一种融合蛋白分子量分析方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药技术领域，具体地涉及一种蛋白分子量分析方法。
【背景技术】
[0002]细胞因子重组融合蛋白是一类利用基因工程的方法将编码细胞因子和其他有特定功能的蛋白分子基因序列连接并表达相应蛋白质融合产物。其结构特点为将细胞因子功能活性域与其他分子的活性域融合，各组分可发挥协同作用，使融合蛋白的生物学活性较各单体大大增强。融合蛋白糖基化修饰与其生物活性、结构和药代动力学均紧密相关，也会直接或间接影响其对蛋白酶的抗性、与Fe受体的结合、与补体Clq组份的相互作用、体内半衰期、相关生物学功能效应等。特定的糖基化修饰参与到重要的免疫细胞毒性效应因子功能中，也能通过与新生Fe伽马受体的结合来影响血清半衰期(RajuTSj Scallon BJ.Glycosylat1n in the Fe domain of IgG increases resistance toproteolytic cleavage by papain.B1chemical B1physical Research Communicat1ns2006, 341:797-803) (Wright A，Sato Y，Okada T，Chang K，Endo Tj Morrison S.1n vivotrafficking and catabolism of IgGl antibodies with Fe associated carbohydratesof differing structure.Glycob1logy 2000， 10:1347-1355)。
[0003]糖基化修饰对融合蛋白生物学功能是十分重要的，但复杂的糖基化修饰往往给蛋白结构表征分析带来相对于一般IgGl抗体更大的挑战。如依那西普每个单体Fe部分有I个N-糖位点，Fab部分有2个N-糖位点，另外据文献报道还含有13个O-糖位点(HouelS，Hilliard Mj Yu Y, McLoughlin N, Martin SM，Rudd PM，et al.N_and O-Glycosylat1nAnalysis of Etanercept Using Liquid Chromatography and QuadrupoIeTime—of—Flight Mass Spectrometry Equipped with Electron-Transfer Dissociat1nFunct1nality.Analytical Chemistry 2013 ;86:576-584)。rhCTLA4_Ig 每个单体 Fe 部分也有I个N-糖位点，Fab部分有2个N-糖位点(Bongers Jj Devincentis Jj Fu Jj HuangP，Kirkley DHjLeister K，et al.Characterizat1n of glycosylat1n sites for arecombinant IgGl monoclonal antibody and a CTLA4_Ig fus1n protein by liquidchromatographymass spectrometry peptide mapping.Journal of Chromatography A2011 ；1218:8140-9)，另外有2个0-糖位点。分子量分析可以在宏观水平上对蛋白进行表征，可以在分子量水平确认蛋白表达是否正确，同时也可以确认蛋白的不同异构体修饰形态及比例，为进一步确认蛋白在肽段水平上变化提供直观的线索和依据。由于唾液酸以及Fab段上的N-糖对融合蛋白完整蛋白离子化效率抑制十分明显，一般文献报道均采用特异性酶如Ides和木瓜蛋白酶Papain将Fe段部分从完整单体上切下来分离后再进行分子量分析(Tan Qj Guo Qj Fang C，Wang C，Li B，Wang H，et al.Characterizat1n andcomparison of commercially available TNF receptor 2_Fc fus1n protein products.MAbs 2012;4:761-74) ； (Lynaugh H，Li H and Gong B.Rapid Fe glycosylat1n analysisof Fe fus1ns with IdeS and liquid chromatography mass spectrometry.MAbs 2013 ；5:761-74)。
[0004]因此，如何有效的对融合蛋白进行完整蛋白分子量分析仍是目前急需的解决的技术问题。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种融合蛋白完整分子量分析方法，该方法克服了现有技术中N-糖和唾液酸对融合蛋白完整蛋白分子量分析时离子化效率的抑制，能准确测定去除N-糖和唾液酸后含O-糖核心的融合蛋白的分子量。本发明是通过以下技术方案实现的，包括如下步骤:1、融合蛋白N-糖(N-Glycosylat1ns)去除；2、融合蛋白唾液酸(Sialic Acid)去除；3、ES1-Q-TOF MS分析，去卷积计算。其中，步骤I与2先后顺序可以互换。
[0006]更具体地，本发明公开了:
[0007]—种融合蛋白分子量分析方法，所述方法包括步骤:(I)融合蛋白N-糖去除和/或唾液酸去除；(2)对去除N-糖和/或唾液酸的融合蛋白进行分子量分析。
[0008]进一步地，发明公开了一种融合蛋白分子量分析方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤:(I)融合蛋白N-糖去除，⑵融合蛋白唾液酸去除，(3)对去除N-糖和唾液酸的融合蛋白进行分子量分析；其中，上述步骤(I)和(2)顺序可以互换。
