活性的蛋白的DNA分子；

(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有毒杀昆虫活性的蛋白的DNA分子。

严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次。

其中，序列表中的序列1由210个脱氧核苷酸组成，本序列为成熟AaIT蛋白的全长cDNA的读码框，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质。

由上述序列表中的序列1编码得到的蛋白属于本发明的保护范围。

本发明提供蛋白，是如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有毒杀昆虫活性的由序列2衍生的蛋白质。

其中，序列表中的序列2由70个氨基酸残基组成，其编码基因的读码框包含210个核苷酸。

一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

含有上述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

重组载体具体为将上述基因插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。重组载体具体优选为将上述基因插入表达载体pET32的BamH I和Hind III酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。

扩增基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。

上述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列3(GCGGATCCAAGAAGAACGGTTACGCTG)，引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列4(GCAAGCTTTTAGTTGATGATAGTGGTGTC)，利用序列3和序列4的引物扩增的目标基因同样可以进行相关的酶切和连接操作。

本发明的第二个目的是提供一种制备蛋白的方法，包括步骤：将基因的重组表达载体导入宿主细胞，宿主细胞优选为大肠杆菌，用于构建重组表达载体的原始载体优选为pET32载体。

还包括纯化蛋白的步骤：将表达得到的融合蛋白用肠激酶切割，然后在pH值为6.0～6.2的条件下透析，将透析后的物质用CM阳离子柱吸附，然后用NaCl溶液漂洗并洗脱。

根据上述的制备蛋白的方法制备得到的纯化后的蛋白也属于本发明的保护范围。

制备蛋白的优选方法具体包括：

S1：优化基因、构建原核表达载体及转化：人工合成经优化的成熟蝎昆虫神经毒素AaIT基因，并连接至表达载体pET32中，得到重组表达载体pET32/AaIT，将重组载体pET32/AaIT转化到大肠杆菌TOP10菌株中，再从TOP10中提取重组载体pET32/AaIT；用热激法将重组载体pET32/AaIT转入到宿主细胞大肠杆菌表达菌株中，用含有Amp抗性的LB平板筛选得到包含有重组载体pET32/AaIT的大肠杆菌表达菌株转化子；

S2：可溶性Trx-AaIT融合蛋白的表达与提取：将步骤S1所得的包含有重组载体pET32/AaIT的大肠杆菌表达菌株转化子在37℃的LB液体培养基中培养至OD₆₀₀为0.5～0.6时，加入浓度为0.1～0.5mM的IPTG，于16℃～25℃诱导6～10小时，然后超声破碎，离心取上清液，得到重组的可溶性融合蛋白Trx-AaIT；

S3：Trx-AaIT融合蛋白的纯化：利用镍亲合层析柱对Trx-AaIT融合蛋白进行纯化，先用含50mM～100mM咪唑的pH 8.0Tris-HCl溶液漂洗亲合层析柱，然后用含100mM～200mM咪唑的pH 8.0Tris-HCl溶液将融合蛋白洗脱下来，即可得纯度在90％以上的Trx-AaIT融合蛋白；

S4：Trx标签的切割及重组AaIT蛋白的纯化：将Trx-AaIT融合蛋白用肠激酶切割，然后在pH值为6.0～6.2的条件下透析，经CM阳离子柱吸附后用20mM NaCl溶液漂洗杂蛋白，再用100mM NaCl溶液洗脱，便可得到纯度在95％以上的AaIT重组蛋白。

上述蛋白、上述基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在抗虫领域中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的第三个目的是提供一种培育转基因植物的方法，是将上述蛋白的编码基因导入到目的植物中，得到转基因植物，转基因植物的抗虫性高于目的植物。

上述转基因植物理解为不仅包含将基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。将基因导入目的植物，会使蛋白质目的植物中合成，进而是目的植物的抗虫性能得到改良。

本发明还提供一种培育转基因病毒的方法，是将上述蛋白的编码基因转入到目的病毒中，得到转基因病毒，转基因病毒的抗虫性高于目的病毒，目的病毒优选为杆状病毒、核型多角体病素和质型多角体病毒中的一种。

