专利名称：一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法
技术领域：
本发明涉及分析方法应用研究领域中的毛细管电泳检测方法，尤其涉及一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法。
背景技术：
基因突变的检测在临床疾病诊断中起着十分重要的作用。目前，筛查基因点突变常常采用以PCR为基础的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳与各种基因突变检测技术相结合的方法，这些方法在满足临床快速检测基因突变的需要时有一定的局限性。因此建立一种准确快速地用于临床诊断的基因突变检测方法势在必行。毛细管电泳(CE)是一种新型电泳与色谱相结合的分离分析技术，具有分离效率高、分析速度快、样品用量少、应用范围广等特点，广泛应用于分子生物学、分子医学和生命科学等方面。CE与各种基因突变检测技术例如SSCP(单链构象多态性检测)、RFLP(限制性内切酶片段长度多态性)相结合时，在突变基因检测方面显示了无可比拟的优越性。在 1984 2010年中国专利数据库中记载了申请号为200510026931. X的中国专利《一种肿瘤相关基因突变的PCR检测方法及试剂系统》、专利号为200910042599. 4的中国专利《用于恶性肿瘤个体化用药相关基因突变检测的基因芯片及其应用》、申请号为200810005523. X的中国专利《检测基因突变的方法》、申请号为201010134207. X的中国专利《APC基因突变的快速检测》申请号为200910201917. 7的中国专利《一种用于检测K-ras基因突变的引物及其应用》，上述专利仅仅公开了采用实时定量荧光PCR、测序、高分辨率溶解曲线法、荧光双环探针技术等基因突变检测方法对组织中或血液中肿瘤基因突变进行了检测，而采用毛细管电泳结合SSCP、RFLP用于检测血液中肿瘤突变基因的方法及应用却未见文献报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、重现性好的用于检测血液中肿瘤突变基因的方法。为解决上述问题，本发明所述的一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，包括以下步骤(1)含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制将聚环氧乙烷加入IXTBE缓冲液中， 使最终溶液浓度为2. 5 3. 5%、pH值为7. 5 9. 0后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用0. 22um或0. 45um水系微孔滤膜过滤后，即得到聚环氧乙烷筛分介质；(2)血液样品中基因组DNA提取在血液样品中加入Tris缓冲液I裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液II将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，55 57°C水浴孵育2 他；孵育结束后加入酚-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水乙醇，得到沉淀DNA ；该沉淀DNA经室温自然干燥至恒重时，即得基因组DNA ；所述Tris缓冲液I与所述血液样品的体积比为1 2 3;所述Tris缓冲液II与所述血液样品的体积比为1 0.5 1;所述蛋白酶K与所述血液样品的体积比为1 0.03 0.05;所述酚-氯仿与所述血液样品的体积比为1 1 1.5;所述无水乙醇与所述血液样品的体积比为 1 1. 5 2. 0 ；(3)需检测基因目的片段扩增将所述基因组DNA作为扩增模板，采用pp5设计 P53基因及k-ras基因目的片段扩增引物，进行常规PCR扩增，即得p53基因PCR扩增样品和k-ras基因PCR扩增样品；(4)样品处理将p53基因PCR扩增样品和k_ras基因PCR扩增样品经94 97°C 变性8 IOmin后，冰浴5 lOmin，得到变性DNA样品溶液；或分别在p53基因PCR扩增样品、在k-ras基因PCR扩增样品中加入三蒸水、Tango缓冲液，并在p53基因PCR扩增样品中加入Msp I内切酶、在k-ras基因PCR扩增样品中加入BstN I内切酶，在37°C孵育4 8h,在80°C灭活15 20min后，得到酶切DNA样品溶液；所述p53基因PCR扩增样品、k_ras 基因PCR扩增样品分别与三蒸水、Tango缓冲液的体积比为1 1. 5 1. 8 0. 2 0. 3 ； 所述P53基因PCR扩增样品与所述Msp I内切酶的体积比为1 0. 1 0. 2 ；所述k_ras基因PCR扩增样品与所述BstN I内切酶的体积比为1 0. 1 0. 