无物种限制的真核生物同时进行基因敲除和基因过表达的制作方法

文档序号：11246325阅读：856来源：国知局

本发明涉及对真核生物同时进行基因敲除和基因过表达。

背景技术：

基因支持着生命的基本构造和性能。储存着生命的种族、血型、孕育、生长、凋亡等的全部信息。人类根据需要进行基因操作，选择目的基因(dna片段)在体外构建载体，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的细胞或个体或治疗人类疾病的目的。基因操作的方式有很多种，主要可分为基因的过表达和降低表达或基因敲除。基因过表达技术已经非常成熟，主要由一个启动子启动外源基因表达即可。基因敲除技术则不然。传统的基因操作通过基于全能胚胎干细胞的同源重组实现。需要构建一个复杂的同源重组载体，包括了阳性和阴性筛选抗性等，效率非常低，而且操作复杂、耗时长，很难用于实际应用。

一些生物性状受到激活基因和抑制基因的同时调节。在对这些性状进行调控时，往往需要对影响这些性状的激活基因和抑制基因同时进行敲除和过表达。由于传统的基因敲除非常复杂，因而利用传统的方式同时进行基因敲除和基因过表达非常困难。通常，为了实现在同一个体或同一细胞进行基因敲除和基因过表达这一目的，需要先进行基因敲除再进行基因过表达，或者是先进行基因过表达再进行基因敲除来实现。很显然，这样的策略操作步骤繁琐、效率低、耗时长。要进行多基因的敲除或过表达，则更是难上加难。特别是新分离的原代细胞，因为生长时间短，基因导入困难，不能先进行基因敲除或过表达，再进行过表达或基因敲除，必须同时进行基因敲除和基因过表达。这样传统的策略几乎是不可能的。

近年来出现了一类新的基因敲除技术，这类技术利用不同的机制，将核酸内切酶导向到基因组的特定位点，核酸内切酶将dna剪切，造成dna双链断裂，实现dna序列改变。为区别于80年代发明的基因打靶技术，这类新的技术被称之为基因编辑技术(geneediting)。这类技术主要包括zfn、talen和crispr/cas9。crispr/cas9是2012年人们研发出的一种新型基因组修饰技术--规律成簇的间隔短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，crispr)。crispr是细菌用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统。crispr广泛存在于众多原核生物基因中，其中ii型为crispr/cas，免疫系统依赖cas9内切酶家族靶向和剪切外源dna。在这一系统中，crrna(crispr-derivedrna)通过碱基配对与trancrrna(trans-activatingrna)结合形成双链rna，此trancrrna/crrna二元复合体(现在融合成为了sgrna，singleguidedrna)指导cas9蛋白在crrna引导序列靶向位点剪切双链dna，其中cas9的hnh核酸酶结构域剪切互补链，其ruvc-like结构域剪切非互补链，形成双链dna缺口，然后细胞会借助同源重组机制(homologousrecombination)或者非同源末端连接机制(non-homologousendjoining)对断裂的dna进行修复。如果细胞通过非同源重组机制进行修复，将会产生随机的突变、缺失或插入，造成基因敲除的效果。如果细胞通过同源重组机制进行修复，会用另外一段dna片段填补断裂的dna缺口，因而会引入一段“新的”遗传信息，造成基因敲入效果。

技术实现要素：

本发明的目的是同时实现无物种限制的真核生物的基因敲除和基因过表达。

根据本发明的第一方面，提供了一种(非治疗目的)多基因同时过表达和/或敲除方法，包括：

将至少一个car构建于同一载体，并用同一个启动子驱动表达，并且不同car之间利用2a短肽分开；和/或

将至少一个sgrna构建于同一载体，不同sgrna分别用启动子u6驱动表达，并且不同的u6-sgrna串联在一起；

将所述载体电转染(脂质体转染或电穿孔)导入同一细胞或个体，其中所述至少一个car在同一细胞或个体同时实现基因过表达，所述至少一个sgrna在同一细胞或个体同时实现基因敲除。