本发明提供的技术方案具有以下优点：一是利用pET32载体和大肠杆菌表达菌株，实现了表达产物与增溶因子Trx融合，得到大量可溶形式的Trx-AaIT融合蛋白；二是在本发明的表达系统内，Trx-AaIT融合蛋白可按适当的方式折叠，并保持天然构象；三是摸索出一条有效纯化活性重组Trx-AaIT、快速切割Trx并进一步纯化得到无任何标签的AaIT重组蛋白得方法；四是通过大肠杆菌表达得到的AaIT蛋白的生物活性得到了显著的提高。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例中的pET32/AaIT载体构建示意图。

图2为本发明实施例中含有优化前AaIT的pET28、pET30和pET32重组载体表达的目标蛋白的SDS－PAGE检测结果图。

图3为本发明实施例中的含有优化后AaIT的pET28、pET30和pET32重组载体表达的目标蛋白的SDS－PAGE检测结果图。

图4为本发明实施例中的包含优化后基因的pET32/AaIT载体的大肠杆菌表达得到的可溶性Trx-AaIT融合蛋白的SDS－PAGE检测结果图。

图5为本发明实施例中的纯化前Trx-AaIT融合蛋白和用包括不同浓度的咪唑的缓冲液C纯化得到的Trx-AaIT融合蛋白的SDS－PAGE检测结果图。

图6为本发明实施例中的Trx-AaIT融合蛋白在不同酶切时间酶切得到的蛋白的SDS－PAGE检测结果图。

图7为本发明实施例中的rAaIT重组蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图8为本发明实施例中的注射rAaIT重组蛋白组和PBS对照组的各2只家蚕在注射10分钟后表现的症状特征图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

本发明选用大肠杆菌表达菌、载体扩增菌株TOP10和表达载体pET32均购自美国Invritrogen公司。

本发明中的引物具体序列如序列表中的序列3和序列4所示。

所用培养基配方如下：

1)LB液体培养基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌，室温保存；

2)LB/Amp平板：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，琼脂粉15g，高压灭菌后，冷却至70℃以下，加入1mL浓度为100mg/ml的氨苄青霉素(Ampicillin)，充分混均后倒板，4℃避光保存；

3)LB/Amp培养基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌后，冷却至70℃以下，加入1mL Ampicillin(100mg/ml)，充分混均，4℃保存；LB液体培养基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌，室温保存。

4)50×TAE琼脂糖凝胶电泳缓冲液：Tris碱121g，冰乙酸28.6mL，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)50mL，加蒸馏水定容至500mL，室温保存；

5)50mg/mL氨苄青霉素保存液：氨苄青霉素0.5g，加蒸馏水溶解并定容至10mL，分装后于-20℃保存；

6)5×SDS-PAGE上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH 6.8)1.25mL，SDS 0.5g，BPB 25mg，甘油2.5mL，加去离子水溶解后定容至5mL，分装(约500μL每份)后于室温保存，使用每份加入25μLβ-巯基乙醇混匀；

7)5×SDS-PAGE电泳缓冲液：Tris 15.1g，甘氨酸94g，SDS 5.0g，加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解后定容至1L，室温保存；

8)考马斯亮蓝R-250染色液：考马斯亮蓝R-250 0.25g，加入225mL甲醇、46mL的冰乙酸、225mL去离子水并搅拌均匀，滤纸去除颗粒物质后，室温保存；

9)考马斯亮蓝脱色液：冰乙酸50mL，甲醇150mL，去离子水300mL，充分混合后，室温保存。

实施例一

本实施例提供了一种优化的人工合成的AaIT基因，具体序列如序列表中的序列1所示，该基因所对应的蛋白质序列如序列表中的序列2所示。本实施例的优化前的序列是根据NCBI数据库提供的DNA序列，是合成AaIT神经毒素的天然DNA，根据大肠杆菌表达的特点，优化并合成优化后的DNA。优化后的DNA序列与AaIT的天然多核苷酸(GenBank登录号M27706)相比几乎没有同源性。

将上述优化前后的基因连接到大肠杆菌表达载体pET28、pET30及pET32中并获得重组载体，以上经测序验证的重组载体分别热激转化到大肠杆菌表达菌株的感受态细胞，涂布对应的抗性LB平板，37℃恒温培养箱中培养12小时，筛选转化子，其中pET32/AaIT载体构建如图1所示，图1为本发明实施例中的pET32/AaIT载体构建示意图。

