专利名称：肿瘤修复基因突变的荧光实时pcr检测方法及试剂系统的制作方法
技术领域：
本发明属于检测技术领域，具体涉及一种肿瘤修复基因突变的荧光实时PCR检测方法 及试剂系统。
技术背景肿瘤是多因素疾病，许多因素可以引起细胞的DNA损伤。正常情况下，机体具有自我 修复损伤的能力。但如果这种修复能力下降则会引发肿瘤的产生。随着社会的发展和环境 的污染，以及吸烟率的增高，肺癌已经成为许多国家癌症死亡的首位原因。目前关于肺癌 的研究主要集中在基因修复方面。很多因素可以导致基因损伤，如，辐射，烷化剂等。对 于不同的损伤基因修复的方式也不同，同时，又有许多种修复基因参与基因的修复过程中。 DNA修复是对损伤的主要生物学反应，促使DNA中损伤的、不合适的或错配的碱基恢复本来 的生物化学过程，维持遗传物质的稳定。一基因修复的主要方式1 NER (核苷酸切除修复)主要修复累积性损伤，是人类最主要和最重要的DNA损伤修复方式。包括连续性损伤 的识别、染色质的重塑、在受损的DNA两端切开形成切口、切除受损的寡核苷酸、填补缺 口连接DNA链。此过程有30多个蛋白参与，包括的修复基因主要有ERCC1 (剪切修复交叉互 补组l)、 ERCC2(剪切修复交叉互补组2，亦称XPD)。吸烟导致的细胞DNA损伤主要通过NER 途径来修复。2 DSB (DNA双链断裂修复) DNA双链断裂主要由于复制错误或外源因素(离子辐射等)所致，由同源性重组和非同源性DNA末端连接完成修复。参与的修复基因中与肿瘤放射敏感性密切相关的基因主要有 XRCC3 (X线交叉互补组3)。大量研究已经证明，机体DNA修复能力的降低使机体发生各种肿瘤的风险大大增加。 DNA损伤修复能力的降低可能导致肺癌的形成。然而，降低的DNA修复能力却有利于铂-DNA 加合物持续的抗肿瘤活性。换句话说，增高的DNA修复能力会增加抗药性，这对于患者的 药物治疗方面是不利的。因此，在癌的易感性和对药物的抗性方面，DNA修复被认为是一 个"双刃刀"。人们研究还发现，基因的多态性的分布与种族差异而不同，且与肿瘤的形成 有关。人们又发现不同的基因型与治疗的预后也有关联。例如，XRCC3 Met241Met在预测用gem/cis治疗的年轻的NSCLC患者的生存方面是一个易于评估和有力的预测指标。综上所 述，基因的多态性不仅与肿瘤的形成和对药物的敏感性有关，还可以用来判断预后。临床 上可以根据患者不同的个体，制定最佳的治疗方案，从而做到个体化治疗。二实时荧光定量PCR试剂系统是由前端引物，后端引物，探针组成，与普通常规PCR 相比，有很高的特异性，敏感性高，通常达102拷贝/ml,其检测范围广，且重复性好，以CT 值为阈，能更精确的反映起始模板的拷贝数,可有效的解决模板污染的风险。T叫man探针检 测的是积累荧光。常用的荧光基团有FAM， TET， VIC， HEX等等。当探针完整的时候，由于 3'端的荧光淬灭基团在吸收5'端报告基团所发射的荧光能量，本身会发射波长不同的荧 光而导致本底高，因此TaqMan探针近来又有新的发展——TaqMan MGB探针。MGB探针的淬 灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher),本身不产生荧光，可以大大降 低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团，可以将 探针的Tm值提高10C左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通T叫Man探针设计 得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高——因为在模板的DNA碱 基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明，TaqMan MGB探针对于富 含A/T的模板可以区分得更为理想。