根据本发明的一个具体实施例，所述至少一个sgrna可以在同一细胞或个体同时实现敲除胞内表达靶基因和胞膜表达靶基因，或同时实现敲除一条信号通路的上下游靶基因或几条平行信号通路的不同靶基因。所述至少一个sgrna优选为两个分别靶向胞内表达基因hgata3和胞膜表达基因hpd1的sgrna。

根据本发明的一个具体实施例，所述至少一个car可以为单个过表达的tn-muc1car或her2car，所述至少一个sgrna可以为单个靶向胞内表达靶基因hgata3的sgrna，并且car载体和sgrna载体(的dna片段)被串联构建为一体。

根据本发明的一个具体实施例，所述至少一个car可以为过表达的tn-muc1car和/或her2car，所述至少一个sgrna可以为两个分别靶向胞内表达靶基因hgata3和胞膜表达靶基因hpd1的sgrna，并且car载体和sgrna载体被串联构建为一体。

上述实施例中，所述细胞优选为hek293t细胞或人原代t细胞。

根据本发明，tn-muc1car或her2car是优选利用piggybac-transposon载体依次串联人启动子、csf2ra嵌合受体信号肽、胞膜外抗原结合区、铰链区、胞内信号传导区和t2a短肽连接的抗性基因puromycin制备而成的。

胞膜外抗原结合区优选为用于结合tn-muc1或her2蛋白的cd19单链抗体(scfv)，依次串联c-myc表位标记、cd8hinge嵌合受体铰链、cd8transmembrane嵌合受体跨膜区。

胞内信号传导区优选为cd28-4-1bb-cd3ζ，cd28和4-1bb为嵌合受体共刺激因子。

根据本发明的另一方面，提供了一种多基因同时过表达和/或敲除装置，包括：

pbmc细胞准备系统；

amaxa电转试剂盒；

电转染系统，接收来自amaxa电转试剂盒的电转试剂并将其和用于过表达基因的质粒和用于基因敲除的质粒混合，形成电转混合物体系；并接收来自pbmc细胞准备系统的pbmc细胞且在其中加入所述混合物进行电转染；

cd3阳性t细胞富集系统，包含用于偶联cd3/cd28抗体的磁珠；以及

筛培系统，用于筛选并培养扩增转染后的t细胞。

本发明的又一目的是提供一种根据上述方法获得的分离的t细胞或细胞系或其次代培养物。

本发明选用piggybac转座子系统提高了转染效率和转基因的表达效率,缩短了制备时间，简化了car-t的制备程序，增强了系统的负载量。另外，本发明敲除基因时避免了使用病毒载体，安全性更高。

本发明将基因敲除与car的装备放在同一个步骤里完成，提高了car-t细胞的制备效率和存活率，降低了多次操作的成本；同时缩短了car-t细胞在体外的培养周期，保证了其在体外扩增的活性。

本发明通过构建一个载体，利用不同的启动子同时过表达某种基因，实现基因的过表达，同时通过cas9和sgrna实现基因敲除。本发明因此实现了在同一细胞或同一个体同时过表达基因和敲除基因的目的。另外，本发明还利用自我剪切的2a短肽(包括p2a、t2a两种)连接不同基因，保证多基因的等量同时过表达；串联多个u6-sgrna(靶向不同靶基因)同时实现多个基因的敲除。本发明因此实现了在同一细胞或同一个体同时实现多个基因的过表达和多个基因的敲除，特别是可以同时敲除胞内表达靶基因和胞膜表达靶基因，或同时敲除一条信号通路的上下游靶基因，或几条平行信号通路的不同靶基因。

本发明的再一目的是构建同时进行基因敲除和基因过表达的载体。

本发明通过合理构建载体，可一次性简单实现同一个体或同一细胞同时进行基因敲除和基因过表达，且消耗低、耗时短、效率高，是实现真核生物特别是单细胞基因敲除和基因过表达的引领方法。

