，然后用i IvE-F和i IvD-R组成的引物对进行PCR鉴定（显示约4400bp的特 异条带的为PCR鉴定阳性），得到工程菌。
[0085] 将工程菌命名为黄色短杆菌（Brevibacterium flavum)MDV_07。黄色短杆菌 (Brevibacterium flavum)MDV_07简称黄色短杆菌MDV-07,已于2014年12月4日保藏于 中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC ;地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编 号为 CCTCC NO:M 2014621，分类命名为 fcevibacterium flavum MDV-07。
[0086] 采用同样的方法，将空载体pZ8-l转入黄色短杆菌20160中，得到重组菌20160/ pZ8_l〇
[0087] 实施例2、黄色短杆菌MDV-07在生产L-缬氨酸中的应用
[0088] -、培养基的制备
[0089] 种子培养基（pH = 6. 5-7. 5):取IOOg葡萄糖、5g玉米浆、IOOg黄豆饼粉酶解液、 3g 酵母膏、5g (NH4) 2S04、0. 2g MgSO4 · 7Η20、0· 3g KH2PO4 · 3Η20、0· 03g 单硫酸卡那霉素和 IOg 碳酸钙用去离子水溶解并定容至IL ;
[0090] 其中黄豆饼粉酶解液的制备方法为：将IOOg黄豆磨粉，加400mL去离子水拌匀，调 pH值为6.5-7. 0,加入1%终浓度中性蛋白酶（购自于上海佳和生物科技有限公司），60°C 酶解3h即成黄豆饼粉酶解液。125°C灭菌25min。
[0091] 发酵培养基（pH = 6. 5-7. 5):取120g葡萄糖、20g玉米浆、50g黄豆饼粉酶解液、 7g(NH4)2S0 4、1.0g KH2PO4 .3H20、2g K2HPO4 .3H20、0.2g MgSO4 .7H20、0.02g FeSO4 ·7Η20、 0· 02g MnSO4 · H20、130ug维生素 H、Img维生素 Bl、Img维生素 B6、、0· 03g单硫酸卡那霉素、 20g CaCO3用去离子水溶解并定容至IL ;所述黄豆饼粉酶解液的制备方法为：将IOOg黄豆 磨粉，加400mL去离子水拌匀，调pH值为6. 5-7. 0,加入1 %终浓度中性蛋白酶（购自于上 海佳和生物科技有限公司），60°C酶解3h即成黄豆饼粉酶解液。125°C灭菌25min。
[0092] 二、摇瓶发酵生产L-缬氨酸
[0093] 1、应用黄色短杆菌MDV-07生产L-缬氨酸
[0094] (1)种子培养
[0095] 将一环实施例1制备的黄色短杆菌MDV-07斜面种子接种至装有30mL种子培养 基的250mL摇瓶中，8层纱布封口，28-33°C振荡培养（200-250r/min)至对数生长中后期 (14-18小时），得到种子液（种子液的OD 562nm= 40-45)。
[0096] (2)发酵培养
[0097] 将3mL种子液接种至装有30mL发酵培养基的250mL三角瓶中，8层纱布封口， 28-33°C，振荡培养（200-250r/min)50-60小时，具体为28°C，振荡培养250r/min、60小时。
[0098] (3)将步骤⑵的发酵体系离心（4°C、5000g、15min)，收集上清液（发酵液）。
[0099] 2、对照液的制备
[0100] 将黄色短杆菌20160代替黄色短杆菌MDV-07进行步骤1的实验，收集上清液（对 照液）。
[0101] 将重组菌20160/PZ8-1代替黄色短杆菌MDV-07进行步骤1的实验，收集上清液 (对照液空载体）。
[0102] 3、检测L-缬氨酸含量
[0103] 检测发酵液、对照液和照液空载体中的L-缬氨酸含量（采用日立L-8800型氨基 酸自动分析仪进行测定）。
[0104] 发酵液中的L-缬氨酸浓度为22g/L (上清液），对照液中的L-缬氨酸浓度为4g/ L0
[0105] 对照液和对照液空载体的结果无显著差异。
[0106] 三、工业发酵生产L-缬氨酸
[0107] 将黄色短杆菌MDV-07(或黄色短杆菌20160或重组菌20160/pZ8-l)进行30L全 自动发酵罐进行补料分批发酵，具体步骤如下：
[0108] 1、第一阶段培养
[0109] 采用30L发酵罐，种子培养基的装液量为15L，培养时间为14-18小时，溶氧 (DO) 30-50%，温度 28-33°C ;得到种子液（种子液的 OD562nm= 40-45)。
[0110] 2、第二阶段培养