本发明基于以上技术原理，以ERCC1等肿瘤修复基因突变位点为目的基因，自主设计 一系列成套特异性寡核苷酸探针序列和引物序列，采用荧光实时定量PCR技术方法，用于 突变位点的检测。 发明内容本发明的目的在于创立一套用于肿瘤相关修复基因突变的荧光实时PCR检测方法及试 剂系统。本发明提出的肿瘤相关修复基因突变的PCR检测方法，是以肿瘤相关修复基因为检测的 目的基因，使用专门设计的特异性寡核苷酸引物序列和水解探针，采用Taqman-MGB检测试 剂系统，通过荧光实时定量PCR方法，对肿瘤相关基因的特点位点突变进行检测。本发明中所述的的肿瘤相关基因是指ERCC1基因及其突变基因位点，ERCC2基因及其 突变基因位点，XRCC3基因及其突变基因位点。所述的特异性寡核苷酸探针序列和引物序列如下引物序列至少包括下述之一种，以及由该引物序列采用任意表记方法或者修饰方法而 生成的寡核苷酸衍生物引物名称 寡核苷酸序列 针对ERCC1基因GGAATTACGTCGCCAAATTCC GCAATCCCGTACTGAAGTTCGTGAGACGGACGCCCACCT GGAGGCGGGAAAGGGACT CCCTCTCCCTTTCCTCTGTTCT CACTCAGAGCTGCTGAGCAATC或者:ERCC1-118FP ERCC1-118RP 针对ERCC2基因 ERCC2-312FP ERCC2-312RP ERCC2-751FP ERCC2-751RP 针对XRCC3基因 XRCC3-241FP XRCC3-241RP 探针至少包括下述-酸衍生物 探针名称 针对ERCC1基因 ERCC1-118FAM(C) ERCC1-118FAM(T) 针对ERCC2基因 ERCC2-312FAM(C) ERCC2-312FAM(T) ERCC2-751FAM(T) ERCC2-751層(G) 针对XRCC3基因XRCC3-241FAM(C) FAM-TCACGCAGCGTGGCCCCC-MGBXRCC3-241FAM(T) FAM-CACGCAGCATGGCCCCCAG-MGB 其中，FAM代表FAM基团(荧光素基团)，MGB代表MGB基团(淬光基因)，其中FAM可用其他任 意用于标记的荧光素替代，如HEX，TET等(1) 在ERCC1基因的片段SEQ.ID.N01中的突变位点(〉表示错配突变) ERCC1: 19007 C〉T(2) 在ERCC2基因的片段SEQ. ID.N02中的突变位点(〉表示错配突变) ERCC2: 23591 G〉A(3) 在ERCC2基因的片段SEQ.ID.N03中的突变位点(〉表示错配突变)ATGGCTCGCCTGGTGGT CCCTGCCTTGGTGCTCAC -种，以及由该探针采用任意标记方法或修饰方法而生成的寡核苷寡核苷酸及标记集团FAM-CAGGGCACGTTGCG-MGB FAM-CAGGGCACATTGC-MGB層-CTTCGTCGGGCAGCA-MGB FAM-TGCTGCCCAACGAA-MGB FAM-CTATCCTCTTCAGCGTCT-MGB FAM- CTATCCTCTGCAGCGTCT-MGB或者:ERCC2: 35931 A>C(4)在XRCC3基因的片段SEQ. ID.N04中的突变位点(〉表示错配突变) XRCC3: 18067 C〉T本发明所述Ta卿an-MGB荧光实时检测试剂系统是指包含有本方法所涉及的任何寡核 苷酸引物序列和探针序列的荧光实时定量PCR系统，下述组成一和组成二组成 组成一Taqman-MGB实时定量PCR试剂系统 (2) 5XPCR反应缓冲液50-250mmol/LTris Cl (20。