附图说明

图1示出了根据本发明的第三代car的组成元件；

图2示出了根据本发明一个实施例的tn-muc1carpiggybac表达载体中的主要元件；

图3示出了根据本发明一个实施例的her2carpiggybac表达载体中的主要元件；

图4示出了根据本发明一个实施例的由短肽p2a连接起来的tn-muc1car和her2car基因的载体；

图5示出了根据本发明一个实施例的载体pst1374-nls-flag-cas9zf-nls；

图6示出了根据本发明一个实施例的载体pgl3-u6-sgrna；

图7示出了根据本发明一个实施例的载体pgl3-u6-hgata3sgrna；

图8示出了根据本发明一个实施例的载体pgl3-u6-hshp1sgrna；

图9示出了根据本发明一个实施例的载体pgl3-u6-hpd1sgrna；

图10示出了根据本发明一个实施例的载体pst1374-nls-flag-cas9zf-nls-u6-sgrna；

图11示出了根据本发明一个实施例的载体pst1374-nls-flag-cas9zf-nls-u6-hgata3sgrna-u6-hpd1sgrna；

图12示出了根据本发明一个实施例的同时表达cas9蛋白和转座酶的表达载体；

图13示出了根据本发明一个实施例的同时表达抗tn-muc1嵌合抗原受体和humangata3sgrna的载体；

图14示出了根据本发明一个实施例的同时表达抗tn-muc1嵌合抗原受体和humangata3sgrna以及humanpd1sgrna的载体；

图15a示出了在293t细胞上敲除gata3后的电泳结果；

图15b示出了在293t细胞上敲除gata3后的ta克隆测序结果；

图15c示出了在293t细胞上过表达tn-muc1car的流式检测结果；

图16a示出了在人的t细胞上敲除gata3后的电泳结果；

图16b示出了在人的t细胞上敲除gata3后的ta克隆测序结果；

图16c示出了在人的t细胞上过表达tn-muc1car的流式检测结果；

图17a示出了在293t细胞上同时敲除gata3和pd1后的电泳结果；

图17b示出了在293t细胞上同时敲除gata3和pd1后的ta克隆测序结果；

图17c示出了在293t细胞上过表达tn-muc1car的流式检测结果；

图18a示出了在人的t细胞上同时敲除gata3和pd1后的电泳结果；

图18b示出了在人的t细胞上同时敲除gata3和pd1后的ta克隆测序结果；

图18c示出了在人的t细胞上过表达tn-muc1car的流式检测结果；

具体实施方式

构建过表达一个和多个基因的载体

(1)以过表达一种抗tn-muc1嵌合抗原受体(tn-muc1car)为例，与传统的利用病毒做car载体不同，本发明采用第三代car，将tn-muc1car整合到piggybac转座子表达系统中。这样一是回避了病毒载体可能导致的生物安全性问题；二是可以延长car表达的时间；三是制备简单，不用像病毒包装一样，需要非常严格的条件。

图1展示第三代car的组成元件，包括嵌合受体信号肽、胞膜外抗原结合区(scfv)、跨膜区(cd8αtm)、胞内信号传导区(cd28,4-1bb,cd3ζ)。图2展示tn-muc1carpiggybac表达载体中的主要元件，car基因包含有一个经过人工优化过的信号肽，tn-muc1胞膜外抗原结合区，c-myc标签，cd8跨膜区，共激活受体cd28和4-1bb胞内信号传导区，cd3ζ胞内信号传导区。car基因与药筛抗性基因puromycin通过具有自我剪切功能的2a肽段相连，在ef1α启动子的驱动下同时表达。载体的两端是反向重复序列(ir)。

