专利名称：白菜雄性育性相关基因BcPW1及其分离方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体地说，本发明涉及白菜雄性育性相关基因 万c尸W及其分离方法。
背景技术：
植物雄性不育是指两性花植物的花粉花药异常导致花粉功能丧失的现象， 在被子植物中普遍存在。利用植物雄性不育特性来选育雄性不育系是作物杂种 优势利用中简化制种程序、降低制种成本的重要手段。植物雄性不育产生的机 理极其复杂，至今仍不清楚。从发育分子生物学角度看，花粉败育是植物雄性 不育发生的表型体现。而花粉发育是一个多步骤复杂的过程，涉及众多基因的 表达调控。随着实验方法的不断改进，近年来已经分离鉴定了众多花粉表达基 因(Becker et a7. ， 2003; Lee and Lee' 2003; Honys and Twell， 2003, 2004: Pina W s人2005)。然而，在日渐累积的已鉴别的花粉表达基因中，大部分是 功能未知的。例如在已经精确定位的模式植物拟南芥的30 OOO个基因中，有50% 为功能未知，尽管其中任何一个都可能和与某个农艺学性状相关(Parkin 2005)，但功能未知即阻碍了其在生产中的应用。花粉中这些未知功能的基因可 能编码新的在花粉和花药发育中起作用的蛋白质。因此，对这些新基因进行进 一步研究，不仅将丰富对花粉发育相关基因的认识，有助于深入理解花粉发育 及雄性不育产生的分子机理，同时也为农业生产中利用基因工程进行育种实 践奠定了基础。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种白菜雄性育性相关基因 ^:尸f7及其分离方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的 一种白菜雄性育性相关基因"c/T厶它包含SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。
进一步地，所述核苷酸序列还包括在SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列中添 加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。
一种权利要求1所述的白菜雄性育性相关基因万c尸W的分离方法，包括以
下步骤
(1) Be-A17T17片段的分离用A17/T17引物对白菜a力fi^ 7ca力97-W^5'的不育株系与可育株系花蕾基因表达差异进行cDNA-AFLP分析，检测 到在可育株系花蕾中特异表达的基因条带Be-A7T17,用手术刀片割下聚丙烯 酰胺凝胶上的差异片段，溶于100化TE，并作为模板进行PCR扩增，条件与 cDNA-AFLP中的预扩增相同；PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳，经凝胶回收试 剂盒纯化；回收产物连接到pGEM-T Easy Vector (Promega)并转化到A co" DH5a感受态细胞，经蓝白斑筛选重组质粒，测序，最后RT-PCR验证得到该
条带的核苷酸序列；
(2) Be-A17T17片段相关的基因的cDNA的3，末端和5，末端扩增根 据双链cDNA合成试剂盒中接头及引物特征设计3' RACE和5' RACE锚定引物 P3和P5;根据差异片段Be-A17T17设计正向特异引物Sl和反向特异引物Al， 正向特异引物SI与锚定引物P3扩增3'末端，反向特异引物Al与锚定引物 P5扩增5'末端；锚定引物P5的序列为5， -MGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，； 锚定引物P3的序列为5， -GAGGCGGCCGACATGTTTTT-3，；正向特异引物Sl序 列为5， -GTTCTACTTCTACATCAGACTCC-3，；反向特异引物Al序列为5， -TTACTAGTTTGCCMCTTGGTGMG-3， ； PCR产物经DNA凝胶回收试剂盒回收，插入 pGEM-T Easy载体，转化DH 5 a感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，碱裂解法 抽提质粒，酶切鉴定后，重组质粒送上海博亚生物技术有限公司测序，得到 Be-A17T17片段相关的基因的cDNA的3'末端和5'末端；