2 ；(5)样品检测①在17 22ul变性DNA样品溶液中分别加入10 X STOR Green I荧光染料、所述步骤(2)所得的基因组DNA，混勻后加入去离子水至体系为30 50 μ 1 ；然后，使用毛细管电泳仪压力系统自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为10 20kv、温度为15 20°C的条件下采用负极-IOkv电动进样的方式进行CE-SSCP检测即可；②在17 22ul酶切DNA样品溶液中分别加入10 X STOR Green I荧光染料、所述步骤(2)所得的基因组DNA，混勻后加入去离子水至体系为30 50 μ 1 ；然后，使用毛细管电泳仪压力系统自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为10 20kv、温度为15 20°C的条件下采用负极-IOkv电动进样的方式进行CE-RFLP检测即可。所述步骤(1)中的IXTBE缓冲液是指将在800毫升去离子水中分别加入三羟甲基氨基甲烷(Tris) 10. 8克、硼酸5. 5克、乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)0. 74克经搅拌溶解后，加去离子水将溶液定容至1升所得的缓冲液。所述步骤O)中的血液样品是指胃癌、肺癌患者及正常人外周静脉血液样品。所述步骤⑵中的Tris缓冲液I是指由pH值为8. O且lOmmol/L的Tris-HCl缓冲液、10mmol/L的氯化钾、10mmol/L的氯化镁、pH值为8. 0且2mmol/L的EDTA和25mL/L的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)混合而成的缓冲液。所述步骤(2)中的Tris缓冲液II是指由pH值为8. 0且10mmol/L的Tris-HCl缓冲液、10mmol/L的氯化钾、10mmol/L的氯化镁、pH值为8. 0且2mmol/L的EDTA、0. 4mol/L氯化钠和10g/L十二烷基硫酸钠(SDQ混合而成的缓冲液。所述步骤O)中的酚-氯仿是指将饱和酚与氯仿等体积混合所得的溶液。所述步骤(3)中的扩增条件为94°C变性30s，50 60°C退火30s，72°C延伸30s， 共行30个循环。所述步骤(4)中的Tango缓冲液是指由33mM三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐 (Tris-acetate)、IOmM 醋酸镁(Mg-acetate)、66mM 醋酸钾(K-acetate)、0. lmg/ml N，0_ 双三甲硅基乙酰胺(BSA)混合后，加去离子水定容至1升所得的缓冲液；所述三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐(Tris-acetate)的pH值为7.9，温度为37°〇。
所述步骤(5)中10 X STOR Green I荧光染料与所述基因组DNA样品的体积比为 1 3 1 4。本发明与现有技术相比具有以下优点1、本发明采用毛细管电泳结合SSCP、RFLP突变检测技术，与传统平板电泳检测基因突变相比较，具有良好的温度控制系统，能有效控制温度在15 20°C，从而保证了检测结果的准确性和重现新。2、本发明以含有IXTBE缓冲液的聚环氧乙烷(PEO)作为筛分介质，具有良好分离效能，可完成对血液样品中肿瘤突变基因的检测(参见图2、图3、图4、图5、图6、图7、图8、 图9)。同时，选用了 10XSTOR green I作为荧光染料，有效提高了检测的灵敏度。3、本发明操作简单、快速简便、样品用量少、结果直观可靠、重现性好，可广泛应用于临床血液样品中肿瘤突变基因的检测。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细的说明。图1为本发明实施例1的毛细管电泳图。图2为本发明实施例2的毛细管电泳图。图3为本发明实施例2的毛细管电泳图。图4为本发明实施例2的毛细管电泳图。图5为本发明实施例2的毛细管电泳图。图6为本发明实施例3的毛细管电泳图。图7为本发明实施例3的毛细管电泳图。图8为本发明实施例3的毛细管电泳图。图9为本发明实施例3的毛细管电泳图。图10为本发明实施例4的毛细管电泳图。图11为本发明实施例4的毛细管电泳图。图12为本发明实施例4的毛细管电泳图。图13为本发明实施例4的毛细管电泳图。图14为本发明实施例5的毛细管电泳图。图15为本发明实施例5的毛细管电泳图。图16为本发明实施例5的毛细管电泳图。图17为本发明实施例5的毛细管电泳图。