载体具体构建如下：anti-tn-muc1抗体的scfv序列经人工合成嵌合进puc57表达载体中，分别设计带有xba1酶切位点的正向引物和带有bgl2酶切位点的反向引物将scfv序列经聚合酶链式反应(pcr)扩增出来。扩增产物与piggybac-cd19car载体同时进行xba1和bgl2酶切，酶切产物经纯化后连接，转化，构建出piggybac-tn-muc1car。载体主要元件序列详见序列表中的序列1。

(2)再以制备一种抗her2嵌合抗原受体(her2car)为例,同样采用第三代car，并且将her2car整合进了piggybac转座子表达系统中。载体中的元件与载体tn-muc1car一致(图3)。

具体构建如下：anti-her2抗体的scfv序列经人工合成嵌合进puc57表达载体中，分别设计带有xba1酶切位点的正向引物和带有bgl2酶切位点的反向引物将scfv序列经聚合酶链式反应(pcr)扩增出来。扩增产物与piggybac-cd19car载体同时进行xba1和bgl2酶切，酶切产物经纯化后连接，转化，构建出piggybac-her2car。载体主要元件序列详见序列表中的序列2。

(3)再以同时表达两种car为例，本发明构建一种同时表达由短肽p2a连接起来的tn-muc1car和her2car基因的载体(图4)，两个car都采用第三代car，并同时整合进piggybac转座子表达载体中。

具体构建如下：分别设计引物将图2中tn-muc1car和图3中her2car基因表达序列通过聚合酶链式反应扩增出来，扩增tn-muc1正向引物中包含有20个碱基的同源臂，可以与piggybac载体同源重组，扩增tn-muc1反向引物中包含有p2a序列；扩增her2正向引物中包含有20个碱基的同源臂，可以与tn-muc1中p2a同源重组，扩增her2反向引物中包含有20个可以与t2a同源重组的序列。piggybac-cd19car载体经xba1和bamh1双酶切，酶切产物与扩增出来的tn-muc1片段和her2片段同源重组，构建成piggybac-tn-muc1-p2a-her2car。载体主要元件序列详见序列表中的序列3。

构建cas9/sgrna介导单基因敲除载体

(1)以gata3和shp1为例，利用cas9/sgrna介导胞内蛋白gata3或者shp1的基因敲除。

cas9表达载体为pst1374-nls-flag-cas9zf-nls(载体主要元件序列详见序列表中的序列4),载体上带有药筛基因blasticidin(bsd)(图5)。sgrna的表达载体为pgl3-u6-sgrna(载体主要元件序列详见序列表中的序列5),载体上带有药筛基因puromycin(puro)(图6)。humangata3sgrna载体的构建：在gata3基因的外显子2(e2)中，根据gn19ngg或者是n20ngg的原则设计20个碱基的互补配对的上下游引物，经过退火之后连接到pgl3-u6-sgrna载体上，构成pgl3-u6-hgata3sgrna(图7)。humanshp1sgrna载体的构建：根据相同的原则，在shp1基因的外显子3(e3)上设计20个碱基的guiderna序列，经退火连接之后构成pgl3-u6-hshp1sgrna(图8)。

(2)以pd1为例，利用cas9/sgrna介导膜蛋白pd1的基因敲除。cas9表达载体同图5。pd1sgrna载体的构建：在pd1基因的外显子2(e2)中，根据gn19ngg或者是n20ngg的原则设计20个碱基的互补配对的上下游引物，经过退火之后连接到pgl3-u6-sgrna载体上，构成pgl3-u6-hpd1sgrna(图9)。