(3) ^7,W基因的全长克隆根据两端拼接的cDNA全长序列设计特异 引物Tl和T2，所述Tl序列为5， -GCGTCTAGAGAGGTCATTCAATTC-3，，和T2 序列为5' -A TAGGATCCATAGGTCGGTCAATA-3';常规PCR方法再次从花蕾cDNA 中扩增Bc-A17T17片段相关基因的cDNA序列；用同一特异引物对在基因组DNA 中扩增得到其DNA序列SEQ ID No. 2。
本发明的有益效果是本发明采用cDNA-AFLP技术对 <矮脚黄'白菜核不 育两用系的不育株系与可育株系花蕾基因表达差异进行分析，同时配合RACE 技术分离获得与花粉壁发育相关基因^c/T厶为进一步弄清不育株系花粉败育的原因，以及阐明植物花粉发育和雄性不育发生的分子机制提供研究基础， 进而为人工创建不育材料、培育优良品种提供物质条件。
图1白菜5c/T7 cDNA和DNA全长序列的扩增电泳图； 图2白菜BcPWl氨基酸序列结构域分析示意图； 图3白菜"c/^7表达的原位杂交分析观察图； 图4万cPW RNAi表达载体示意图5通过农杆菌介导法获得转^C尸訂干涉基因菜心植株观察图6转5c尸/ 7干涉基因菜心的X-Gluc组织化学染色检测图； 图7 Northern杂交检测在转基因菜心植株中的表达电泳图； 图8转干涉基因菜心^^-力c/w7的花粉离体萌发观察图； 图9转万c/T7干涉基因菜心^9-的花粉扫描电镜观察图。
具体实施例方式
本发明通过基因表达差异分析从白菜W/^/5" Wcw:^/-^^/^的可育株 系花蕾中分离得到一个可育花蕾特异表达的基因^c/^厶序列比对表明该基因 为一个新的功能未知基因。原位杂交表明，万c/T7在小孢子及绒毡层细胞中表达。 通过RNA干涉(RNAi)技术，将^c/^的干涉基因片段导入正常可育的白菜细 胞，验证了该基因的功能。在内源及，/^的表达受阻断的转基因植株中，花粉 的正常萌发受到严重影响，75%左右的花粉不能正常萌发，约15.6%的花粉能长 出花粉管，但花粉管长到一定长度时顶端爆裂，正常萌发率只有10.5%。根据 ^:/^7预测蛋白质的结构特征及其在早期绒毡层细胞和小孢子中共表达的特点， 认为其可能作用于细胞壁发育过程中绒毡层与花粉的信号传递过程。的克 隆和功能鉴定，有助于阐明花粉发育和植物雄性不育产生的分子机理，对生产 上人为控制植物育性，利用基因工程手段培育优良品种具有重要的实践意义。 实现本发明的具体技术步骤如下 1.白菜&/￥/基因的分离和序列分析
利用cDNA-AFLP技术分析白菜Wca力P7-^M/5'的不育株系与可 育株系花蕾基因表达差异，筛选到A17/T17引物扩增得到的在可育株系花蕾中特异表达的基因片段Bc-A17T17，长259 bp，具体序列见SEQ ID No. 1。通 过RACE技术扩增得到该片段相关基因的cDNA的5'末端(图1A泳道l)和3， 末端(图1A泳道2)，并经克隆酶切鉴定(图1B泳道1、 2分别为3， RACE产 物和单克隆酶切鉴定，泳道3、 4分别为5' RACE产物和单克隆酶切鉴定)。根 据两端拼接的cDNA全长序列设计引物，常规PCR方法扩增Bc-A17T17片段相 关基因的cDNA序列(图1C泳道1)及其DNA序列(图1C泳道4)，经克隆和 酶切鉴定(图1C泳道2、 3为cDNA不同单克隆酶切鉴定结果，泳道5为DNA 单克隆酶切鉴定结果)，测序结果表明cDNA全长1 609 bp， DNA序列全长2 021 bp，命名为j c/T厶具体序列见SEQIDNo. 2。利用生物信息学软件分析5c尸訂， 发现该基因包含3个内含子和4个外显子，最大开放阅读框为l 305 bp，编码 434个氨基酸。推导的氨基酸序列具有可能与细胞增殖、分化和程序性细胞死 亡(PCD)相关的蛋白激酶C磷酸化位点(图2标注5)，参与调控信号转导 相关的蛋白激酶的酪氨酸磷酸化位点(图2标注6)，及其它与细胞内信号转 导、蛋白定位以及黏附等过程有关的位点(图2标注广4分别为氨基化合物 位点；N-糖基化位点；酪蛋白激酶II磷酸化位点；N-豆蔻酰化位点)。通过 PredictProtein预测"c户訂编码蛋白质的二级结构，表明该蛋白含44. 5%的 a螺旋、11.1%的3折叠和44.5%的环状结构。并在N端具有一段信号肽，推