C下PH8.3-8.8) 訓陽500mmol/L KC1 0.5-25mmol/L MgCI2 25mmol/L 二硫苏糖醇 0.25-2.5% Triton X-100(2) dNTP0.5-15mmol/L各种dNTP(3) 前端引物和后端引物 由前面所述引物序列合成的引物，各种引物浓度范围:20-200mmol/L(6) 探针由前面所述探针序列合成的探针,探针浓度范围:20-200mmol/L(7) 热启动DNA聚合酶 酶使用量在0.5-5U组成二:DNA提取系统标本DNA提取方法以酚/氯仿法、小量柱式离心法或其他方法提取 本发明所涉及的ERCC1,ERCC2和XRCC3基因突变及其突变类型的检测方法具体操作如下本方法的检测标本种类包括手术标本，活检标本，外周血，胸腹水，石蜡包埋组织等本方法的检测目的基因包括ERCC1， ERCC2和XRCC3本方法所涉及的设备包括台式高速离心机，超净工作台，荧光定量PCR仪本发明方法的基本步骤1. 标本的处理及其DNA抽提 手术标本和活检标本标本量活检肿瘤标本，手术肿瘤标本5 — 50mg。采用下述方法之一抽提DNA(1) 酚/氯仿DNA抽提纯化法(2) 微量柱式离心法(3) 其他简化抽提方法 外周血和胸腹水标本量外周血2-5ml，胸腹水2-5ml，均使用非抗凝管。采用下述方法之一抽提DNA(1) 酚/氯仿DNA抽提纯化法(2) 微量柱式离心法(3) 其他简化抽提方法 石蜡包埋组织标本量3-5片5-IO陶厚的石蜡包埋组织切片。采用下述方法之一抽提DNA(1) 改良的酚/氯仿DNA抽提纯化法(2) Gpel氏石蜡包埋组织DNA提取法2. Taqman-MGB荧光实时定量PCR方法反应系统组分包含本发明所涉及的任何寡核苷酸引物序列和探针序列 本发明使用的反应体系如下(1) PCR反应缓冲液20-50腿ol/L Tris Cl (20 。C下PH8.3-8.8),80-160腿ol/L KCl,0.8-5腿ol/L MgCl2,25mmol/L 二硫苏糖醇,0.5-2.0% Triton X-100(2) dNTP: 0.5-2.0mmol/L各种dNTP(3) 前端引物和后端引物如前面所述引物序列合成的引物，引物浓度范围:20-200mmol/L(4) 探针如前面所述的探针序列合成的探针，探针浓度范围80-150mmol/L(5) 热启动DNA聚合酶酶使用量在0.5-5U扩增条件实时荧光定量PCR仪，采用如下参数94°C， l-5分钟94。Cl-5秒，60。C5-30秒,30-50循环。 本发明涉及的用途包括(1)用于肿瘤相关修复基因的突变检测。肿瘤相关修复基因具体指ERCC1, ERCC2， XRCC3。具体突变指肿瘤相关修复基因的错配突变(2)用于肿瘤患者的临床个体化用药方案的指导及分子靶向抗肿瘤药物的指导用药。 分子靶向抗肿瘤药物包括易瑞沙(Iressa),阿瓦斯汀(Arastin),格列卫(Glivec) ， Tarceva 等具体实施方式
实施例l:外周血DNA基因组DNA抽提法的ERCC1， ERCC2, XRCC3的突变检测(1) 标本DNA抽提采集外周静脉血2ml， 5000r/min离心3分钟，移去上层血清。取 下层血移入离心管、加入PBS缓冲液溶解、12000r/min离心15分钟、倒去上层、加入SDS、 蛋白酶K、 37'C摇床过夜，再用酚一氯仿抽提DNA、无水乙醇沉淀、75%乙醇洗漆，自然干 燥，最后融入200ijL TE液中。一2(TC冰箱保存。(2) Taqman-MGB荧光实时定量PCR检测突变使用下述反应体系-5XPCR Buffer dNTP MixtureMg Solution 0.514 XRCC3-241FPXRCC3-241RP 0.5 WXRCC3-241FAM(C) 0.5WXRCC3-241FAM(T) 0.5W(另外一管)ExTaqHS 0,2514标本基因组DNA 1M1ddH20 补充至25W若检测ERCC2 G23591A基因突变，则加入ERCC2-312FP引物，ERCC2-312RP引物 及探针ERCC2-312FAM(C)， ERCC2-312FAM(T)若检测ERCC2A35931C基因突变，则加入ERCC2-751FP引物，ERCC2-751RP引物及 探针ERCC2-751 FAM(T) ， ERCC2-751 FAM(G)若检测ERCC2 A35931C基因突变，则加入ERCC2-751FP引物，ERCC2-751RP引物及 探针ERCC2-751FAM(T)， ERCC2-751FAM(G)若检测ERCC1 C19007T基因突变，则加入ERCC1-118FP引物，ERCC1-118RP引物及 探针ERCC1-118FAM(C) ， ERCC1陽118FAM(T)扩增条件实时荧光定量PCR仪，采用如下参数94°C， 1-5分钟94。