(3)单一cas9/sgrna载体所介导的基因敲除。

cas9/sgrna所介导的基因敲除，必须要在sgrna的介导下，将cas9蛋白牵引到基因组上特定的位点进行基因编辑，因此在细胞上实现单一基因的敲除必须在同一个细胞上同时表达cas9和sgrna，而当cas9和sgrna表达在不同载体上时，由于转染感染或者是电转的效率问题，在一个细胞中可能仅表达一个载体，这样就会限制了基因编辑的效率，因此，将cas9和sgrna构建在同一个载体上将会极大的提高基因编辑的效率。如图10所示，cas9/sgrna共表达载体为pst1374-nls-flag-cas9zf-nls-u6-sgrna(载体主要元件序列详见序列表中的序列6)，cas9蛋白与药筛基因(puro)在cmv启动子的驱动下同时表达，两者之间以具有自我剪切功能的多肽t2a相连，sgrna在u6启动子的驱动下单独表达。根据图7、图8、图9所示的序列，设计20个碱基的互补配对的上下游引物，经过退火之后连接到pst1374-nls-flag-cas9zf-nls-u6-sgrna载体上，本发明构建了pst1374-nls-flag-cas9zf-nls-u6-hgata3sgrna,pst1374-nls-flag-cas9zf-nls-u6-hshp1sgrna和pst1374-nls-flag-cas9zf-nls-u6-hpd1sgrna。

构建cas9/sgrna介导多基因敲除载体

cas9/sgrna介导的基因编辑的另一个优势是可以同时进行多基因的敲除。设计分别针对不同靶基因的sgrna，各个sgrna分别由一个u6启动子启动表达。将多个u6-sgrna串在一起，通过各个u6的介导，实现多个sgrna的表达。在多个sgrna的介导下，可以同时实现多个位点的同时基因编辑，为此，我们构建了可以同时敲除胞内表达蛋白hgata3和膜表面蛋白hpd1的载体pst1374-nls-flag-cas9zf-nls-u6-hgata3sgrna-u6-hpd1sgrna(图11)(载体主要元件序列详见序列表中的序列7)。

构建同时过表达基因和sgrna的载体

同时实现基因过表达和基因敲除的最好表达载体是将过表达基因和基因敲除元件构建在同一个载体上。实现基因的过表达需要将外源性的基因表达片段整合入细胞的基因组中实现持续的稳定的表达，而cas9/sgrna系统因为存在脱靶效应，因此不能同时在细胞中稳定表达，因此，尽管piggybac载体可以同时表达外源基因片段、cas9蛋白和sgrna，还是应当尽量避免由cas9/sgrna所带来的脱靶效应。本发明将外源性的基因与sgrna融合进piggybac表达载体中，cas9蛋白的表达与转座酶基因的表达则构建在另一个载体之中。

同时表达cas9蛋白和转座酶的表达载体如图12所示。在cmv启动子的驱动下，cas9蛋白、转座酶和药筛基因blasticidin同时表达，cas9蛋白和转座酶之间以具有自我剪切功能的多肽p2a相连，转座酶和药筛基因blasticidin之间以具有自我剪切功能的多肽t2a相连(载体主要元件序列详见序列表中的序列8)。

(1)为实现同一细胞或个体内同时过表达某一基因和敲除某一基因，以car为例，本发明构建了同时表达抗tn-muc1嵌合抗原受体和humangata3sgrna的载体(载体主要元件序列详见序列表中的序列9)，如图13所示。抗tn-muc1嵌合抗原受体与药筛基因(puro)在启动子ef1的启动下同时表达,两者之间以具有自我剪切功能的多肽t2a相连接。humangata3sgrna在u6启动子的驱动下表达。

(2)以car和sgrna为例，按照相同的策略，本发明构建了同时表达抗tn-muc1嵌合抗原受体和humanshp1sgrna的载体。

(3)以car和sgrna为例，按照相同的策略，本发明构建了同时表达抗tn-muc1嵌合抗原受体和humangata3sgrna以及humanpd1sgrna的载体(载体主要元件序列详见序列表中的序列10)(图14)。

在常规细胞上同时实现基因过表达和单基因敲除

本发明采用两个质粒转染法(以下转染都采用两质粒转染法)，利用脂质体或电转将表达tn-muc1-humangata3sgrna的载体与表达cas9-p2a-transposase的载体一起转染至hek293t细胞中，以lipo2000为例，具体步骤如下：