测其为分泌蛋白。
2. Sc/T7的时空表达特点分析
利用原位杂交技术分析了在不同发育阶段的花蕾中的表达情况。结 果显示在刚分化的花粉母细胞和绒毡层细胞中即出现万c尸W的表达信号(图3A), 随后在减数分裂时期的小孢子和绒毡层中表达量进一步提高，且发现在绒毡层 中的表达比在小孢子中的表达稍强(图3B)，在四分体时期(图3C)、单核小孢 子时期(图3D)的小孢子和绒毡层中继续存在，但表达量有所降低，在花粉成 熟期已经检测不到及:/^/的表达信号(图3E)。在所有被检测的花蕾的萼片、花 瓣、中柱及雌蕊中没有检测到及^釘的表达。用正义探针进行杂交的对照中亦 没有检测到表达信号(图3F)。这些结果说明及^W在花粉花药发育的早期就开 始表达，在花粉成熟晚期表达逐渐减弱并消失。
3. 利用RNAi技术验证Ac/W/的功能
构建含白菜BcA9组织特异型启动子的及^W干涉基因表达载体(图4),通 过农杆菌介导法转入菜心(白菜的一个变种)植株，通过菜心无菌苗的培养(图 5A)、菜心子叶-子叶柄外植体的预培养(图5B)、共培养(图5C)、分化培养(图5D)诱导KaW苗的产生及在无菌瓶中生长扩繁(图5E)、生根培养(图5F)、移 栽前炼苗(图5G)、移栽诱导开花(图5H)等一系列过程，获得万c尸釘基因的 转基因植株T。代，命名为^^-Z^/ W。经X-Gluc组织化学染色发现转基因菜心植 株^9-6"W的花药被染成蓝色(图6A、 C、 E)、而非转基因对照植株的花药并 未有蓝色斑点显现(图6 B、 D、 F)，同时，转基因植株的叶片(图6 G)和非 转基因植株的叶片(图6H)均未被染成蓝色，说明报告基因6KS"在转基因植株 的花药中特异表达，同时预示及:/^/干涉基因片段也随之在转基因植株的花药 中得到表达。PCR、 Southern杂交同时也表明万c尸F7干涉基因已经整合到转基因 植株的染色体。进一步的Northern杂交检测发现，基因在转基因植株中 的表达受到了明显抑制，如图7所示，与阳性对照植株可育株系'及，s^W7-W^ (B line)和空载体转化植株(erap-tra)相比，在转基因植株的花 (F)和花蕾(B)中；5c尸W基因的表达都受到了明显抑制，与阴性对照不育系 7cajM7-W( (A line)不表达基因的情况类似。由此，我们获得了 9个转化芽系、63株转化植株。同时获得了空载体转化植株，作为后期相关检 测的对照。
内源及^W的表达受阻断的转基因植株移栽后的生长状况和形态观察显示， 转基因植株j^-化p^营养生长正常，并且能正常开花，与空载体转化植株和非 转基因植株均没有明显差异，萼片、花瓣、雌蕊、雄蕊、蜜腺等花器官的发育 也与空载体转化植株及非转基因植株没有明显区别。但离体萌发实验发现75% 左右的花粉不能正常萌发，约15.6%的花粉能长出花粉管，但花粉管长到一定长 度时顶端爆裂(图8B、 D),正常萌发率只有10.5% (图8E)。说明万c戶W表达受 抑制影响了花粉的正常萌发。扫描电镜观察发现^^-力cpr/花粉近10(m畸形。与 正常的椭圆形、网纹清晰、三条萌发沟均匀分布的非转基因植株花粉(图9 E、 F)相比，力9-的花粉不饱满、形状不规则，网纹浅、模糊，且萌发沟的数 目及分布没有规律，呈现各种各样的畸形(图9A D)，造成花粉不能完成正常 的生物学功能。根据万c尸釘预测蛋白质的结构特征及其在早期绒毡层细胞和小 孢子中共表达的特点，认为其可能作用于细胞壁发育过程中绒毡层与花粉的信 号传递过程，该基因的表达阻断将引起植物雄性育性的显著下降。
