肿瘤循环dna kras突变检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肿瘤循环DNA KRAS突变检测方法。
【背景技术】
[0002] 基于外周血循环DNA的高通量测序的突变检测特异性强、灵敏度高。通过外周血 循环DNA KRAS的突变检测，可以避免过度治疗及其带来的潜在副作用的影响，而其他患者 可进行更为积极的治疗。进一步可以构建动力进化数学模型来确定个人化的癌症最佳治疗 方案。
[0003] K-ras是一种原癌基因，长约35kb，位于12号染色体，是RAS基因家族成员之 一，编码K-ras蛋白，与肿瘤的生成、增殖、迀移、扩散以及血管生成均有关系。K-ras基因 (K-ras，p21)家族与人类肿瘤相关的基因有三种--H_ras、K_ras和N_ras，分别定位在 11、12和1号染色体上。K-ras基因因编码21kD的ras蛋白又名p21基因。在ras基因 中，KRAS对人类癌症影响最大，它好像分子开关：当正常时能控制调控细胞生长的路径；发 生异常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。它参与细胞内的信号传递，当KRAS 基因突变时，该基因永久活化，不能产生正常的ras蛋白，使细胞内信号传导紊乱，细胞增 殖失控而癌变。研宄表明约30%的人类恶性肿瘤与RAS基因突变有关，ras突变后的产物 可以一直处于活化状态。在白血病、肺癌、直肠癌和胰腺癌中，KRAS突变均很常见，其中直 肠癌中30% -35%患者有突变。其与肿瘤细胞的生存、增殖、迀移、扩散和血管生成均有关 系。KRAS基因分为突变型和野生型，常见突变位点为KRAS基因2号外显子的12号密码子 和 13 号密码子上，其中有 7 个突变热点：G12C(GGT>TGT)、G12R(GGT>AGT)、G12S(GGT>CGT)、 G12V(GGT>GTT)、G12D(GGT>GAT)、G12A(GGT>GCT)、G13D(GGC>GAC)。这 7 种突变占到了 90% 以上。
[0004] 检测KRAS基因突变是深入了解癌基因的情况、了解各种癌症的发展预后、放化疗 疗效的重要指标。2009年7月20日，美国食品药品监督管理局（FDA)公布了对表皮生长 因子受体（EGFR)靶向药物使用说明书的修改版本，其中明确阐述了用于相关癌症治疗的 EGFR受体抑制剂药效与KRAS基因密切相关性，并要求使用该类药物前进行KRAS基因突变 检测以帮助医生判断适用人群。FDA此次更新了 Amgen公司生产的维克替比（Vectibix，帕 尼单抗Panitumumab)和ImClone公司生产的爱必妥（Erbitux，西妥昔单抗Cetuximab)药 品说明书中"使用指南"和"临床研宄"部分。注明如果患者肿瘤细胞中KRAS基因的12或 13密码子发生突变，那么该患者就不会从EGFR抑制剂类药物的治疗中获益，所以不推荐发 生KRAS基因突变的患者使用此类药物。同时，中华人民共和国卫生部于2010年10月14日 发表了《结直肠癌诊疗规范（2010版）》（卫办医政发（2010) 165号）。规范指出，在人群中 进行早期疾病用药基因筛查诊疗对于预防结直肠癌发生、防止向晚期发展、治疗以及降低 结直肠癌死亡率有重要作用。该规范明确指出在患者确定为复发或转移性结直肠癌接受爱 必妥、帕尼单抗时，必须检测肿瘤组织的K-ras基因状态。现在在欧美等发达国家，K-RAS 基因检测已经成为大肠癌患者治疗前必做的常规检查，是目前医生了解大肠癌患者癌基因 状况最直接、最有效的方法，并且成为能否报销相关抗EGFR治疗费用的依据。