[0111] 采用30L发酵罐，发酵培养基的装液量为15L，培养时间为70-80小时（通过 控制流加75%的葡萄糖水溶液，维持发酵罐中的葡萄糖含量为0. 8-1. 0g/100mL)，溶氧 (DO) 30-50%，温度28-33°C，具体为培养时间为70小时（通过控制流加75%的葡萄糖水溶 液，维持发酵罐中的葡萄糖含量为〇. 8-1. 0g/100mL，溶氧（DO) 30-50%，温度28°C。
[0112] 3、将步骤2的发酵体系（4°C、5000g、15min)，收集上清液（发酵液）。
[0113] 糖酸转化率（糖酸转化率（％)=培养过程中总的葡萄糖消耗量g+ (放罐L-缬 氨酸浓度g/LX放罐体积L) X 100% )
[0114] 采用上述一的方法检测，结果如下：
[0115] 黄色短杆菌MDV-07发酵液中的L-缬氨酸浓度为92. 5g/L，糖酸转化率达38. 4%; 黄色短杆菌20160发酵液中的L-缬氨酸浓度为10g/L，糖酸转化率为13%。
[0116] 对照液和对照液空载体的结果无显著差异。
【主权项】
1. 一种制备重组菌的方法，包括如下步骤：将乙酰羟酸合成酶突变体编码DNA分子、乙 酰羟基酸异构还原酶编码DNA分子、支链氨基酸转氨酶编码DNA分子和二羟酸脱水酶编码 DNA分子导入目的菌中，得到重组菌； 所述乙酰羟酸合成酶突变体为仅将乙酰羟酸合成酶氨基酸序列第782位的甘氨酸突 变为谷氨酸，且不改变其他氨基酸残基得到的蛋白质； 所述乙酰羟酸合成酶的氨基酸序列为序列表中序列5。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述乙酰羟酸合成酶突变体编码DNA分 子、乙酰羟基酸异构还原酶编码DNA分子、支链氨基酸转氨酶编码DNA分子和二羟酸脱水酶 编码DNA分子通过重组载体导入目的菌中。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于： 所述重组载体为将含有所述支链氨基酸转氨酶编码DNA分子和所述二羟酸脱水酶编 码DNA分子的DNA片段插入中间载体得到的载体； 所述中间载体为将含有所述乙酰羟酸合成酶突变体编码DNA分子和所述乙酰羟基酸 异构还原酶编码DNA分子的DNA片段插入表达载体得到的载体。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于： 所述含有所述支链氨基酸转氨酶编码DNA分子和所述二羟酸脱水酶编码DNA分子的 DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列4 ; 所述含有所述乙酰羟酸合成酶突变体编码DNA分子和所述乙酰羟基酸异构还原酶编 码DNA分子的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列1。
5. 根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述目的菌为黄色短杆菌 Brevibacterium flavum〇
6. 由权利要求1-5中任一所述方法制备的重组菌。
7. 根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为黄色短杆菌 (Brevibacterium flavum)MDV-07CCTCC NO:M 2014621〇
8. 权利要求6或7所述的重组菌在制备L-缬氨酸中的应用。
9. 一种制备L-缬氨酸的方法，包括如下步骤：发酵权利要求6或7所述的重组菌，收 集发酵产物的上清液，即得到L-缬氨酸。
【专利摘要】本发明公开了一株高产L-缬氨酸工程菌的构建及其应用。本发明提供了制备重组菌的方法，包括如下步骤：将乙酰羟酸合成酶突变体编码DNA分子、乙酰羟基酸异构还原酶编码DNA分子、支链氨基酸转氨酶编码DNA分子和二羟酸脱水酶编码DNA分子导入目的菌中，得到重组菌。本发明的实验证明了本发明利用黄色短杆菌(Brevibacterium？flavum)MDV-07发酵生产L-缬氨酸，可以大大提高L-缬氨酸的产率，提高转化率，极具生产应用价值。CCTCC NO: M 201462120141204
【IPC分类】C12R1-13, C12P13-08, C12N15-74, C12N1-21
【公开号】CN104561074
【申请号】CN201410840584
【发明人】黄建忠, 黄钦耿, 吴伟斌, 翁雪清, 曾邦定, 黄祥峰, 施巧琴, 吴松刚
【申请人】福建师范大学, 福建省麦丹生物集团有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月30日