结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本
发明而不用于限制本发明范围。 实施例l 5c/T7基因的分离和克隆
(1) Bc-A17T17片段的分离用A17/T17引物对白菜a^ OK1 Wc^iW/-W4/"的不育株系与可育株系花蕾基因表达差异进行cDNA-AFLP分析，检测 到在可育株系花蕾中特异表达的基因条带Bc-A7T17，用手术刀片割下聚丙烯 酰胺凝胶上的差异片段，溶于100MLTE (10mmol.L-'Tris, pH 7. 5， 1 mmol丄-1 EDTA， pH8.0)，并作为模板进行PCR扩增，条件与cDNA-AFLP中的预扩增相 同。PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳，经凝胶回收试剂盒纯化。回收产物连接 到pGEM-T Easy Vector (Promega)并转化到f. DH 5 a感受态细胞，
经蓝白斑筛选重组质粒，测序，最后RT-PCR验证得到该条带的核苷酸序列。
(2) Bc-A17T17片段相关的基因的cDNA的3'末端和5，末端扩增根 据双链cDNA合成试剂盒(SMART PCR cDNA Synthesis Kit)中接头及引物的 特征设计了 3' RACE和5' RACE锚定引物P3和P5;根据差异片段Bc_A17T17 设计正向特异引物S1，与锚定引物P3扩增3'末端，反向引物A1与锚定引物 P5扩增5'末端。锚定引物P5的序列为5' -MGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'; 锚定引物P3的序列为5， -GAGGCGGCCGACATGTTTTT-3，;正向特异引物S1序 列为5， -GTTCTACTTCTACATCAGACTCC-3，；反向特异引物Al序列为5， -TTACTAGTTTGCCMCTTGGTGMG-3， 。 PCR产物经DNA凝胶回收试剂盒回收，插入 pGEM-T Easy载体，转化DH 5 a感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，碱裂解法 抽提质粒，酶切鉴定后，重组质粒送上海博亚生物技术有限公司测序，得到 Bc-A17T17片段相关的基因的cDNA的3'末端和5'末端。
(3) ^:尸/T7基因的全长克隆根据两端拼接的cDNA全长序列设计特异引 物T1 (序列为5' -GCGTCTAGAGAGGTCATTCAATTC-3，)和T2 (序列为5， -A TAGGATCCATAGGTCGGTCAATA-3')。常规PCR方法再次从花蕾cDNA中扩增Bc-A17T17片段相关基因的cDNA序列；用同一特异引物对在基因组DNA中扩增得 到其DNA序列。
实施例2利用RNAi技术验证及:/W/的功能
(1)正义及反义片段的分离根据5c/^/ DNA全长序列及植物双元载体 pBI121的多克隆酶切位点，在及7/T2序列内部第1个碱基至第583个碱基之间 设计引物，扩增583 bp序列作为正义基因片段(包含一段外显子序列和一段内 含子序列)。PCR引物分别含有和S』I限制性内切酶位点(下划线部分) 及三个保护碱基，Sc/W-iX5 : 5， ~GCGTCTAGAGAGGTCATTCAATTC-3 ，， ^:/T卜iB3I: 5， -ATAGGATCC GCCCAGTCAGGAGTATM-3'。在及:尸W序列内部第1 个碱基至第426个碱基之间设计引物，扩增426bp序列作为反义基因片段，PCR 引物分别含有5^3 I和万』I限制性内切酶位点(下划线部分)及三个保护碱基，^7尸F/-iS5 : 5' -ATACCCGGGGAGGTCATTCAATTCAT-3' ， "c/W/-iB3E : 5, -CTAGGATCCCCTTCCAATAGCAAA AGA-3 ，。阳性克隆质粒分别命名为pTBcPWliS 和pTBcPWliA。