具体实施例方式实施例1 一种用于检测血液样品中肿瘤突变基因的方法，用于pUC19 DNA/Msp I / Hpa II DNA Marker 的分离。(1)含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制将聚环氧乙烷加入1 X TBE缓冲液中，使最终溶液浓度为3. 0 %、pH值为8. 3后，并用河南巩义市予华仪器有限责任公司生产的DF-101S型磁力搅拌器以400转/分钟的速率搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用0. 45um水系微孔滤膜过滤后，即得到聚环氧乙烷筛分介质。其中1 XTBE缓冲液是指将在800毫升去离子水中分别加入上海生物工程公司生产的三羟甲基氨基甲烷(Tris) 10. 8克、上海生工公司生产的硼酸5. 5克、上海生工公司生产的乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)O. 74克经搅拌溶解后，加去离子水将溶液定容至1升所得的缓冲液。该方法在分离pUC19 DNA/Msp I /Hpa II DNA Marker中的应用，包括以下步骤①使用毛细管电泳仪(P/ACE 5000，美国Beckman公司)，在分离时使用压力为 IOpsi (磅/平方英寸)的压力系统自动填充含TBE的聚环氧乙烷筛分介质。②将10 X SYBR Green I的荧光染料(厦门百信威公司提供)与pUC19 DNA/ Msp I /Hpa II DNA Marker (BBI公司提供)按4 1的体积比混勻，以-10KV负极电动进样 10s，然后加入去离子水至体系为30 50 μ 1。③在分离电压为15kV、电泳温度为15°C下进行电泳分离。其分离电泳图参见图1，共得到11个色谱峰。图中1为^bp ；2为34bp ；3为67bp ； 4 为 110 和 Illbp ;5 为 147bp ；6 为 190bp ；7 为 242bp ；8 为 331bp ；9 为 404bp ；10 为 489bp ； 11 为 501bp。从图中可以看出，该方法对不同长度DNA片段进行了良好的分离。实施例2 —种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，包括以下步骤(1)含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制将聚环氧乙烷加入1 X TBE缓冲液中，使最终溶液浓度为2. 5 %、pH值为8. 0后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用0. 22um水系微孔滤膜过滤后，即得到聚环氧乙烷筛分介质。其中1 X TBE缓冲液同实施例1。(2)血液样品中基因组DNA提取在血液样品中加入Tris缓冲液I裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液II将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，55°C水浴孵育4h;孵育结束后加入酚-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水乙醇，冰浴lh，IOOOOrmp离心2min，得到沉淀DNA ； 该沉淀DNA经室温自然干燥至恒重时，即得基因组DNA。Tris缓冲液I与血液样品的体积比为1 2 ；Tris缓冲液II与血液样品的体积比为1 0.5 ；蛋白酶K与血液样品的体积比为1 0.03 ；酚-氯仿与血液样品的体积比为 1 1 ；无水乙醇与血液样品的体积比为1 1.5。其中血液样品是指胃癌患者外周静脉血液样品。Tris缓冲液I是指由pH值为8. 0且IOmmol/L的Tris-HCl缓冲液、10mmol/L的氯化钾、10mmol/L的氯化镁、pH值为8. 0且2mmol/L的EDTA和25mL/L的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)混合而成的缓冲液。Tris缓冲液II是指由pH值为8. 0且10mmol/L的Tris-HCl缓冲液、IOmmol/L的氯化钾、10mmol/L的氯化镁、pH值为8. 0且2mmol/L的EDTA、0. 4mol/L氯化钠和10g/L十二烷基硫酸钠(SDQ混合而成的缓冲液。酚-氯仿是指将饱和酚与氯仿等体积混合所得的溶液。(3)需检测基因目的片段扩增将基因组DNA作为扩增模板，采用pp5设计p53基因及k-ras基因目的片段扩增引物，进行常规PCR扩增，即得p53基因PCR扩增样品和k-ras 基因PCR扩增样品。其中扩增条件为94°C变性30s，50 60°C退火30s，72°C延伸30s，共行30个循环。(4)样品处理分别取p53基因PCR扩增样品和k_ras基因PCR扩增样品各22ul， 在96°C变性lOmin，立即冰浴5min，得到变性DNA样品溶液。(5)样品检测在20ul变性DNA样品溶液中分别加入10X STOR Green I荧光染料、步骤(2)所得的基因组DNA，10XSTOR Green I荧光染料与基因组DNA样品的体积比为 1 3。混勻后加入去离子水至体系为30 50 μ 1;然后，使用毛细管电泳仪压力系统自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为13kv、温度为15°C的条件下采用负极-IOkv 电动进样的方式进行CE-SSCP检测即可。其分离电泳图参见图2、图3、图4、图5。