[0005] 针对患者组织标本进行一代测序，基于该结果进行用药指导是目前通用方案。但 是在实际临床治疗过程中，观察到对KRAS基因野生型的患者采用西妥昔单抗治疗一段时 间后出现耐药性。这种耐药性是如何产生的呢？现有研宄表明癌症可能源于体细胞突变， 癌症基因在突变体细胞内不断累积，后者也逐渐完成了自身的进化。有研宄者认为单一细 胞的基因组学研宄是癌症进化研宄的重点，其可以破解癌症突变的顺序及时间，为人们理 解癌症突变、耐药的机制提供很好的思路。但我们认为单细胞测序不能帮助我们了解和解 析个体患者的独特特征所构成的复杂体系。常规测序分型的鉴定方式无法达到高灵敏度检 测到混杂样品中突变位点发生的低比例突变，更加无法达到精确定量，而在放化疗的"自然 压力"下，这种"适应性情况"中，某些极低突变随着肿瘤进展而暂时增加，而正是这种"趋 同进化"导致了耐药性的产生。有研宄者认为应该通过动力进化数学模型来确定个人化的 癌症最佳治疗方案。医生不可能针对同一患者多次取得组织样本，因此通过外周血进行无 创或微创成为必然的选择。而本发明将为此提供有效指导方案。
【发明内容】
[0006] 本发明公开了一种通过针对肿瘤循环DNA的二代高通量测序检测KRAS第二外显 子基因突变的检测方法，以克服传统测序方法灵敏度不足的缺点。
[0007] 具体而言，本发明使用SEQIDNO:3和/或4所示的引物实施所述检测方法。
[0008] 因此，本发明提供SEQ ID NO:3和4所示的引物序列。
[0009] 本发明还提供一种序列组合，该组合包括SEQ ID NO:3和4。
[0010] 本发明还提供一种检测外周血循环DNA中KRAS基因突变的方法，该方法包括使用 SEQ ID NO: 3和/或4进行扩增，并对扩增产物进行测序，从而检测该KRAS基因的12和/ 或13密码子是否存在突变。
[0011] 本发明还提供一种判断肿瘤患者，尤其是大肠癌（例如结直肠癌）患者能否从 EGFR抑制剂类药物的治疗中获益的方法，该方法包括使用SEQ ID NO: 3和/或4扩增患者 外周血循环DNA中的KRAS基因，并对扩增产物进行测序，从而检测该KRAS基因的12和/ 或13密码子是否存在突变；其中，如果患者肿瘤细胞中KRAS基因的12和/或13密码子存 在突变，那么该患者不会从EGFR抑制剂类药物的治疗中获益。
[0012] 在一个具体实施例中，所述突变选自：
[0013] (1)G12C(GGT>TGT)；
[0014] (2)G12R(GGT>AGT)；
[0015] (3)G12S(GGT>CGT)；
[0016] (4)G12V(GGT>GTT)；
[0017] (5)G12D(GGT>GAT)；
[0018] (6)G12A(GGT>GCT);和
[0019] (7)G13D(GGC>GAC) 〇
[0020] 本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒含有SEQ ID N0:3和/或4所示的引物序列。
[0021] 本发明的试剂盒可用于实施上述方法。
[0022] 试剂盒中还可含有适合进行PCR的试剂，以及指导技术人员使用所述引物实施上 述方法的说明书。
[0023] 本发明还提供SEQ ID NO:3和/或4在制备试剂盒中的用途。所述试剂盒可用 于：
[0024] (1)检测外周血循环DNA中KRAS基因的12和/或13密码子是否存在突变；
[0025] (2)判断肿瘤患者，尤其是直肠癌患者能否从EGFR抑制剂类药物的治疗中获益；
[0026] (3)避免对肿瘤患者的过度治疗及其带来的潜在副作用的影响；
[0027] (4)用于辅助诊断白血病、肺癌、大肠癌（例如结直肠癌）和胰腺癌；和
[0028] (5)用于检测肿瘤细胞的生存、增殖、迀移、扩散和血管生成。
【具体实施方式】
[0029] 本发明基于外周血循环DNA中KRAS基因突变的检测，可判断肿瘤患者，尤其是大 肠癌患者（如结直肠癌患者）能否从EGFR抑制剂类药物的治疗中获益。
[0030] 本发明使用SEQ ID NO:3和/或4所示的引物进行所述外周血循环DNA中KRAS 基因突变的检测。优选的，本发明使用SEQ ID NO:3和4所示的引物进行所述检测。
[0031] 检测通常包括使用SEQ ID NO:3和/或4进行扩增，并对扩增产物进行测序，从而 检测该KRAS基因的12和/或13密码子是否存在突变。
[0032] 检测结