一种安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及蛋白质转染细胞载体，属于生物材料领域。
【背景技术】
[0002]蛋白质转染是直接把蛋白质转入细胞的过程，一般要用到载体帮助目标蛋白质转染进入细胞膜内。蛋白质转染进入细胞有非常重要的科研价值和应用前景，主要研宄有:①蛋白质一蛋白质相互作用；②细胞内信号传导，细胞周期调控，细胞凋亡，肿瘤发生和转录调节；③未知蛋白质的功能；④细胞重编程；⑤功能性转录因子的递送和癌症治疗。
[0003]但目前从事蛋白质载体进入细胞研宄的人比较少。主要原因是本领域的人一般均习惯接受基因转染，因为将基因转染进细胞后会翻译成蛋白质，故认为无必要直接转染蛋白质进入细胞。另外，现在基因转染的技术已很成熟，且已有大量性能稳定的基因转染载体，如病毒、脂质体、纳米载体如PEI等。其中病毒效率最高，但有不可控风险，脂质体一般认为对细胞毒性较大，而纳米载体因为尺寸效应和非病毒性，一般认为比较有潜力成为更安全可靠的基因载体，所以本领域的人通常集中在对纳米载体改性，如研宄在不增加载体细胞毒性的如提下，提尚基因转染的效率。
[0004]此外，本领域的人一般认为将蛋白质直接转入细胞存在以下的问题:①转入蛋白质数量有限，可能无法达到起作用的有效浓度；②蛋白质因为不能向像基因那样可以大幅度压缩，故所形成的载体一蛋白质复合物的尺寸比较大，纳米效应不明显，易产生细胞毒性；③转入的蛋白质一般为原核表达蛋白，没有蛋白质功能，要进入细胞后由内质网折叠修饰等加工程序后才具备功能，细胞是否会主动修饰所转染的蛋白质也是未知数；④现有的蛋白质载体不能同时满足安全低毒和高效转染两个基本要求，如PE1、阳离子脂质体转染效率高，但毒性大，微球接枝穿膜肽毒性小，但转染效率低，制备复杂；⑤人工重组获得的蛋白质或天然分离纯化的蛋白质获取均很困难，成本较高。总之，现在直接转蛋白质进入细胞的文献和专利均不多，而基因载体的研宄和开发一直较热。
[0005]综上原因可知，现在开展蛋白质转染细胞研宄的同行较少。此外，已开发的性能可靠的蛋白质载体也很少，尤其不能同时具备转染效率高，安全低毒、适应广等重要要求。现有的蛋白质载体基本是直接使用目前较为成熟的非病毒基因载体。事实上，从一定程度上借鉴基因载体的经验也基本是可行的。目前在国内外，以下几种蛋白质转染试剂有见报道:
[0006](I)聚苯乙烯微球:有人报道在聚苯乙烯微球表面合成双官能团，一个用来连接蛋白，一个用来细胞内追踪。结果微球体:(a)能稳定地连接蛋白质，(b)有一定的蛋白质转染效率，(C)进入细胞后，所释放的蛋白质有功能，可跟踪。(d)微球能进入初级免疫细胞、胚胎干细胞、人神经干细胞、分化小鼠神经干细胞和几个非吞噬细胞系等多种细胞。这主要是利用聚苯乙烯微球具有良好的亲水性。
[0007](2)阳离子肽或阳离子脂质体试剂:阳离子肽被称为蛋白转导结构域(PTD)，已被证明能够有效地透过细胞膜。阳离子脂质体(Cat1nic liposome)，如LipOfectamineTM2000等，因具有操作简便、生物安全性高、重复性好、转染效率较高等特点而成为目前应用最为广泛的非病毒载体，但仍有较大的毒性，限制了其应用。也有研宄者将上述阳离子肽和阳离子脂质体进行混合，提高转染效率。
[0008](3)多聚精氨酸:毒性非常大，一般认为没有临床应用前景，但适用细胞广，可有效地转染蛋白质到各种细胞，包括各种原代培养细胞和悬浮细胞。有研宄者设计并制作了寡精氨酸，可减低其毒性，但毒性仍非常大。
[0009](4)PE1:转染效率非常高，但因为毒性非常大，一般也不单独使用，常需与其它物质配合使用，以减低其毒性。如许多研宄者将小分子PEI接枝到透明质酸等低毒性高分子载体上。也有研宄者采用小分子PEI转染蛋白质，但毒性仍非常大。