图2、图3分别为p53基因正常对照和肿瘤样品CE-SSCP检测电泳图；图4、图5分别为k-ras基因正常对照和肿瘤样品CE-SSCP检测电泳图。图中1为未变性完全双链DNA，2，3为变性所得正常单链DNA，4为变性所得异常单链DNA。从图中可以看出，该用于血液中肿瘤突变基因检测方法对双链DNA、单链DNA均能得到良好的分离。实施例3 —种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，包括以下步骤(1)含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制将聚环氧乙烷加入IXTBE缓冲液中，使最终溶液浓度为2. 5%、pH值为7. 5后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用0. 22um水系微孔滤膜过滤后，即得到聚环氧乙烷筛分介质。其中1 X TBE缓冲液同实施例1。(2)血液样品中基因组DNA提取在血液样品中加入Tris缓冲液I裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液II将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，56°C水浴孵育孵育结束后加入酚-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水乙醇，冰浴lh，IOOOOrmp离心2min，得到沉淀DNA ； 该沉淀DNA经室温自然干燥至恒重时，即得基因组DNA。Tris缓冲液I与血液样品的体积比为1 2. 5 ;Tris缓冲液II与血液样品的体积比为1 0.55 ；蛋白酶K与血液样品的体积比为1 0.04;酚-氯仿与血液样品的体积比为1 1.2 ；无水乙醇与血液样品的体积比为1 1.7。其中血液样品是指胃癌患者外周静脉血液样品。Tris缓冲液I、Tris缓冲液II、酚-氯仿同实施例2。(3)需检测基因目的片段扩增将基因组DNA作为扩增模板，采用pp5设计p53基因及k-ras基因目的片段扩增引物，进行常规PCR扩增，即得p53基因PCR扩增样品和k-ras 基因PCR扩增样品。其中扩增条件同实施例2。(4)样品处理分别取p53基因PCR扩增样品和k_ras基因PCR扩增样品各22ul， 在94°C变性9min，立即冰浴7min，得到变性DNA样品溶液。
(5)样品检测在17ul变性DNA样品溶液中分别加入10X STOR Green I荧光染料、步骤(2)所得的基因组DNA，10X STOR Green I荧光染料与基因组DNA样品的体积比为1 3.5。混勻后加入去离子水至体系为30 50 μ 1 ；然后，使用毛细管电泳仪压力系统自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为10kv、温度为20°C的条件下采用负极-IOkv电动进样的方式进行CE-SSCP检测即可。分离电泳图参见图6、图7、图8、图9。图6、图7分别为p53基因正常对照和肿瘤样品CE-SSCP检测电泳图；图8、图9分别为k-ras基因正常对照和肿瘤样品CE-SSCP检测电泳图。图中1为未变性完全双链DNA，2，3为变性所得正常单链DNA，4，5为变性所得异常单链DNA。其中图9中k-ras基因发生缺失只检测到一条单链。从图中可以看出，该用于血液中肿瘤突变基因检测方法对双链DNA、单链DNA均能得到良好的分离。实施例4 一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，包括以下步骤(1)含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制将聚环氧乙烷加入1 X TBE缓冲液中，使最终溶液浓度为2. 5 %、pH值为8. 5后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用0. 35um水系微孔滤膜过滤后，即得到聚环氧乙烷筛分介质。其中1 X TBE缓冲液同实施例1。(2)血液样品中基因组DNA提取在血液样品中加入Tris缓冲液I裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液II将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，55°C水浴孵育4h;孵育结束后加入酚-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水乙醇，冰浴lh，IOOOOrmp离心2min，得到沉淀DNA ； 该沉淀DNA经室温自然干燥至恒重时，即得基因组DNA。 Tris缓冲液I与血液样品的体积比为1 2 ；Tris缓冲液II与血液样品的体积比为1 0.5 ；蛋白酶K与血液样品的体积比为1 0.03 ；酚-氯仿与血液样品的体积比为 1 1 ；无水乙醇与血液样品的体积比为1 1.5。