利用含未经优化的天然AaIT基因序列的pET28、pET30及pET32重组载体为表达载体，其对应的表达菌转化子经0.5mM的IPTG在16℃、25℃及37℃下诱导均未检测到目标蛋白的表达，其菌体总蛋白SDS－PAGE结果如图2所示，图2为本发明实施例中含有优化前AaIT的pET28、pET30和pET32重组载体表达的目标蛋白的SDS－PAGE检测结果图。利用含优化后的AaIT基因序列的pET28、pET30及pET32重组载体为表达载体，其对应的表达菌转化子经0.5mM的IPTG在16℃、25℃及37℃下诱导，其中以pET28和pET30为重组表达载体的转化子未检测到目标蛋白的表达，以pET32为表达载体检测到目标蛋白的表达，其菌体总蛋白SDS－PAGE结果如图3所示，图3为本发明实施例中的含有优化后AaIT的pET28、pET30和pET32重组载体表达的目标蛋白的SDS－PAGE检测结果图，AaIT蛋白分子量为8kDa，pET32载体在目标蛋白的N－端融合了一个大小为17kDa左右的Trx片段，Trx-AaIT大小为25kDa左右，表达的目标蛋白如箭头所示。

实施例二

本实施例提供一种制备蛋白的方法，具体包括如下步骤：

S1：优化基因、构建原核表达载体及转化：人工合成经优化的成熟蝎昆虫神经毒素AaIT基因，并连接至表达载体pET32中，得到重组表达载体pET32/AaIT，载体构建如图1所示。主要的载体构建步骤如下：

(1)用BamH I和Hind III双酶切重组载体PCP/pUC，获得目的片断PCP，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：

(2)用BamH I和Hind III双酶切pET32，获得载体片断，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：

(3)将步骤(1)和(2)得到的目的片断和载体片断用DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行。

(4)将步骤(3)回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶(购自大连TAKARA公司)进行连接反应，目的基因准确插入到表达载体读码框内，反应体系如下：

将重组载体pET32/AaIT转化到大肠杆菌TOP10菌株中，再从TOP10中提取重组载体pET32/AaIT；用热激法将重组载体pET32/AaIT转入到宿主细胞大肠杆菌表达菌株中，用含有Amp抗性的LB平板筛选得到包含有重组载体pET32/AaIT的大肠杆菌表达菌株转化子。

S2：可溶性Trx-AaIT融合蛋白的表达与提取：将包含优化后基因的pET32/AaIT载体的大肠杆菌重组转化子在37℃的液体LB培养基中培养至OD₆₀₀为0.6，然后分别加入浓度为0、0.1mM、0.5mM和1.0mM的IPTG，分别在16℃、25℃和37℃诱导6小时，诱导后收集的菌体超声破碎，破碎功率300W，破碎5s，间隙9s，循环90次后，离心取上清液，得到重组的可溶性融合蛋白Trx-AaIT。

S3：Trx-AaIT融合蛋白的纯化：经扩大培养和在16℃下用0.1mM IPTG诱导8小时，收集经IPTG诱导表达后后的表达菌的菌体，将菌体重悬于50ml的缓冲液A(含50mM Tris-HCl，300mM NaCl，20mM咪唑和1mM蛋白酶抑制剂PMSF，pH 8.0)中，然后用超声破碎仪进行破碎，破碎功率300W，破碎5s，间隙9s，循环90次；将破碎后的菌液在4℃下，30000g离心15min；将离心所得到的上清液加入到经缓冲液A预平衡的镍亲合层析柱中；用100ml缓冲液B(含50mM Tris-HCl，300mM NaCl，20mM咪唑和0.5-1.0％Triton X-114，pH 8.0，先于冰浴上预冷至0℃-4℃)漂洗蛋白纯化柱子后，分别加入包括浓度为50mM、100mM、200mM、300mM和400mM咪唑的缓冲液C(含50mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH 8.0)，将蛋白洗脱下来，即可得纯度在90％以上的Trx-AaIT融合蛋白。

S4：Trx标签的切割及重组AaIT蛋白的纯化：取1mg Trx-AaIT融合蛋白，加入1U的重组小牛肠激酶，于25℃下进行酶切，每2小时取样，至酶切12小时。酶切完成后，将蛋白质样品在pH6.0的30mM Tris-HCl下透析，经CM阳离子柱吸附后用20mM NaCl漂洗杂蛋白，100mM的NaCl洗脱便可得到纯度在95％以上的rAaIT蛋白。

