一株高产l-缬氨酸工程菌的构建及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，涉及一株高产L-缬氨酸工程菌的构建及应用该菌种 进行L-缬氨酸发酵生产的方法。
【背景技术】
[0002] L-缴氨酸（L-valine)是人体八种必需氨基酸之一，也是一种支链氨基酸，在人体 及其他动物的代谢过程中有显著的功能，可应用于制药工业、食品行业及饲料行业等。
[0003] 在医药领域，L-缬氨酸是复合氨基酸输液和氨基酸注射液的原料，由其配制的复 合氨基酸输液在血脑屏障、肝昏迷、慢性肝硬化以及肾功能衰竭的治疗，先天性代谢缺陷病 的膳食治疗，败血症及术后糖尿病患者的治疗，加快外科创伤愈合的治疗和肿瘤患者的营 养支持治疗中应用广泛。近年研宄发现，L-缬氨酸是一种治疗高血压特效药-缬沙坦的原 料，需求量猛增。食品方面，鉴于支链氨基酸在肌肉组织中的代谢特性，常作为运动时的能 量来源，并且加强运动过程中对肌肉的维护，减轻肌肉疲劳等作用，常用于保健食品及运动 饮料当中。饲料工业方面，L-缬氨酸对哺乳动物乳腺组织分泌乳汁及提高动物免疫力有重 要作用，同样对动物的肌肉生长也有促进作用。
[0004] L-缬氨酸的生产方法主要有提取法、化学合成法、发酵法。提取法和化学合成法由 于原料来源受限制、生产成本高、收率低，污染严重，难以实现工业化生产。微生物直接发酵 法是借助于微生物自身具有合成所需氨基酸的能力，生产L-缬氨酸具有原料来源广泛，成 本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是一种非常经济、高效的生产方法。短杆 菌是用于生产L-氨基酸（如L-谷氨酸、L-亮氨酸和L-缬氨酸等）的主要微生物，其中 黄色短杆菌或谷氨酸棒杆菌是其中的主要代表，在微生物发酵生产L-缬氨酸工业中占有 非常重要的地位。
[0005] 由于其用途广泛，市场上L-缬氨酸总是处于供不应求局面，带动各生产企业在 L-缬氨酸产量及其生产成本等方面的良性竞争，开发新的优良菌株就显得尤为关键。传统 的菌株选育主要是鉴于自然界中有产L-缬氨酸能力的菌株，结合反复诱变选育，并通过优 化培养提高L-缬氨酸产率，但是该方法所能积累的氨基酸的水平有限，诱变育种的方法盲 目性大，工作量繁重，遗传背景不明，很难通过进一步的诱变或改造来提高产量，所以且产 率受到了极大的限制。而且诱变获得的菌株抗杂菌能力一般较弱，极易造成染菌，也不利于 工业放大生产。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供一种制备重组菌的方法。
[0007] 本发明提供的方法，包括如下步骤：将乙酰羟酸合成酶突变体编码DNA分子 ilvBN*、乙酰羟基酸异构还原酶编码DNA分子ilvC、支链氨基酸转氨酶编码DNA分子iIvE 和二羟酸脱水酶编码DNA分子ilvD导入目的菌中，得到重组菌。
[0008] 乙酰羟酸合成酶突变体为仅将乙酰羟酸合成酶氨基酸序列第782位的甘氨酸（G) 突变为谷氨酸（E)，且不改变其他氨基酸残基得到的蛋白质；其与乙酰羟酸合成酶相比，仅 是第782位氨基酸不同，其他氨基酸残基均相同。
[0009] 所述乙酰羟酸合成酶突变体的氨基酸序列为序列表中序列5.
