专利名称：人白细胞介素-12的编码基因、真核宿主细胞和表达方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及人白细胞介素-12 (IL-12)的编码基因、真核宿主细胞和表达方法，具体而言，本发明涉及对人白细胞介素-12的编码基因进行优化，从而能够使IL-12在真核宿主细胞，特别是中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)中稳定高效表达，尤其是在无血清条件下稳定闻效表达。
背景技术：
白细胞介素-12(IL-12)于1989年和1990由Trinchieri和Gately等发现，起初命名为NK细胞刺激因子(NKSF)和细胞毒淋巴细胞成熟因子(CLMF)，1991年统一命名为白介素-12。白细胞介素-12是一种70kDa的异二聚体，由两条共价连接的多肽链组成，一条为 35kDa(P35亚基)，另一条为40kDa(P40亚基)。P35亚基由多种细胞产生，包括T、B淋巴细胞、NK细胞和大单核细胞等，而P40链主要由激活的单核细胞和B细胞产生，P35和P40单独存在时均无任何IL-12的生物活性。IL-12具有调节和参与免疫应答细胞的活性，刺激NK细胞和T细胞产生干扰素-伽玛(IFN-Y)，促进Thl细胞的分化，是连接固有免疫和获得性免疫的核心因子。同时，IL-12可促进造血功能的恢复，用于机体造血功能的降低导致的疾病，如急性放射病、放射性治疗、化学治疗等。另外，IL-12还具有抗肿瘤，抗病毒的效果，具有良好的临床应用前景。在目前报道的利用真核细胞表达产生重组IL-12的方法中，重组IL-12的表达强度仍不令人满意。以下表I列出了现有技术相关技术的培养条件和最高产量。
公开U发明名称培养条敁“产-M:
CNH)2268407A 一种 rWL42 1: 细胞大_核疋 iull #!!基5mg/L
权利要求
1.人白细胞介素-12的编码基因，其特征在于，所述编码基因包含 (a).编码人白细胞介素-12的P35亚基的核苷酸序列SEQID NO :9或其互补核苷酸序列以及编码人白细胞介素-12的P40亚基的SEQ ID NO 10或其互补核苷酸序列；或者 (b).编码人白细胞介素-12的P35亚基的核苷酸序列SEQID NO :21或其互补核苷酸序列以及编码人白细胞介素-12的P40亚基的SEQ ID NO 22或其互补核苷酸序列。
2.如权利要求I所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因包含编码P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO 9以及编码P40亚基的SEQ ID NO :10。
3.如权利要求I所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因包含编码P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO 21以及编码P40亚基的SEQ ID NO :22。
4.一种表达人白细胞介素-12的真核宿主细胞，其特征在于，所述真核宿主细胞包含 (a).具有编码P35亚基的核苷酸序列SEQID NO :9或其互补核苷酸序列的第一表达载体和具有编码P40亚基的核苷酸序列SEQ ID NO 10或其互补核苷酸序列的第二表达载体；或者 (b).具有编码P35亚基的核苷酸序列SEQID NO :21或其互补核苷酸序列的第一表达载体和具有编码P40亚基的核苷酸序列SEQ ID NO 22或其互补核苷酸序列的第二表达载体。
5.如权利要求4所述的真核宿主细胞，其特征在于，所述真核宿主细胞包含具有编码P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO :9的第一表达载体和具有编码P40亚基的SEQ ID NO: 10的第二表达载体。
6.如权利要求4所述的真核宿主细胞，其特征在于，所述真核宿主细胞包含具有编码P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO 21的第一表达载体和具有编码P40亚基的SEQ ID NO 22的第二表达载体。
7.如权利要求4 6中任一项所述的真核宿主细胞，其特征在于,所述真核宿主细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，优选为CH0-DG44或CH0-3E7细胞。
8.如权利要求4 6中任一项所述的真核宿主细胞,其特征在于，所述第一表达载体为pGN-35 质粒。
9.如权利要求4 6中任一项所述的真核宿主细胞，其特征在于，所述第二表达载体为PCDNA3. I 质粒。
10.一种人白细胞介素-12的表达方法，其特征在于，所述方法包括 (a).分别构建包含编码P35亚基的核苷酸序列SEQID NO :9或其互补核苷酸序列的pGN-35质粒和包含编码P40亚基的核苷酸序列SEQ ID NO :10或其互补核苷酸序列的P⑶NA3. I质粒；或者 (b)分别构建包含编码P35亚基的核苷酸序列SEQID NO 21或其互补核苷酸序列的pGN-35质粒和包含编码P40亚基的核苷酸序列SEQ ID NO :22或其互补核苷酸序列的PCDNA3. I 质粒 然后用步骤(a)或(b)中的pGN-35质粒和pCDNA3. I质粒共转染真核宿主细胞，优选为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，更优选为CH0-DG44或CH0-3E7细胞。
全文摘要
本发明提供了人白细胞介素-12的编码基因、真核宿主细胞和表达方法。具体而言，本发明的人白细胞介素-12的编码基因包含(a).编码人白细胞介素-12的P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO9或其互补核苷酸序列以及编码人白细胞介素-12的P40亚基的SEQ ID NO10或其互补核苷酸序列；或者(b).编码人白细胞介素-12的P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO21或其互补核苷酸序列以及编码人白细胞介素-12的P40亚基的SEQ ID NO22或其互补核苷酸序列。本发明的核苷酸序列能够使IL-12在真核宿主细胞，特别是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中稳定高效表达，尤其是在无血清条件下稳定高效表达。
文档编号C12N15/85GK102876684SQ20121034502
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月17日 优先权日2012年9月17日
发明者赵毅, 李友海, 章方良, 柳振宇 申请人:青岛康立泰药业有限公司