[0010]总之，现有的蛋白质载体不能同时具备安全低毒和高效转染两个基本要求，而且对细胞有一定的选择性。虽然已有少数的同行开展蛋白质载体的研宄，但均未采用壳聚糖、低分子壳聚糖及其衍生物作为蛋白质转染载体。
[0011]壳聚糖(Chitosan)又称脱乙酰甲壳素，是由自然界广泛存在的甲壳素(chitin)经过脱乙酰作用得到的，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖。值得指出的是，壳聚糖并非天然产物，它是天然物质甲壳素的脱乙酰产物。这种高分子的生物相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等被各行各业广泛关注，在医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程等诸多领域的应用研宄均取得了重大进展。如壳聚糖降血脂、降血糖的作用已有研宄报告；壳聚糖被作为增稠剂、被膜剂列入国家食品添加剂使用标准GB-2760。壳聚糖的降解也很安全，文献表明，已有30多种酶可以对它起作用，所以动物体内和细胞内都有相当多的酶可以降解它，如溶菌酶等。总体而言，壳聚糖是一种非常安全的物质。
[0012]但是，壳聚糖作为基因载体，其转染效率低。众多文献表明，壳聚糖及其衍生物可以作为基因载体转染基因物质进入细胞，但转染效率仍普遍低于阳离子脂质体和病毒载体。故本领域的人一般关注将壳聚糖改性，提高其转染效率，这方面已有少量的文献和专利。研宄者主要通过以下几个方法进行改性:1.接枝或共混PEI或精氨酸等阳离子载体，这主要因为阳离子载体穿膜效率高；2.接枝或共混PEG或酸如琥珀酸等，这主要是通过提高载体的亲水性来增加载体的穿膜能力；3.加入磷酸钙，这主要是因为磷酸钙与DNA结合成复合体，易于转染进入细胞；4.接枝TAT肽(穿膜肽)于壳聚糖，从而提高穿膜效率；5复合药物，提高靶向目标细胞能力，如复合半乳糖靶向肝细胞，如复合LHRH肽，靶向肝癌细胞等。
[0013]另外，壳聚糖作为基因载体，对细胞有一定的选择性，这是壳聚糖作为基因载体的另一个缺点。文献表明，壳聚糖/DNA纳米粒子易进入肿瘤细胞、巨噬细胞等，而很难进入干细胞和成纤维细胞等。
[0014]总之，壳聚糖虽然安全，但转染效率低，适用细胞类型少，不适宜作基因载体，未获得本领域人的普遍认可。而比壳聚糖分子量更小的低分子壳聚糖及其衍生物则更不宜作基因载体，这是因为低分子壳聚糖所携带的正电荷过少，很难完成包裹和压缩目的基因的任务。
[0015]壳聚糖还应用在药物载体领域。壳聚糖作为一种安全的药物载体，已有人用于蛋白质(如抗体)药物载体的研宄，如应用于蛋白质药的控释和缓释，属于药剂学领域。在控释领域，由于高分子壳聚糖及其衍生物具备海绵状特殊结构和溶解性，且降解产物不含任何对人体有害的物质，已应用于控制药物持续释放、改善药物的溶解性和吸收性等方面，如有人通过改变壳聚糖微粒的交联程度和负载蛋白质的量达到了优化药物包封率、微粒大小和释放度的目的。
[0016]在缓释领域，壳聚糖作为缓释剂可使药物的释放受到控制，血药浓度平稳，并保持在有效浓度范围内，延长有效时间而不出现毒性。而且壳聚糖制成的缓释剂在胃肠内可以延长滞留时间，提高药物的生物利用度。目前研宄的缓释剂型有:颗粒剂、片剂和胶囊剂等，如有人将高分子壳聚糖、海藻酸钠与蛋白质复合，口服给药，研宄蛋白质药物的肠溶缓释作用。
[0017]但至今还没有将低分子壳聚糖及其衍生物作为载体转染蛋白质进入细胞的研宄和应用。
[0018]事实上，一般科研购买的壳聚糖(分子量大于20000)及其改性的壳聚糖衍生物是不能作为载体转染蛋白质进入细胞的。主要原因是因为这个分子量级别的壳聚糖已不能溶于水，只能溶于酸性溶液。即使在酸性环境下，壳聚糖与蛋白质可构成可溶复合物，一旦应用在PH值为7.4的人体或细胞培养环