[0010] 所述乙酰羟酸合成酶突变体编码DNA分子为将乙酰羟酸合成酶编码DNA分子核苷 酸序列6第2377位的g突变为a ;
[0011] 所述乙酰羟酸合成酶编码DNA分子核苷酸序列为序列表中序列6。
[0012] 上述方法中，所述乙酰羟酸合成酶突变体编码DNA分子、乙酰羟基酸异构还原酶 编码DNA分子、支链氨基酸转氨酶编码DNA分子和二羟酸脱水酶编码DNA分子通过重组载 体导入目的菌中。
[0013] 上述方法中，所述重组载体pZ8-lBN#CED为将含有所述支链氨基酸转氨酶编码DNA 分子和所述二羟酸脱水酶编码DNA分子的DNA片段iIvED插入中间载体pZ8-lBN*C得到的 载体；具体为将序列表的序列4所示的ilvED插入上述一制备的载体pZ8-lBN #C的BamH I 酶切位点间得到的载体；
[0014] 所述中间载体pZS-ΙΒΝ?为将含有所述乙酰羟酸合成酶突变体编码DNA分子和所 述乙酰羟基酸异构还原酶编码DNA分子的DNA片段ilvBN#C插入表达载体得到的载体；具 体为将序列表的序列1自5'末端第1至3700位核苷酸所示的ilvBN#C(编码BNC蛋白）插 入载体PZ8-1的BamH I和EcoR I双酶切位点间得到的载体。
[0015] 上述方法中，所述支链氨基酸转氨酶编码DNA分子和所述二羟酸脱水酶编码DNA 分子组成的融合基因的核苷酸序列为序列表中序列4,其中序列4自5'末端第16-1155位 核苷酸为支链氨基酸转氨酶编码DNA分子，序列4自5'末端第1464-3302位核苷酸为二羟 酸脱水酶编码DNA分子。
[0016] 所述乙酰羟酸合成酶突变体编码DNA分子和所述乙酰羟基酸异构还原酶编码DNA 分子组成的融合基因的核苷酸序列为序列表中序列1，其中序列1自5'末端第21-2382位 核苷酸为乙酰羟酸合成酶突变体编码DNA分子，序列1自5'末端第2614-3630位核苷酸乙 酰羟基酸异构还原酶编码DNA分子。
[0017] 上述方法中，所述目的菌为黄色短杆菌Brevibacterium flavum。
[0018] 由上述方法制备的重组菌也是本发明保护的范围。
[0019] 上述重组菌为黄色短杆菌（Brevibacterium flavum)MDV-07CCTCC NO:M 2014621。
[0020] 上述的重组菌在制备L-缬氨酸中的应用也是本发明保护的范围。
[0021] 本发明的另一个目的是提供一种制备L-缬氨酸的方法。
[0022] 本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵上述的重组菌，收集发酵产物的上清液， 即得到L-缬氨酸。
[0023] 上述方法中，所述发酵条件为在发酵培养基中28-33°C、200-250r/min振荡培养 50-60小时；
[0024] 或所述发酵条件为在发酵培养基中28-33°C、培养70-80小时，其使所述发酵过程 中发酵体系中的溶氧量为30-50%，葡萄糖含量为0. 8-1. 0g/100mL。
[0025] 黄色短杆菌（Brevibacterium flavum) MDV-07 简称黄色短杆菌 MDV-07,已于 2014 年12月4日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC ;地址：中国武汉，武汉大学； 邮编：430072)，保藏编号为 CCTCC NO:M 2014621，分类命名为 fcevibacterium flavum MDV-07。
[0026] 本发明的实验证明，本发明构建了重组工程菌黄色短杆菌（Brevibacterium flavum)MDV-07,用其发酵生产L-缬氨酸，在30L全自动发酵罐采用该生产工艺发酵生产 L-缬氨酸，可以大大提高L-缬氨酸的产率，而且大大降低L-缬氨酸发酵过程中的染菌概 率，提供的黄色短杆菌工程菌可直接发酵得到L-缬氨酸，发酵70-80小时后，发酵液中的 L-缬氨酸含量达85g/L-95g/L，糖酸转化率达35% -40%，极具生产应用价值。
【附图说明】
[0027] 图1为外源表达载体pMDBN*C的结构示意图。
[0028] 图2为载体pZ8-l的结构示意图。
[0029] 图3为重组载体pZ8-lBN#C的结构示意图。
[0030] 图4为重组载体pMDiIvED的结构示意图。
[0031] 图5为重组载体pZ8-lBN*CED的结构示意图。
【具体实施方式】
[0032] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0033] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0034] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0035] 实施例1、高产L-缬氨酸工程菌的构建
[0036] 一、重组载体pZ8-lBN#C的构建
[0037] I、pMDBN*C载体的构建
[0038] 1)、根据已公布在NCBI的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组信息及基因功能注释， 结合L-缬氨酸的代谢途径分析，设计引物BNC-F、BNC-R，以黄色短杆菌20160基因组为模 板，PCR扩增串联在基因中的ilvBN基因和ilvC基因，以及他们本身携带的核糖体结合位 点序列（RBS)，得到扩增产物一一 ilvBNC基因片段。
[0039] BNC-F:5, -GAATTC AGTAAAGGAGCCAGAAAGTCGTG-3，；
[0040] BNC-R: 5 ' -GGATCC GTACAAAGTGCACAGCAGGTAGC-3 '。
[0041] 其中引物BN