Cl-5秒，60°C5-30秒，30-50循环。检测结果选取的20例基因组DNA，(其中16例为野生纯和子，3例为杂合子，l例为突 变纯和子)检测与XRCC3-241FAM(C)， XRCC3-241FAM(T)的反应情况。其中野生纯 和子与XRCC3-241FAM(C)反应有特异性扩增曲线出现，杂合子与XRCC3-241FAM(C)， XRCC3-241FAM(T)反应时都有特异性扩增曲线出现，突变纯和子只与 XRCC3-241FAM(T)反应有特异性扩增曲线出现。检测结论能够准确分辨出XRCC3 C18067T位点的基因突变，根据基因突变指导临 床用药。实施例2:肿瘤标本基因组DNA抽提法的ERCC1， ERCC2， XRCC3的突变检测(1) 标本DNA抽提酚/氯仿DNA纯化法。取肿瘤标本2-10mg，倒入液氮，研磨成粉末， 加入lml分裂缓冲液(10mmol/LTris. CLPH7. 5， 10隱ol/LNaCL， 25臓ol/LEDTA);加入O. lml 1(mSDS,混匀;加入O. lmg蛋白酶K， 37。C水浴2-4小时，直到组织块完全分解。2500rpm离 心20秒，取上清至新离心管。再用酚一氯仿抽提DNA、无水乙醇沉淀、75%乙醇洗涤，自 然干燥，最后融入200fjL TE液中。一20'C冰箱保存。(2) Taqman-MGB荧光实时定量PCR检测突变 使用下述反应体系5XPCR BufferdNTP Mixture 0.75W Mg Solution 0.5rt XRCC3-241FP 0.514 XRCC3-241RP 0.514 XRCC3陽241FAM(C)XRCC3隱241FAM(T) 0.5W(另外一管) ExTaqHS 0.2514标本基因组DNA 1M1 ddH20 补充至25W。若检测ERCC2 G23591A基因突变，则加入ERCC2-312FP引物，ERCC2-312RP引物及 探针ERCC2陽312FAM(C) ， ERCC2-312FAM(T)。若检测ERCC2 A35931C基因突变，则加入ERCC2-751FP引物，ERCC2-751RP引物及 探针ERCC2-751 FAM(T) ， ERCC2-751 FAM(G)。若检湖UERCC2 A35931C基因突变，则加入ERCC2-751FP引物，ERCC2-751RP引物 及探针ERCC2陽751FAM(T)， ERCC2陽751FAM(G)。若检领!]ERCC1 C19007T基因突变，则加入ERCC1-118FP引物，ERCC1-118RP引物 及探针ERCC1-118FAM(C) ， ERCC1-118FAM(T)。扩增条件实时荧光定量PCR仪，采用如下参数94°C， l-5分钟94。Cl-5秒，6(TC5-30秒，30-50循环。检测结果选取的20例基因组DNA，(其中16例为野生纯和子，3例为杂合子，l例为突 变纯和子)检测与XRCC3-241FAM(C)， XRCC3-241FAM(T)的反应情况。其中野生纯和子 与XRCC3-241FAM(C)反应有特异性扩增曲线出现，杂合子与XRCC3-241FAM(C), XRCC3-241FAM(T)反应时都有特异性扩增曲线出现，突变纯和子只与XRCC3-241FAM(T) 反应有特异性扩增曲线出现。检测结论能够准确分辨出XRCC3 C18067T位点的基因突变，根据基因突变指导临 床用药。序列表SEQ. ID.恥1:TCCCTATTGATGGCTTCTGCCCTTCGTCCCTCCCCAGAGGGGCAATCCCGTACTGMGTTCGTGCGCAMraSTODO微BsffimiTi紘'孤lCGGGCCCGG SEQ. ID.恥3:GGTGAGTGCAGCCATGTGGTGTGTGCACCTCTGTGCAGGTGCCAGGGGCACAGC