(2)干涉表达载体的构建将阳性克隆质粒pTBcPWliS和pTBcPWliA分别 进行Aa I和^v7fi I、 5』I和5^a I双酶切，PCR产物在1. 5%的琼脂糖凝胶 中电泳分离后，回收目的片段。取上述制备好的的及^W正义和反义基因片段、 BcA9启动子和经历; c/ III和万a/zH I双酶切的pBI121以摩尔比1 : 1 : 1 : 1混 合，用T4DNA连接酶连接。连接产物转化DH5a感受态细胞。经转化的细菌涂 于含Kan 50 mg'l/1的固体LB培养基平板上，37。C培养过夜。挑取单菌落，在5 mL含Kan 50 mg'L—1的液体LB培养基中振荡培养过夜，碱裂解法抽提其质粒DNA， 采用PCR和限制性内切酶酶切等方法鉴定阳性克隆。阳性克隆质粒命名为 pBIBcA9-BcPWli。
(3)干涉表达载体对菜心的遗传转化将上述构建好的植物表达载体 pBIBcA9-BcPWli质粒通过冻融法转入农杆菌LBA4404，菜心的遗传转化通过组 织培养途径实现。本实验以子叶-子叶柄为外植体，把子叶柄插入预培养培养基 中2 3 mm深，培养3 d，农杆菌侵染后平放入共培养培养基上，培养2 d。 将共培养2 d后的菜心子叶-子叶柄外植体转入分化培养基上，大约20 d左右， 待分化出的抗性芽长到一定大小，小心从基部将其切下转入到新的分化培养基 上继续生长。得到的抗性芽在分化培养基上继代并筛选，每20d左右转瓶一次， 去除其中的假阳性植株。待抗性植株长到2 3 cm时，将其从愈伤组织切下， 转到生根培养基上。待抗性植株在生根培养基上长出大量白色的须状根时，打 开瓶口炼苗2 3 d，小心去除根上的培养基，移入含水量为60%的培养土中， 保湿培养5 7天后，再转到室外培养。
转基因植株经PCR检测、Southern及Northern印迹杂交检测，筛选获得 万c尸W基因表达沉默和受抑制的转基因植株^^-6c/7W。
(4)转基因植株的形态和细胞学观察体外检测花粉萌发情况,用于花粉离 体萌发的半固体培养基组成为15%蔗糖+0.4mmol L-1硼酸+0.4mmol L-l CaM)3 + 0. 1%琼脂。采集花朵的时间均为上午9:00左右，每株采5朵花药刚裂开 的花，采后先将花粉抖落到硫酸纸上，充分混匀，将其点涂在载玻片上的培养 基中，不加盖玻片，将载玻片置于铺有湿润滤纸的培养皿中，置于黑暗、20 ~ 25°C 恒温条件下培养，4 6 h后在显微镜下观察萌发率。扫描电镜观察花粉形态， 采刚开放的花朵，用镊子夹持花药将花粉轻轻地涂在贴有双面胶的金属载物台-40型扫描电镜下观察花粉形状、饱满程度及表面网纹，拍照。
最后，还需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然， 本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本 发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。序列表
〈110〉浙江大学
〈120〉白菜雄性育性相关基因BcPWl及其分离方法
〈160> 2
〈170〉 Patentln version 3.1
〈210〉 1
〈211〉 259
〈212〉 DNA
〈213〉 Brassica rapa
〈400〉 1
actacttcta gttctacttctac8tcagsctccagggg幼cagcgcaggcgtaattgaact60
g犯gct鄉gtgtaacttca cc犯gttggcccaatagctaataatttaga120
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〈210〉 2
〈211〉 2021
<212〉腿
〈213〉 Brassica r邵s
〈400〉 2
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acatccaig犯gtga^tgeitteitttttgtggtg202权利要求
