专利名称：一种获取循环肿瘤单细胞的方法
技术领域：
本发明涉及循环肿瘤细胞检测领域。
背景技术：
美国肿瘤协会于2006年发表的年度报告指出，目前全世界范围内每3人中就有I 人在其一生中会患有某种肿瘤，而且在发展中国家，随着污染程度的增加，患病几率还会高于1/3的比例。
目前全世界用于肿瘤诊断的方法可归为三大类病理学(活检切片)；影像学(超声、X光、CT或PET等)和血清学(血清肿瘤相关蛋白，如CA-125、CA-199或CEA等)，但所有这些方法都有不可避免的缺点，例如灵敏性及特异性差和过于依赖医生的主观判断等。因此目前临床急需一种能够为医生及病人提供准确，快速的肿瘤检测手段。经过长时间的大量研究，美国FDA认证的人外周血循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell,简称CTC)检测目前已被公认为最好及最客观的检测手段之一。目前已有越来越多的国内外医生开始应用此技术作为肿瘤检查的重要辅助手段。不仅于此，CTC检测也被公认为是目前国外新近流行的肿瘤治疗方法一即阻断肿瘤细胞入血转移的唯一有效检测指标。除了上述CTC可作为肿瘤检测手段外，CTC还被证明可成功应用于以下一系列其它方面的用途(I)体内化疗药物药效的快速评估相对于每12周一查的CT诊断，CTC在第2周即可显示药效结果，这一点对临床医生及挽救病人生命尤为重要；(2)根据CTC数目，判断病人愈后状况及存活时间 美国Immunicon/Veridex (Johnson & Johnson)公司经过在数百肿瘤病人标本上的严格验证，已可根据治疗前后的CTC数目变化准确地预测乳腺癌、结直肠癌及前列腺癌病人的存活时间，这一点已被美国FDA认证接受，开始在美国众多医院中被广泛应用；(3)肿瘤病人复发的监测与及时诊断绝大多数的肿瘤复发从根本上讲实际就是肿瘤转移过程，因而通过对治疗后的病人CTC的持续检测，可以达到监测病人肿瘤复发的目的；(4)个体化治疗的体外肿瘤治疗药物筛选；及(5)正常人群体检普查以利于尽可能的肿瘤早期诊断等。除了应用于临床外，CTC亦可应用于众多药厂和科研机构的基础研究，包括寻找新的肿瘤标记物以及开发新的抗肿瘤药物等。
目前美国FDA已于2004年认证了美国上市公司Immunicon/Veridex的CTC检测技术及其临床应用，该技术目前已应用于美国多家医院的循环肿瘤细胞检测。
但是，Immunicon/Veridex的检测技术存在显而易见的缺陷。该技术分离检测肿瘤细胞主要是基于肿瘤细胞表面的一种特定标志物。但众所周知，此肿瘤细胞表面标志物随着肿瘤细胞病理性生长及肿瘤细胞的入血而异常表达。而且，此特定标志物在细胞表面的表达量也因肿瘤不同而差异极大，包括高表达与不表达。所有这些使得该技术在很多情况下捕获不到肿瘤细胞，从而限制了该技术的广泛普及与应用。发明内容
本发明提供一种便于进行循环肿瘤细胞检测和研究的获取循环肿瘤单细胞的方法。
本发明提供一种获取循环肿瘤单细胞的方法，包括如下步骤
a)富集体液样本中的循环肿瘤细胞；
b)识别出所述循环肿瘤细胞；
c)分离出单个循环肿瘤细胞。
通过去除体液样本中的非循环肿瘤细胞物质，来提高循环肿瘤细胞的浓度，起到富集循环肿瘤细胞的作用。在富集后的体液样本中，识别筛选出循环肿瘤细胞；将识别筛选出的循环肿瘤细胞一个个分离出来，便于后续的检测和研究。
体液一般指细胞外液。
进一步的，所述步骤a)中，通过去除所述体液样本中的白细胞和红细胞来富集所述循环肿瘤细胞。
进一步的，所述步骤a)中，通过离心技术去除所述体液样本中的红细胞，通过抗体磁珠标记技术去除所述体液样本中的白细胞。
进一步的，所述步骤b)中，利用免疫荧光染色法，用上皮细胞特异性标志识别出所述循环肿瘤细胞。
进一步的，所述步骤b)中，利用微流控芯片，通过比较肿瘤细胞和正常细胞的粒径大小来识别出所述循环肿瘤细胞。
进一步的，所述步骤b)中，利用肿瘤细胞表面标志和荧光原位杂交法识别出所述循环肿瘤细胞。
进一步的，所述步骤c)中，利用微吸管分离出单个循环肿瘤细胞。
本发明的有益效果是通过将体液样本中的循环肿瘤细胞一个个单独分离出来, 从而便于后续的检测和科学研究。
具体实施方式
下面通过具体实施方式