1、真核生物细胞的培养与转染

(1)以hek293t细胞为例：hek293t细胞接种培养于添加10％fbs的dmem高糖培养液中(hyclone,sh30022.01b),其中含penicillin(100u/ml)和streptomycin(100μg/ml)。

(2)在转染前分至6孔板中,待密度达到70％-80％时进行转染。

(3)按照lipofectamine^tm2000transfectionreagent(invitrogen,11668-019)的操作手册,将2μgpiggybac-ef1-tn-muc1-u6-hgata3质粒与2μg的pst1374-nls-flag-cas9zf-nls-p2a-transposase质粒混匀,共转染至每孔细胞中，6-8小时后换液,12小时后,向每孔细胞中加入10μg/mlblasticidin(sigma,15205)和2μg/mlpuromycin(merck,540411)药筛,72小时后收取细胞。

2、基因敲除的检测(以t7en1酶切为例)

(1)收取部分细胞在裂解液(10μmtris-hcl,0.4mnacl,2μmedta,1％sds)中用100μg/ml蛋白酶k裂解消化后,酚-氯仿抽提后溶解到50μl去离子水中。

(2)使用一对引物hgata3t7en1for和hgata3t7en1rev进行pcr扩增，用axypreppcrcleanup纯化获得pcr回收产物,取200ng统一稀释到20μl进行变性、退火，程序如：95℃，5min；95–85℃at-2℃/s；85–25℃at-0.1℃/s；holdat4℃。

(3)在20μl体系中加入t7nei内切酶(t7en1)0.3μl，37℃酶切30分钟后，加入2μl10xloadingbuffer，用3％的琼脂糖胶电泳检测，结果见图15a。

3、ta克隆测序

(1)将t7en1酶切检测步骤(2)获得的pcr回收产物用rtaq进行加a反应。加a反应体系为：

700～800ngpcr回收产物

5μl10xbuffer(mg2+plus)

4μldntp

0.5μlrtaq(takara,r001am)

补水至50μl体系。

37℃温育30分钟后，取1μl产物与pmd19-tvector(takara,3271)连接并转化dh5感受态细胞(transgen,cd201)。

(2)挑取单克隆，用通用引物m13-f测序，测序结果见图15b，结果发现：靶基因hgata3缺失了sgrna靶向的一段序列，基因敲除成功。

4、真核生物表达外源基因的检测(以tn-muc1为例)