其中血液样品是指胃癌患者外周静脉血液样品。Tris缓冲液I、Tris缓冲液II、酚-氯仿同实施例2。(3)需检测基因目的片段扩增将基因组DNA作为扩增模板，采用pp5设计p53基因及k-ras基因目的片段扩增引物，进行常规PCR扩增，即得p53基因PCR扩增样品和k-ras 基因PCR扩增样品。其中扩增条件同实施例2。(4)样品处理分别取p53基因PCR扩增样品和k_ras基因PCR扩增样品各22ul， 在97°C变性8min，立即冰浴lOmin，得到变性DNA样品溶液。(5)样品检测在22ul变性DNA样品溶液中分别加入10X STOR Green I荧光染料、步骤(2)所得的基因组DNA，10XSTOR Green I荧光染料与基因组DNA样品的体积比为 1 3。混勻后加入去离子水至体系为30 50 μ 1;然后，使用毛细管电泳仪压力系统自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为20kv、温度为18°C的条件下采用负极-IOkv 电动进样的方式进行CE-SSCP检测即可。其分离电泳图参见图10、图11、图12、图13。图10、图11分别为p53基因正常对照和肿瘤样品CE-RFLP检测电泳图；图12、图13分别为k_ras基因正常对照和肿瘤样品 CE-RFLP检测电泳图。其中图10经酶切所得53bp和147bp两条片段，图11可见由于突变未能酶切开所得的200bp单一片段。其中图12经酶切所得45bp和117bp两条片段，图13 可见由于突变未能酶切开所得的162bp单一片段。从图中可以看出，该用于血液中肿瘤突变基因检测方法对酶切肿瘤及正常对照样品均能得到良好的分离。实施例5 —种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，包括以下步骤(1)含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制将聚环氧乙烷加入IXTBE缓冲液中，使最终溶液浓度为3. 5%、pH值为9. 0后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用0. 45um水系微孔滤膜过滤后，即得到聚环氧乙烷筛分介质。其中1 X TBE缓冲液同实施例1。(2)血液样品中基因组DNA提取在血液样品中加入Tris缓冲液I裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液II将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，57°C水浴孵育Ml;孵育结束后加入酚-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水乙醇，冰浴lh，IOOOOrmp离心2min，得到沉淀DNA ； 该沉淀DNA经室温自然干燥至恒重时，即得基因组DNA。Tris缓冲液I与血液样品的体积比为1 3;Tris缓冲液II与血液样品的体积比为1 1 ；蛋白酶K与血液样品的体积比为1 0.05;酚-氯仿与血液样品的体积比为 1 1.5 ；无水乙醇与血液样品的体积比为1 2.0。其中血液样品是指肺癌患者外周静脉血液样品。Tris缓冲液I ,Tris缓冲液II、酚_氯仿同实施例2。(3)需检测基因目的片段扩增将基因组DNA作为扩增模板，采用pp5设计p53基因及k-ras基因目的片段扩增引物，进行常规PCR扩增，即得p53基因PCR扩增样品和k-ras 基因PCR扩增样品。其中扩增条件同实施例2。(4)样品处理分别在p53基因PCR扩增样品、在k-ras基因PCR扩增样品中加入三蒸水、Tango缓冲液，并在p53基因PCR扩增样品中加入Msp I内切酶、在k_ras基因PCR 扩增样品中加入BstN I内切酶，在37°C孵育4 他，在80°C灭活15 20min后，得到酶切 DNA样品溶液。其中=Tango缓冲液是指由33mM三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐(Tris-acetate)、 IOmM 醋酸镁(Mg-acetate)、66mM 醋酸钾(K-acetate)、0· lmg/ml N, 0_ 双三甲硅基乙酰胺(BSA)混合后，加去离子水定容至1升所得的缓冲液。三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐 (Tris-acetate)的 pH 值为 7. 9，温度为 37 V。p53基因PCR扩增样品、k-ras基因PCR扩增样品分别与三蒸水、Tango缓冲液的体积比为1 1.8 0. 3 ;p53基因PCR扩增样品与Msp I内切酶的体积比为1 0. 2 ;k-ras 基因PCR扩增样品与BstN I内切酶的体积比为1 0.2。(5)样品检测在22ul酶切DNA样品溶液中分别加入10X STOR Green I荧光染料、步骤(2)所得的基因组DNA，10XSTOR Green I荧光染料与基因组DNA样品的体积比为1 4。