[0009]优选地，融合蛋白N-糖去除时溶液pH值为7.0?8.0 ;唾液酸去除时溶液pH值为4.0?7.0。更优选地，所述pH值是通过酸性或碱性可挥发性溶液调节。
[0010]在一些具体实施例中，所述融合蛋白N-糖去除通过以下方法实现:取融合蛋白样品，加入缓冲液(例如=NH4HCO3或I % NH3.H2O)调节pH值至7.0?8.0，加入肽N-糖苷酶F，混匀后，37°C孵育24小时。
[0011]在一些具体实施例中，所述融合蛋白唾液酸去除通过以下方法实现:取融合蛋白样品，加入缓冲液(例如=NH4HCO3或I % FA (FA:甲酸))调节pH值至4.0?7.0，加入唾液酸酶，37°C孵育24小时。
[0012]优选地，所述融合蛋白的分子量是通过ES1-Q-TOF MS方法进行分析。
[0013]在一些具体实施例中，所述ES1-Q-TOF MS分析采用以下方法实现:将融合蛋白用50mM NH4HCO3 (pH8.0)溶液稀释至 lmg/mL ;然后脱盐柱(优选MassPREPTM Micro DesaltingColumn, 20 μ m, 2.1 X 5mm, Waters公司)脱盐；最后进行质谱分析。
[0014]在一些实施例1?7中,所述融合蛋白是Etanercept,实施例8中所述融合蛋白是rhCTLA4-1g。
[0015]实验结果表明，通过利用特异性脱糖酶去除融合蛋白N-糖和/或唾液酸后再对融合蛋白进行分析，可获得含O-糖核心融合蛋白准确分子量。另外，实验结果还表明，如待分析融合蛋白只进行N-糖去除而没有进行唾液酸去除或者只进行唾液酸去除而没有进行N-糖去除，融合蛋白在ESI源碎裂时离子化效率将受到较高的抑制，最后只能获得少数几个含O-糖核心融合蛋白准确分子量；如利用特异性脱糖酶既去除N-糖，也去除唾液酸，融合蛋白在ESI源碎裂时离子化效率抑制大大降低，最终可获得绝大多数含O-糖核心融合蛋白准确分子量。另外，实验结果表明，融合蛋白N-糖去除后再进行唾液酸去除时不调节缓冲液PH值，以及唾液酸去除后再进行N-糖去除时不调节缓冲液pH值，融合蛋白在ESI源碎裂时离子化效率也受到了一定的抑制，能获得主要几个含O-糖核心融合蛋白准确分子量，但效果不如调节缓冲液PH值的方式，如融合蛋白N-糖去除后再进行唾液酸去除时调节缓冲液pH值4.0?7.0，以及唾液酸去除后再进行N-糖去除时调节缓冲液pH值7.0?8.0，融合蛋白在ESI源碎裂时离子化效率抑制将大大降低，能获得绝大多数含O-糖核心融合蛋白准确分子量。
[0016]总之，与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果:本发明能直接准确测定融合蛋白含O-糖核心异构体分子量。
【附图说明】
[0017]图1，为本发明实施例1融合蛋白典型多电荷TIC图；
[0018]图2，为本发明实施例1融合蛋白去卷积化完整蛋白分子量分析结果图；
[0019]图3，为本发明实施例2融合蛋白典型多电荷TIC图；
[0020]图4，为本发明实施例2融合蛋白去卷积化完整蛋白分子量分析结果图；
[0021]图5，为本发明实施例3中pH4.0和pH5.0条件下脱唾液酸去卷积化完整蛋白分子量对比分析结果图；
[0022]图6，为本发明实施例3中pH5.0和pH6.0条件下脱唾液酸去卷积化完整蛋白分子量对比分析结果图；
[0023]图7，为本发明实施例3中pH6.0和pH7.0条件下脱唾液酸去卷积化完整蛋白分子量对比分析结果图；
[0024]图8，为本发明实施例4融合蛋白去卷积化完整蛋白分子量分析结果图；
[0025]图9，为本发明实施例5融合蛋白去卷积化完整蛋白分子量分析结果图；
[0026]图10，为本发明实施例6融合蛋白典型多电荷TIC图；
[0027]图11，为本发明实施例6融合蛋白去卷积化完整蛋白分子量分析结果图；
[0028]图12，为本发明实施例7融合蛋白典型多电荷TIC图；
[0029]图13，为本发明实施例7融合蛋白去卷积化完整蛋白分子量分析结果图；
[0030]图14，为本发明实施例8融合蛋白(rhCTLA4_Ig)典型多电荷TIC图。
[0031]图15，为本发明实施例8融合蛋白(rhCTLA4_Ig)去卷积化完整蛋白分子量分析结果图。
【具体实施方式】
[0032]以下结合具体实施例对本发明进一步阐述，不应理解为是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均是按照常规条件或制造厂商所建议的条件进行实验。实施例1?7中所述融合蛋白是Etanercept。
[0033]实施例1:融合蛋白完整分子量分析(先N-糖去除，然后唾液酸去除)
[0034]融合蛋白完整分子量分析步骤:
[0035](I) N-糖(Ν-Glycosylat1ns)去除
[0036]取50yg Etanercept融合蛋白样品(辉瑞制药有限公司，以下同)，加入50mMNH4HCO3 (ρΗ8.0)溶液至体积20 μ L，加入I μ L 4倍稀释的肽N-糖苷酶PNGase F (NEB,500000u/mL)，混匀后，37°C孵育24小时。
[0037](2)唾液酸(Sialic Acid)去除
[0038]将⑴中孵育好的样品，用I % FA调节pH值至5?6，加入唾液酸酶Neuraminidase (Roche, 1U/100 μ L) 0.5 μ L, 37°C僻育 24 小时。
[0039](3) ES1-Q-TOF MS 分析
[0040]脱唾液酸脱N-糖的融合蛋白采用50mM NH4HCO3 (pH8.0)溶液稀释至lmg/mL ;然后MassPREPTM Micro Desalting Column 2.1 X5mm脱盐柱(Waters 公司，以下同)脱盐后，质谱分析。
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