需要说明的是，在步骤S2得到的上清液中加入SDS-PAGE样品缓冲液，对其可溶蛋白进行分析。在16℃、25℃和37℃温度下IPTG的浓度为0.1mM、0.5mM和1.0mM时，都可以得到可溶性Trx-AaIT融合蛋白，具体结果如图4所示，图4为本发明实施例中的包含优化后基因的pET32/AaIT载体的大肠杆菌表达得到的可溶性Trx-AaIT融合蛋白的SDS－PAGE检测结果图。其中，在16℃时，在供试浓度范围内，可溶性Trx-AaIT均可高水平表达；在25℃时，在IPTG的浓度为0.1mM-0.5mM时都有高水平的可溶性Trx-AaIT表达。为节约成本，缩短生产周期，我们优选采用诱导温度16℃-25℃，0.1mM～0.5mM的IPTG进行诱导表达。

对于步骤S3，结果显示利用包括100mM～200mM的咪唑缓冲液C洗脱可以得到纯度达90％的重组蛋白，融合蛋白的分子量约为25kDa，表达产物可溶性Trx-AaIT的纯化过程的优化如图5所示，图5为本发明实施例中的纯化前Trx-AaIT融合蛋白和用包括不同浓度的咪唑的缓冲液C纯化得到的Trx-AaIT融合蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

对于步骤S4，用SDS-PAGE分析酶切效果，结果如图6所示，图6为本发明实施例中的Trx-AaIT融合蛋白在不同酶切时间酶切得到的蛋白的SDS-PAGE检测结果图，目标蛋白如箭头所示。经2小时酶切即可获得大量经切割的rAaIT蛋白，考虑到生产成本，在实际生产中优先选择用肠激酶切割6小时到10小时。rAaIT重组蛋白的SDS-PAGE检测结果如图7所示，目标蛋白如箭头所示。

对比例

人工合成并优化蝎神经毒素AaIT天然DNA，在该基因的5′-端添加金龟子绿僵菌基因MCL1，并克隆入pBarPc的Sma I酶切位点得到质粒pMcl 1prAaIT，经SwaI酶切、线性化后使用真菌原生质体的方法进行金龟子绿僵菌菌株ARSEF 549转化，筛选获得遗传稳定的转化子AaIT-549，转化子AaIT-549在昆虫血液离体培养表达，并纯化得到AaIT蛋白。

通过本实施例提供的技术方案制备的目的蛋白AaIT的表达量显著提高，对于步骤S3经20mM Tris-HCl透析后的Trx-AaIT融合蛋白，1L诱导表达的菌液可纯化得到50mg的Trx-AaIT融合蛋白，纯度超过90％；对于步骤S4经过Trx标签的切割及重组AaIT蛋白的纯化，每升大肠杆菌培养液可纯化得到5mg的纯度在95％以上的rAaIT重组蛋白。而对比例中，从1L的培养液中仅可以得到纯度在50％的蛋白2.4mg，并且对比例需要利用昆虫血液离体培养，生产成本高。

将对比例纯化得到AaIT蛋白(A组)、上述步骤S3得到的纯化后Trx-AaIT融合蛋白(B组)和上述步骤S4得到的纯化后的重组蛋白rAaIT(C组)进行生物学活性分析，具体分析方法和结果如下。

实验方法：利用PBS将对比例纯化得到AaIT蛋白(A组)、纯化的Trx-AaIT融合蛋白(B组)和纯化的rAaIT蛋白(C组)分别稀释至2mg/ml，按10μg/g体重注射5龄家蚕各20只，同时以注射相同体积PBS(D组)的家蚕作为对照，观察家蚕的中毒死亡症状。

实验结果：结果发现，注射对比例纯化得到AaIT蛋白的家蚕(A组)表现出神经系统中毒症状，并在24小时内70％死亡，注射纯化的Trx-AaIT融合蛋白的家蚕未表现出神经系统中毒的症状，而注射相同体积PBS的对照组家蚕也无一出现中毒症状；注射rAaIT(C组)的家蚕表现出强烈的神经系统中毒症状，并在24小时内100％死亡。其中注射rAaIT和PBS对照的各2只家蚕在注射10分钟所表现的症状特征如图8所示，图8为本发明实施例中的注射rAaIT重组蛋白组和PBS对照组的各2只家蚕在注射10分钟后表现的症状特征图。生物学活性检测结果表明，本发明技术方案制备得到的rAaIT蛋白具有很强的生物活性。具体结果如下表1所示：

表1 A、B、C和D组生物学活性分析结果(n＝3)

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，而并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。