1、一种白菜雄性育性相关基因BcPW1，其特征在于它包含SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
2、 根据权利要求1所述的白菜雄性育性相关基因及:尸W，其特征在于所 述核苷酸序列还包括在SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或 缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。
3、 一种权利要求1所述的白菜雄性育性相关基因A:尸f7的分离方法，其特 征在于包括以下步骤(1) Be-A17T17片段的分离用A17/T17引物对白菜a力^51 Wcs^W7-W力/"'的不育株系与可育株系花蕾基因表达差异进行cDNA-AFLP分析，检测 到在可育株系花蕾中特异表达的基因条带Bc-A7T17，用手术刀片割下聚丙烯 酰胺凝胶上的差异片段，溶于100ATE，并作为模板进行PCR扩增，条件与 cDNA-AFLP中的预扩增相同；PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳，经凝胶回收试 剂盒纯化；回收产物连接到pGEM-T Easy Vector (Promega)并转化到A co7j' DH5a感受态细胞，经蓝白斑筛选重组质粒，测序，最后RT-PCR验证得到该 条带的核苷酸序列。(2) Be-A17T17片段相关的基因的cDNA的3，末端和5，末端扩增根 据双链cDNA合成试剂盒中接头及引物特征设计3' RACE和5' RACE锚定引物 P3和P5;根据差异片段Bc-A17T17设计正向特异引物Sl和反向特异引物Al， 正向特异引物Sl与锚定引物P3扩增3'末端，反向特异引物Al与锚定引物 P5扩增5'末端；锚定引物P5的序列为5' -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，； 锚定引物P3的序列为5， -GAGGCGGCCGACATGTTTTT-3';正向特异引物S1序 列为5， -GTTCTACTTCTACATCAGACTCC-3，；反向特异引物Al序列为5，-TTACTAGTTTGCCAACTTGGTGMG-3， ； PCR产物经DNA凝胶回收试剂盒回收，插入 pGEM-T Easy载体，转化DH 5 a感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，碱裂解法 抽提质粒，酶切鉴定后，重组质粒送上海博亚生物技术有限公司测序，得到 Bc-A17T17片段相关的基因的cDNA的3'末端和5'末端。(3)及Wf7基因的全长克隆根据两端拼接的cDNA全长序列设计特异引物 T1和T2，所述T1序列为5， -GCGTCTAGAGAGGTCATTCMTTC-3，，和T2序列为 5' -A TAGGATCCATAGGTCGGTCMTA-3，；常规PCR方法再次从花蕾cDNA中扩增 Be- A17T17片段相关基因的cDNA序列；用同一特异引物对在基因组DNA中扩 增得到其DNA序列SEQ ID No. 2。
全文摘要
本发明公开了一种白菜雄性育性相关基因BcPW1及其分离方法。本发明还公开了含有BcPW1基因干涉片段的质粒及获得该质粒的方法、一种BcA9组织特异型启动子的含该质粒的植物表达载体，以及利用此表达载体转化植物细胞获得花粉发育异常、雄性育性降低的植物和对植物雄性育性进行改造的方法。BcPW1基因可能作用于细胞壁发育过程中绒毡层与花粉的信号传递过程。该基因的分离克隆及功能验证，有助于阐明花粉发育和植物雄性不育产生的分子机理，对生产上人为控制植物育性，利用基因工程手段培育优良品种具有重要的实践意义。
文档编号C12N15/29GK101319217SQ20081006057
公开日2008年12月10日 申请日期2008年3月28日 优先权日2008年3月28日
发明者叶意群, 张爱红, 张豫超, 曹家树, 鹂 黄 申请人:浙江大学