对本发明作进一步详细说明。
一种获取循环肿瘤单细胞的方法，首先，利用差减法在体液样本中富集循环肿瘤细胞(CTC);接着，识别出循环肿瘤细胞；最后，分离出单个循环肿瘤细胞。
在一种实施方式中，该方法包括如下步骤a)利用现有离心技术去掉肿瘤患者体液样本中的红细胞，利用现有抗体磁珠标记技术移除白细胞，从而在该体液样本中富集循环肿瘤细胞；b)通过免疫荧光染色法，用上皮细胞特异性标志识别出循环肿瘤细胞；c)采用微吸管，在荧光显微镜下操作，吸出单个循环肿瘤细胞。分离出的单个循环肿瘤细胞即可用于肿瘤分析检测或其他科学研究。
本实施方式中，抗体磁珠标记技术即利用荧光标记抗体包被的磁珠与白细胞偶联，来去除体液样本中的白细胞。由于白细胞含有单核细胞、粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞等，可以利用不同的抗体组合来去除白细胞。
本实施方式中，微吸管的直径一般为微米级。吸出操作时，可以采用人工用嘴轻吸的方式。由于采用微吸管，可以有效的控制吸力，使吸力不会过大。
在另一种实施方式中，该方法包括如下步骤a)利用离心技术去除肿瘤患者体液样本中的红细胞，利用抗体磁珠标记技术去除体液样本中的白细胞，从而在该体液样本中富集循环肿瘤细胞山)采用微流控芯片，通过比较肿瘤细胞和正常细胞的粒径大小来识别出循环肿瘤细胞；c)分离出单个循环肿瘤细胞。
本实施方式中，正常细胞具有粒径范围，通过比较肿瘤细胞的粒径和该粒径范围， 如该粒径在该粒径范围之外,则是肿瘤细胞。
在又一种实施方式中，该方法包括如下步骤a)在体液样本中富集循环肿瘤细胞山)利用现有肿瘤细胞表面标志和荧光原位杂交法识别出泌尿系统肿瘤细胞；c)采用微吸管，在荧光显微镜下操作，吸出单个循环肿瘤细胞。分离出的单个循环肿瘤细胞即可用于肿瘤分析检测或其他科学研究。
本实施方式中，识别泌尿系统肿瘤细胞时,泌尿系统肿瘤细胞表面标志如膀胱癌的OCT、FGFR3或Ras基因、如肾癌的VHL基因等。具体识别时，可以使用膀胱癌特异性表面标志识别膀胱癌细胞，如以0CT4、FGFR3或Ras等多基因作为多个靶点进行识别，即能够利用两个或两个以上的特异性表面标志进行识别鉴定。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
权利要求
1.一种获取循环肿瘤单细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤 a)富集体液样本中的循环肿瘤细胞； b)识别出所述循环肿瘤细胞； c)分离出单个循环肿瘤细胞。
2.如权利要求1所述的一种获取循环肿瘤单细胞的方法，其特征在于，所述步骤a)中，通过去除所述体液样本中的白细胞和红细胞来富集所述循环肿瘤细胞。
3.如权利要求2所述的一种获取循环肿瘤单细胞的方法，其特征在于，所述步骤a)中，通过离心技术去除所述体液样本中的红细胞,通过抗体磁珠标记技术去除所述体液样本中的白细胞。
4.如权利要求2所述的一种获取循环肿瘤单细胞的方法，其特征在于，所述步骤b)中，利用免疫荧光染色法，用上皮细胞特异性标志识别出所述循环肿瘤细胞。
5.如权利要求2所述的一种获取循环肿瘤单细胞的方法，其特征在于，所述步骤b)中，利用微流控芯片，通过比较肿瘤细胞和正常细胞的粒径大小来识别出所述循环肿瘤细胞。
6.如权利要求2所述的一种获取循环肿瘤单细胞的方法，其特征在于，所述步骤b)中，利用肿瘤细胞表面标志和荧光原位杂交法识别出所述循环肿瘤细胞。
7.如权利要求1-6中任意一项所述的获取循环肿瘤单细胞的方法，其特征在于，所述步骤c)中，利用微吸管分离出单个循环肿瘤细胞。
全文摘要
本发明公开了一种获取循环肿瘤单细胞的方法，包括如下步骤a)富集体液样本中的循环肿瘤细胞；b)识别出所述循环肿瘤细胞；c)分离出单个循环肿瘤细胞。通过将体液样本中的循环肿瘤细胞一个个单独分离出来，从而便于后续的检测和科学研究。
文档编号C12N5/09GK103031276SQ20121034423
公开日2013年4月10日 申请日期2012年9月17日 优先权日2012年9月17日
发明者孙小娟, 吴松, 蔡志明 申请人:孙小娟, 吴松, 蔡志明