一种检测cpt1b基因突变的引物及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测CPTlB基因突变的引物、方法和试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 肉毒喊掠桐醜转移酶 IB (Carnitine Palmitoyltransferase IB, CPT1B)位于骨骼· 肌细胞线粒体外膜上，是脂肪酸氧化的第1个限速酶，能够催化从酰基辅酶A将酰基转移至 L-肉毒碱而形成酰基肉毒碱的反应，在长链脂肪酸从细胞浆转运到线粒体进行氧化的过程 中起重要作用。CPTlB基因全长10610个核苷酸，定位于22ql3. 33染色体上，含有18个编 码外显子，编码772个氨基酸肽链。CPT-IB基因突变引起CPT-IB功能缺陷，肉碱依赖的转 运系统功能将遭到破坏，从肌肉细胞浆转运到线粒体的长链脂肪酸减少，长链脂肪酸不能 被氧化，故血清游离脂肪酸增高，肌肉组织中大量脂肪聚集，从而引起一系列生化紊乱。
[0003] 目前仅发现3种与疾病相关的CPTlB基因突变，主要为错义突变，也包括1种内含 子与外显子交界区的剪切点突变。
[0004] 对于CPTlB基因突变的检测通常为针对某一个突变进行检测，尚未有关于利用多 个特异性引物对CPTlB基因多个突变同时进行测定的报道。
【发明内容】
[0005] 针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种检测CPTlB基因突变的引物和试剂 盒。
[0006] 本发明的另一目的是提供一种非诊断目的检测CPTlB基因的全部编码外显子及 外显子/内含子交界区突变的方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0008] 一种检测CPTlB基因突变的引物，包括扩增CPTlB基因18个编码外显子及外显子 /内含子交界区的引物，其引物序列如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 26所示，具体如下：
[0009] CPTlB-Pl-F :5' - ACGCACGGACAGGAGTGAAC-3, ；（SEQ ID NO. 1)
[0010] CPTlB-Pl-R :5' - CTCTCCTGATGCCCTGCTGT-3' ；（SEQ ID NO. 2)
[0011] CPT1B-P2-F :5' - AGGAGCCAGTTCCCAAGACT-3' ；（SEQ ID NO. 3)
[0012] CPT1B-P2-R :5' - TGGCTGCTGTCCTGTATCTG-3' ；（SEQ ID NO. 4)
[0013] CPT1B-P3-F :5' - TTGTCTTAGCCCTACATCCG-3' ；（SEQ ID NO. 5)
[0014] CPT1B-P3-R:5' -GAAACCAACCAGCAACTCC-3' ；（SEQ ID N0.6)
[0015] CPT1B-P4-F :5' - AGGGTCTCAGGGAGTTGCT-3' ；（SEQ ID NO. 7)
[0016] CPT1B-P4-R :5' - CCACCATGACTTGAGCACC-3' ；（SEQ ID NO. 8)
[0017] CPT1B-P5/6-F :5' - TAAGGGCTTGAGAATAATGG-3' ；（SEQ ID NO. 9)
[0018] CPTlB-P5/6-R:5' -GACAATTCCCTGGTTATGGT-3' ；（SEQ ID NO. 10)
[0019] CPT1B-P7/8-F :5' - AGATTGGTCCTTGGGTCAGC-3' ；（SEQ ID NO. 11)
[0020] CPT1B-P7/8-R :5' - AGCAGGACTCCCTTCACCAT-3' ；（SEQ ID NO. 12)
[0021] CPT1B-P9-F :5' - CTTCCCTGCTTCTGACACTG-3' ；（SEQ ID NO. 13)
[0022] CPT1B-P9-R :5' - CCCGTCAGAGGTAGGTTATG-3' ；（SEQ ID NO. 14)
[0023] CPT1B-P10-F :5' -GCAGCAGGACAGCCAGCATA-3' ；（SEQ ID NO. 15)
[0024] CPT1B-P10-R :5' - TGCGTCAGCCTTCCGACTAG-3' ；（SEQ ID NO. 16)
[0025] CPT1B-P11/12-F :5' -GGGCAACAGAGCAAGATTC-3' ；（SEQ ID NO. 17)
[0026] CPT1B-P11/12-R:5' -GAAGCCAGTTTGGACTCTAC-3' ；（SEQ ID NO. 18)
[0027] CPT1B-P13/14-F :5' -GGCTTCAGGGAGGACAGAG-3' ；（SEQ ID NO. 19)
[0028] CPT1B-P13/14-R :5' - CAGGCAGACAGGAGGCAGA-3' ；（SEQ ID NO. 20)
[0029] CPT1B-P15-F :5' -GCCAGGGCTACTCTTCACC-3' ；（SEQ ID NO. 21)
[0030] CPT1B-P15-R:5' -GTAGGAGGGCAGTGGGACA-3' ；（SEQ ID N0.22)
[0031] CPT1B-P16-F :5' - TTTGTCCCACTGCCCTCCTA-3' ；（SEQ ID NO. 23)
[0032] CPT1B-P16-R :5' - CAGGGAGGTATTTGGGATGG-3' ；（SEQ ID NO. 24)
[0033] CPT1B-P17/18-F :5' - TTCTTCACCCTTCTTGTTGC-3' ；（SEQ ID NO. 25)
[0034] CPT1B-P17/18-R:5' -GAAGGTTCTGAGGCAAGTAT-3' ；（SEQ ID N0.26)
[0035] 其中，F为正向引物，R为反向引物。
[0036] CPTlB基因编码外显子5和6、7和8、11和12、13和14、17和18位置较近，故分别 设计一对引物即 P5/6、P7/8、P11/12、P13/14、P17/18，分别如SEQIDN0·9-SEQIDN0·10、 SEQ ID NO. Il-SEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 17-SEQ ID NO. 18,SEQ ID NO. 19-SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 25-SEQ ID NO. 26 所示。
[0037] 本发明还提供了一种检测CPTlB基因突变的试剂盒，该试剂盒中含有扩增CPTlB 基因18个编码外显子及外显子/内含子交界区的引物。
[0038] 本发明所述的试剂盒还包括用于PCR扩增反应的酶和试剂。
[0039] 用于PCR扩增反应的酶和试剂包括Taq酶、dNTPUOXPCR缓冲液和双蒸水。
[0040] 进一步的，所述试剂盒中还包括用于提取样品DNA的试剂。
[0041] 本发明还提供非诊断目的检测检测CPTlB基因的全部编码外显子及外显子/内含 子交界区突变的方法，包括如下步骤：
[0042] (1)提取待测样本DNA ;
[0043] (2)以样本DNA为模板，用扩增CPTlB基因18个编码外显子及外显子/内含子交 界区的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
[0044] (3)采用测序引物对扩增产物进行测序扩增，得到测序扩增产物；
[0045] (4)对测序扩增产物进行测序，并与数据库中正常的CPTlB基因序列进行比对，从 而确定CPTlB基因的突变位点。
[0046] 步骤（2)中，PCR扩增的条件为：94°C预变性3min 20s，94°C变性35s，退火35s，特 异性扩增引物的退火温度为52°C -59°C，72°C延伸50s，共30个循环；最后72°C延伸5min。
[0047] 步骤⑶中，所述测序引物为PCR扩增引物对中的正向引物。
[0048] 步骤（3)中，测序扩增反应的条件是：95°C预变性120s，95°C变性30s，50°C退火 10s，60°C延伸120s，共25个循环。
[0049] 测序扩增反应体系采用IOyL,具体组成为：DNA模板1 μ L、引物（正、反向）各 1 μ L、BDT2 μ L、双蒸水补足至总体积10 μ L。
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