(1)收取细胞,在pbs中清洗一次,1000转,5分钟离心,弃掉上清。

(2)一抗染色：mouseanti-c-myc抗体(cellsignaling,2276s)1:500稀释，将细胞重悬在100μl体系中，冰上放置10分钟。

(3)终止反应：向体系中加入1mlpbs终止染色反应，1000转，离心5分钟，弃掉上清。

(4)二抗染色：goatanti-mousepe抗体1:10稀释，将细胞重悬在100μl体系中，冰上放置10分钟。

(5)终止反应：向体系中加入1mlpbs终止染色反应，1000转，离心5分钟，弃掉上清。

(6)以500μlpbs重悬细胞，流式检测。流式检测结果见图15c。

以人的t细胞为例，本发明在原代细胞同时实现基因的过表达和单基因敲除

1、pbmc细胞的分离纯化：

(1)用抗凝管采集外周血，边采集边摇晃使外周血与抗凝剂充分混合；

(2)外周血细胞与淋巴细胞分离液等体积混合，离心，吸取离心后的白膜层细胞；

(3)将得到的白膜层细胞与pbs或者无血清细胞培养基1640混合后离心，沉淀即为所述pbmc细胞。

重复三遍。

2、cd3阳性细胞的富集

(1)调整pbmc细胞浓度至50x10⁶cell/ml。

(2)按每1ml加入cd3+enrichedantibodiescocktail50μl，混匀后室温静置5分钟。

(3)按每1ml加入magnet150μl，混匀后室温静置10分钟，

(4)将离心管置于磁力架上静置5分钟，吸取上层细胞悬液至新的15ml离心管中。

(5)重复该操作一次。

(6)室温离心300*g，10分钟，收集细胞。

(7)细胞计数。

3、cd3阳性细胞的电转

(1)配置电转体系

向1.5ml离心管中分别加入8μgpiggybac-ef1a-tn-muc1-u6-hgata3质粒和8μg的pst1374-nls-flag-cas9zf-nls-p2a-transposase质粒，并按照lonzaamaxa电转试剂盒说明书要求，加入82μl电转缓冲液和18μlsupplement1,混匀。对照组中仅过表达tn-muc1而不进行基因敲除。

(2)收取20x10⁶个细胞到15ml离心管中，300g离心10分钟，弃掉上清。

(3)以(1)中配好的质粒电转缓冲液混合物重悬细胞，并转移至电转杯中。

(4)使用仪器lonza2b,u-014程序进行电转。

(5)电转后的细胞迅速转移至提前预热的添加有10％fbs的aim-v培养基中，37度5％二氧化碳培养箱中培养2小时。

(6)电转后的细胞全换液，以1x10⁶个/ml的密度重悬细胞，培养过夜。

(7)24小时后，取1x10⁵个细胞用流式检测电转效率。

4、t细胞的激活培养

(1)电转培养24小时后，向培养基中加入100u/mlil-2，并按照1:1的比例加入cd3/cd28dynabeads，激活t细胞。

(2)每两天对细胞半换液，或者是补加il-2，细胞密度始终维持在1x10⁶个/ml。

(3)激活5天后，将t细胞收集到15ml离心管中，并将离心管置于磁力架中，慢慢将上清转移到另外一个干净的15ml离心管中，重复此步骤一次。

(4)室温离心300*g，10分钟，弃上清，使用10％fbs,300u/mlil-2aim-v培养基重悬细胞，密度控制在1x10⁶个/ml。

(5)每两天对细胞半换液，或者是补加il-2，并计数，细胞密度始终维持在1x10⁶个/ml。

(6)培养到第14天的时候，计数，取1x10⁶个细胞流式检测tn-muc1car的表达并进行t7en1检测hgata3基因的敲除效率。

5、基因敲除以及外源基因表达的检测

检测方法请参照普通细胞检测的方法，t7en1的检测结果详见图16a,ta克隆的结果详见图16b。流式检测tn-muc1car的表达结果见图16c。

在常规细胞上同时实现基因过表达和多基因敲除

以hek293t细胞为例，本发明在真核生物细胞同时实现基因的过表达和多基因敲除。本发明同时在hek293t细胞上敲除胞内蛋白gata3和细胞膜表面蛋白pd1，并同时过表达tn-muc1car基因。具体操作步骤请参照在常规细胞上同时实现基因过表达和单基因敲除的具体操作步骤。

基因敲除效率以及外源基因表达效率的检测方法请参照普通细胞检测的方法，t7en1的检测结果详见图17a，ta克隆的检测结果详见图17b。流式检测tn-muc1car的表达结果见图17c。

在人的t细胞上同时实现基因过表达和多基因敲除

以人的t细胞为例，本发明在原代细胞同时实现基因的过表达和多基因敲除。本发明同时在humant细胞上敲除胞内蛋白gata3和细胞膜表面蛋白pd1，并同时过表达tn-muc1car基因。具体操作步骤请参照在常规细胞上同时实现基因过表达和单基因敲除的具体操作步骤。

基因敲除效率以及外源基因表达效率的检测方法请参照普通细胞检测的方法，t7en1的检测结果以及ta克隆的检测结果详见图18a，b。流式检测tn-muc1car的表达结果见图18c。

　　序列表

<110>王小平

<120>无物种限制的真核生物同时进行基因敲除和基因过表达

<160>10

<210>1

<211>4451

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ccctagaaagataatcatattgtgacgtacgttaaagataatcatgtgtaaaattgacgc60

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