混勻后加入去离子水至体系为30 50 μ 1;然后，使用毛细管电泳仪压力系统自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为Mkv、温度为18°C的条件下采用负极-IOkv 电动进样的方式进行CE-RFLP检测即可。其分离电泳图参见图14、图15、图16、图17。图14、图15分别为p53基因正常对照和肿瘤样品CE-RFLP检测电泳图；图16、图17分别为k_ras基因正常对照和肿瘤样品 CE-RFLP检测电泳图。其中图14经酶切所得87bp和94bp两条片段，图15可见由于突变未能酶切开所得的ISlbp单一片段。其中图16经酶切所得39bp和136bp两条片段，图17可见由于突变未能酶切开所得的175bp单一片段。从图中可以看出，该用于血液中肿瘤突变基因检测方法对酶切肿瘤及正常对照样品均能得到良好的分离。实施例6 —种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，包括以下步骤(1)含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制将聚环氧乙烷加入1 X TBE缓冲液中，使最终溶液浓度为3. 5 %、pH值为9. 0后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用0. 45um水系微孔滤膜过滤后，即得到聚环氧乙烷筛分介质。其中1 X TBE缓冲液同实施例1。(2)血液样品中基因组DNA提取在血液样品中加入Tris缓冲液I裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液II将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，57°C水浴孵育Ml;孵育结束后加入酚-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水乙醇，冰浴lh，IOOOOrmp离心2min，得到沉淀DNA ； 该沉淀DNA经室温自然干燥至恒重时，即得基因组DNA。Tris缓冲液I与血液样品的体积比为1 3 ;Tris缓冲液II与血液样品的体积比为1 1 ；蛋白酶K与血液样品的体积比为1 0.05;酚-氯仿与血液样品的体积比为 1 1.5 ；无水乙醇与血液样品的体积比为1 2.0。其中血液样品是指肺癌患者外周静脉血液样品。Tris缓冲液I ,Tris缓冲液II、酚_氯仿同实施例2。(3)需检测基因目的片段扩增将基因组DNA作为扩增模板，采用pp5设计p53基因及k-ras基因目的片段扩增引物，进行常规PCR扩增，即得p53基因PCR扩增样品和k-ras 基因PCR扩增样品。其中扩增条件同实施例2。(4)样品处理分别在p53基因PCR扩增样品、在k-ras基因PCR扩增样品中加入三蒸水、Tango缓冲液，并在p53基因PCR扩增样品中加入Msp I内切酶、在k_ras基因PCR 扩增样品中加入BstN I内切酶，在37°C孵育4 他，在80°C灭活15 20min后，得到酶切 DNA样品溶液。其中=Tango缓冲液同实施例5。p53基因PCR扩增样品、k-ras基因PCR扩增样品分别与三蒸水、Tango缓冲液的体积比为1 1.5 0. 2 ;p53基因PCR扩增样品与Msp I内切酶的体积比为1 0. 1 ;k-ras 基因PCR扩增样品与BstN I内切酶的体积比为1 0. 1。(5)样品检测在17ul酶切DNA样品溶液中分别加入10XSTOR Green I荧光染料、步骤(2)所得的基因组DNA，10XSTOR Green I荧光染料与述基因组DNA样品的体积比为1 3。混勻后加入去离子水至体系为30 50 μ 1;然后，使用毛细管电泳仪压力系统自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为10kv、温度为20°C的条件下采用负极-IOkv电动进样的方式进行CE-RFLP检测即可。实施例7 —种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，包括以下步骤(1)含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制将聚环氧乙烷加入1 X TBE缓冲液中，使最终溶液浓度为3. 5 %、pH值为9. 0后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用0. 45um水系微孔滤膜过滤后，即得到聚环氧乙烷筛分介质。其中1 X TBE缓冲液同实施例1。(2)血液样品中基因组DNA提取在血液样品中加入Tris缓冲液I裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液II将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，57°C水浴孵育Mi;孵育结束后加入酚-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水乙醇，冰浴lh，IOOOOrmp离心2min，得到沉淀DNA ； 该沉淀DNA经室温自然干燥至恒重时，即得基因组DNA。