多种蛋白质，将其配成一定浓度的水溶液；将上述两种溶液按一定的比例混合、震荡；将混合溶液直接加入到已培养细胞的细胞培养基中，或直接注射到动物体内如静脉中。
[0071]应用实施例1
[0072]应用实施例2制备的载体，与DNase I酶形成复合物，考查该复合物能否降解0CT4质粒，明确低分子壳聚糖与DNase I酶的配比关系。包括以下步骤:
[0073](I)取载体定量成浓度为10mg/ml的水溶液，加入0.lmol/L氢氧化钠溶液调PH值至 7.4。将上述水溶液梯度稀释至 200.00，50.00，12.50，3.13，0.78，0.19ug/ml 浓度。
[0074](2)取 DNase I 酶，配制成 100ug/ml 的 PBS 溶液。
[0075](3)分别取上述稀释的低分子壳聚糖溶液与100ug/ml DNase I酶各?.5ul混合，4°C，震荡过夜，即为系列“低分子壳聚糖-DNase I酶”混合溶液。
[0076](4)将上述混合溶液、对照组进行琼脂糖凝胶电泳。
[0077]结果如图2所示，DNase I酶浓度为100ug/ml，低分子壳聚糖浓度为200.00，50.00，12.50，3.13，0.78ug/ml时，均具有保护作用，其中壳聚糖浓度为200.00，50.0Oug/ml时，因为浓度过大，电泳效果较差，无法进行有效的分离。12.50，3.13，0.78ug/ml三个浓度的DNase I酶较适宜。
[0078]应用实施例2
[0079]应用实施例3、7和9制备的载体，将GFP蛋白转染进入hBMSC细胞，研宄上述载体的转染能力和实验方法。包括以下步骤:
[0080](I)取实施例3、7和9制备的载体，将其分别配成浓度为200ug/ml的溶液。
[0081 ] (2)取GFP蛋白，配制成100ug/ml的PBS溶液
[0082](3)分别取上述载体溶液与100ug/ml GFP蛋白溶液各7.5ul混合，4°C，震荡过夜，即为复合体溶液。
[0083](4)将lug/ml的复合体溶液加入2ml的培养基中，3h后，荧光显微镜下观察其转染状况。
[0084]结果如图3所示，上述三种载体均能有效的转染GFP蛋白进入hBMSC细胞。因为hBMSC细胞很难被蛋白转染进去。这说明上述三种载体的转染能力非常优异。且随着时间的增加，其转染率逐渐提高。
[0085]应用实施例3
[0086]应用实施例3制备的载体，介导11^5，他11(12^6€2(3，6&七&4等四个重组蛋白进入hBMSC细胞，观察细胞是否转化成心肌祖样细胞。包括以下步骤:
[0087](I)取载体定量成浓度为10mg/ml的水溶液，加入0.lmol/L氢氧化钠溶液调PH值至7.4，将其分别配成浓度为200ug/ml的溶液。
[0088](2)将上述四种蛋白分别溶解于PBS溶液，其浓度分别为100ug/ml。
[0089](3)将上述五种溶液各取7ul，共混，震荡，获得复合体溶液。
[0090](4)加入hBMSC细胞的培养基中，分别于不同时间观察其表面变化形貌，通过免疫荧光观察细胞的变化。
[0091](5)收集12d的细胞直接注射入心肌梗死模型的大鼠心肌受损心肌处，在造模的同时给予超顺磁氧化铁颗粒(SP1)标记的PiCPC局部注射，注射等量PBS为对照。
[0092](6)分别于I周，2周，3周和4周超声心动图检测各组大鼠的心功能，HE染色检测移植细胞对心梗区域的修复作用。
[0093]图4和图5的结果显示，hMSCs经四种心肌调控蛋白诱导后，isl_l、myl2等心肌特异蛋白的表达量有明显上调，不论是聚集还是经消化后散布生长，hMSCs都呈现向心肌祖细胞方向分化的趋势，表达其三个谱系的标记。这说明通过蛋白质转染的方法，有望可以实现hMSCs往心肌祖细胞的分化。图6和图7的结果显示，采用转化的细胞比PBS组有明显的优势。
【主权项】