权利要求
1、一种肿瘤修复基因突变的实时PCR检测方法，该方法以检测肿瘤修复基因为目的，使用针对肿瘤修复基因的专门设计的特异性寡核苷酸引物序列和水解探针，采用Taqman-MGB检测试剂系统，通过荧光实时定量PCR方法，对肿瘤修复基因的特定位点进行检测；所述的肿瘤修复基因包括ERCC1，ERCC2，XRCC3基因；所述的特异性寡核苷酸引物序列至少包括下述之一种，以及由该引物序列采用任意表记方法或者修饰方法而生成的寡核苷酸衍生物引物名称 寡核苷酸序列ERCC1-118FPGGAATTACGTCGCCAAATTCCERCC1-118RPGCAATCCCGTACTGAAGTTCGTERCC2-312FPGAGACGGACGCCCACCTERCC2-312RPGGAGGCGGGAAAGGGACTERCC2-751FPCCCTCTCCCTTTCCTCTGTTCTERCC2-751RPCACTCAGAGCTGCTGAGCAATCXRCC3-241FPATGGCTCGCCTGGTGGTXRCC3-241RPCCCTGCCTTGGTGCTCAC所述水解探针至少包括下述一种，以及由该探针采用任意标记方法或修饰方法而生成的寡核苷酸衍生物探针名称寡核苷酸及标记集团ERCC1-118FAM(C)FAM-CAGGGCACGTTGCG-MGBERCC1-118FAM(T)FAM-CAGGGCACATTGC-MGBERCC2-312FAM(C)FAM-CTTCGTCGGGCAGCA-MGBERCC2-312FAM(T)FAM-TGCTGCCCAACGAA-MGBERCC2-751FAM(T)FAM-CTATCCTCTTCAGCGTCT-MGBERCC2-751FAM(G)FAM-CTATCCTCTGCAGCGTCT-MGBXRCC3-241FAM(C)FAM-TCACGCAGCGTGGCCCCC-MGBXRCC3-241FAM(T)FAM-CACGCAGCATGGCCCCCAG-MGB其中，FAM代表FAM基团，MGB代表MGB基团；而且FAM可用其他任意用于标记的荧光素替代；所述的Taqman-MGB检测试剂系统，由以下两部分构成一Taqman-MGB实时定量PCR试剂系统(1)5XPCR反应缓冲液50-250mmol/L Tris·Cl(20℃下PH8.3-8.8)100-500mmol/L KCl0.5-25mmol/L MgCl225mmol/L二硫苏糖醇0.25-2.5％Triton X-100；(2)dNTP0.5-15mmol/L各种dNTP；(3)前端引物和后端引物由所述引物序列合成的引物，各种引物浓度范围20-200mmol/L；(4)探针由所述水解探针序列合成的探针，探针浓度范围20-200mmol/L；(5)热启动DNA聚合酶酶使用量在0.5-5U；二DNA提取系统标本DNA提取方法以酚/氯仿法、小量柱式离心法或其他方法提取。
全文摘要
本发明属药物疗效检测技术领域，具体涉及一种肿瘤相关基因突变的实时PCR检测方法及试剂系统。本发明针对肿瘤个体化治疗相关的肿瘤修复基因XRCC3，ERCC1和ERCC2作为检测的目的基因，使用专门设计的特异性寡核苷酸引物序列和水解探针，采用Taqman-MGB检测试剂系统，通过荧光实时定量PCR方法，对肿瘤相关基因的特点位点突变进行检测，试剂系统是指包含本发明所涉及的任何特异性寡核苷酸序列和探针的实时荧光定量PCR试剂系统。本发明可用于临床个体化用药方案的效果检测。
文档编号G01N21/00GK101266207SQ20071004650
公开日2008年9月17日 申请日期2007年9月27日 优先权日2007年9月27日
发明者周彩存, 颉 张, 张增利 申请人:上海市肺科医院