Tris缓冲液I与血液样品的体积比为1 3 ;Tris缓冲液II与血液样品的体积比为1 1 ；蛋白酶K与血液样品的体积比为1 0.05;酚-氯仿与血液样品的体积比为 1 1.5 ；无水乙醇与血液样品的体积比为1 2.0。其中血液样品是指肺癌患者外周静脉血液样品。Tris缓冲液I ,Tris缓冲液II、酚_氯仿同实施例2。(3)需检测基因目的片段扩增将基因组DNA作为扩增模板，采用pp5设计p53基因及k-ras基因目的片段扩增引物，进行常规PCR扩增，即得p53基因PCR扩增样品和k-ras 基因PCR扩增样品。其中扩增条件同实施例2。(4)样品处理分别在p53基因PCR扩增样品、在k-ras基因PCR扩增样品中加入三蒸水、Tango缓冲液，并在p53基因PCR扩增样品中加入Msp I内切酶、在k_ras基因PCR 扩增样品中加入BstN I内切酶，在37°C孵育4 他，在80°C灭活15 20min后，得到酶切 DNA样品溶液。其中=Tango缓冲液同实施例5。p53基因PCR扩增样品、k-ras基因PCR扩增样品分别与三蒸水、Tango缓冲液的体积比为1 1.6 0.25 ;p53基因PCR扩增样品与Msp I内切酶的体积比为1 0.15; k-ras基因PCR扩增样品与BstN I内切酶的体积比为1 0.15。(5)样品检测在20ul酶切DNA样品溶液中分别加入10X STOR Green I荧光染料、步骤(2)所得的基因组DNA，10XSTOR Green I荧光染料与所述基因组DNA样品的体积比为1 3.5。混勻后加入去离子水至体系为30 50 μ 1 ；然后，使用毛细管电泳仪压力系统自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为20kv、温度为15°C的条件下采用负极-IOkv电动进样的方式进行CE-RFLP检测即可。
权利要求
1.一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，包括以下步骤(1)含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制将聚环氧乙烷加入IXTBE缓冲液中，使最终溶液浓度为2. 5 3. 5 %、pH值为7. 5 9. 0后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用 0. 22um或0. 45um水系微孔滤膜过滤后，即得到聚环氧乙烷筛分介质；(2)血液样品中基因组DNA提取在血液样品中加入Tris缓冲液I裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液II将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，55 57°C水浴孵育 2 他；孵育结束后加入酚-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水乙醇， 得到沉淀DNA ；该沉淀DNA经室温自然干燥至恒重时，即得基因组DNA ；所述Tris缓冲液 I与所述血液样品的体积比为1 2 3;所述Tris缓冲液II与所述血液样品的体积比为1 0.5 1 ；所述蛋白酶K与所述血液样品的体积比为1 0.03 0.05;所述酚-氯仿与所述血液样品的体积比为1 1 1.5;所述无水乙醇与所述血液样品的体积比为 1 1. 5 2. 0 ；(3)需检测基因目的片段扩增将所述基因组DNA作为扩增模板，采用pp5设计p53基因及k-ras基因目的片段扩增引物，进行常规PCR扩增，即得p53基因PCR扩增样品和k-ras 基因PCR扩增样品；(4)样品处理将p53基因PCR扩增样品和k-ras基因PCR扩增样品经94 97°C变性 8 IOmin后，冰浴5 lOmin，得到变性DNA样品溶液；或分别在p53基因PCR扩增样品、 在k-ras基因PCR扩增样品中加入三蒸水、Tango缓冲液，并在p53基因PCR扩增样品中加入Msp I内切酶、在k-ras基因PCR扩增样品中加入BstN I内切酶，在37°C孵育4 他， 在80°C灭活15 20min后，得到酶切DNA样品溶液；所述p53基因PCR扩增样品、k_ras基因PCR扩增样品分别与三蒸水、Tango缓冲液的体积比为1 1. 5 1. 8 0. 2 0. 3 ；所述p53基因PCR扩增样品与所述Msp I内切酶的体积比为1 0. 1 0. 2 ；所述k_ras基因PCR扩增样品与所述BstN I内切酶的体积比为1 0. 1 0. 