1.一种安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体，其特征在于，所述载体的主要组分为低分子壳聚糖和/或低分子壳聚糖衍生物。
2.根据权利要求1所述的安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体，其特征在于，所述低分子壳聚糖是指壳聚糖经生物降解法、化学降解法或物理降解法降解，或者通过化学合成法或酶合成法得到的一种聚合度为2?120、分子量为320?20000的低分子壳聚糖。
3.根据权利要求1所述的安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体，其特征在于，所述低分子壳聚糖衍生物指以低分子壳聚糖为母体，对其中的原子或原子团用其他原子或原子团取代所形成的化合物，包括酰化、羧基化、羟基化、氰化、醚化、烷化、酯化、醛亚胺化、叠氮化、成盐、螯合、水解、氧化、卤化、接枝与交联反应制备的衍生物。
4.根据权利要求3所述的安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体，其特征在于，所述低分子壳聚糖衍生物为磺化甲壳素、磺化羧甲基甲壳素、N-羟乙基壳聚糖、N-乙酰化壳聚糖、O-羧甲基壳寡糖、N-羧甲基壳聚糖、N-三甲基氯化壳寡糖、N-羟丙基壳聚糖乙酸酯、氰乙基或苯基氰乙基壳聚糖、N-丙(丁、己)酰化壳聚糖、N-甲基(苯)磺酰壳聚糖、N-邻苯二甲酰壳聚糖、N-丁(辛、十六烷)基壳聚糖、N-羧基丁基壳聚糖、N-硫酸壳聚糖、6-0-羟乙基壳聚糖、乙二醇壳聚糖、甘油(3-氯丙烷-1，2-二醇)壳聚糖、B-D半乳糖苷支化壳聚糖、6-脱氧壳聚糖、6-0-单硫酸(3，6-0-二硫酸)壳聚糖、十二烷基磺酸钠壳聚糖中的一种或几种。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体，其特征在于，所述载体的组分还包括次要组分，所述次要组分为聚乙二醇、聚乙烯亚胺、脂质体、磷酸钙、偏磷酸钙、海藻酸钠、HIV-1TAT短肽、多聚精氨酸、寡精氨酸、寡赖氨酸、聚苯乙烯、碳纳米管中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体，其特征在于，所述载体的主要组分和次要组分的摩尔比为1: O?100。
7.根据权利要求6所述的安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体，其特征在于，所述载体可与一种或多种类型的蛋白质结合，从而形成复合物。
8.根据权利要求7所述的安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体，其特征在于，所述复合物中，载体的主要组分和蛋白质的摩尔比为1: 0.1?100。
【专利摘要】本发明公开了一种安全高效的蛋白质转染进入细胞的载体，所述载体的主要组分为低分子壳聚糖和/或低分子壳聚糖衍生物，其中所述低分子壳聚糖是指壳聚糖经生物降解法、化学降解法或物理降解法降解，或者通过化学合成法或酶合成法得到的一种聚合度为2～120、分子量为320～20000的低分子壳聚糖。与现有技术相比，本发明提供的蛋白质转染细胞的载体具有以下技术效果：(1)载体与蛋白质结合后，能有效护蛋白质不受酶的降解；(2)载体介导蛋白质转染进入细胞的效率高、数量多、时间快；(3)载体对细胞无明显毒性；(4)载体适应广，可适用不同类型的动物细胞；(5)操作简单。
【IPC分类】C12N15-85, C12N15-63, A61K48-00, A61P35-00
【公开号】CN104561067
【申请号】CN201410823369
【发明人】余细勇, 吴岳恒, 姜霖, 汤顺清
【申请人】广东省人民医院
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月24日