2 ；(5)样品检测①在17 22ul变性DNA样品溶液中分别加入10XSTORGreen I荧光染料、所述步骤(2)所得的基因组DNA，混勻后加入去离子水至体系为30 50 μ 1 ；然后，使用毛细管电泳仪压力系统自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为10 20kv、温度为15 20°C的条件下采用负极-IOkv电动进样的方式进行CE-SSCP检测即可；②在17 22ul酶切DNA样品溶液中分别加入10XSTOR Green I荧光染料、所述步骤(2)所得的基因组DNA，混勻后加入去离子水至体系为30 50 μ 1 ；然后，使用毛细管电泳仪压力系统自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为10 20kv、温度为15 20°C的条件下采用负极-IOkv电动进样的方式进行CE-RFLP检测即可。
2.如权利要求1所述的一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，其特征在于所述步骤(1)中的IXTBE缓冲液是指将在800毫升去离子水中分别加入三羟甲基氨基甲烷 10. 8克、硼酸5. 5克、乙二胺四乙酸二钠盐0. 74克经搅拌溶解后，加去离子水将溶液定容至 1升所得的缓冲液。
3.如权利要求1所述的一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，其特征在于所述步骤O)中的血液样品是指胃癌、肺癌患者及正常人外周静脉血液样品。
4.如权利要求1所述的一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，其特征在于所述步骤(2)中的Tris缓冲液I是指由pH值为8. 0且IOmmol/L的Tris-HCl缓冲液、IOmmol/ L的氯化钾、10mmol/L的氯化镁、pH值为8. O且2mmol/L的EDTA和25mL/L的聚乙二醇辛基苯基醚混合而成的缓冲液。
5.如权利要求1所述的一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，其特征在于所述步骤(2)中的Tris缓冲液II是指由pH值为8. O且IOmmol/L的Tris-HCl缓冲液、IOmmol/ L的氯化钾、10mmol/L的氯化镁、pH值为8. O且2mmol/L的EDTA、0. 4mol/L氯化钠和IOg/ L十二烷基硫酸钠混合而成的缓冲液。
6.如权利要求1所述的一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，其特征在于所述步骤O)中的酚-氯仿是指将饱和酚与氯仿等体积混合所得的溶液。
7.如权利要求1所述的一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，其特征在于所述步骤(3)中的扩增条件为94°C变性30s，50 60°C退火30s，72°C延伸30s，共行30个循环。
8.如权利要求1所述的一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，其特征在于所述步骤⑷中的Tango缓冲液是指由33mM三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐、IOmM醋酸镁、66mM 醋酸钾、0. lmg/ml N, 0-双三甲硅基乙酰胺混合后，加去离子水定容至1升所得的缓冲液； 所述三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐的PH值为7.9，温度为37°C。
9.如权利要求1所述的一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，其特征在于所述步骤(5)中10XSTOR Green I荧光染料与所述基因组DNA样品的体积比为1 3 1 4。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，该方法包括以下步骤(1)配制含TBE的聚环氧乙烷筛分介质；(2)提取血液样品中基因组DNA；(3)需检测基因目的片段扩增将基因组DNA作为扩增模板，进行常规PCR扩增，即得p53基因PCR扩增样品和k-ras基因PCR扩增样品；(4)样品处理将p53基因PCR扩增样品和k-ras基因PCR扩增样品经变性或酶切后分别得到变性样品溶液、酶切样品溶液；(5)样品检测分别在变性样品溶液和酶切样品溶液中加入10×SYBR Green I荧光染料与基因组DNA，混匀后加入去离子水至体系为30～50μl；然后，使用毛细管电泳仪压力系统自动填充聚环氧乙烷筛分介质，分别进行CE-SSCP或CE-RFLP检测即可。本发明操作简单、重现性好。
文档编号G01N27/447GK102251046SQ201110218578
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月29日 优先权日2011年7月29日
发明者王荣, 谢华, 谢希辉, 贾正平 申请人:王荣