一种栽培稻种间杂种不育基因s1及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子植物育种与基因工程领域。更具体地，涉及一种栽培稻种间杂种 不育基因分及其应用。
【背景技术】
[0002] 水稻是人类最主要的粮食作物之一，也是我国的第一大农作物，世界上约有一半 的人口以稻米为主要粮食，中国的水稻粮食生产解决了十几亿人口的温饱问题。上世纪60 年代黄耀祥等人组织进行的水稻矮化育种的成功，以及70年代袁隆平为代表的全国大协 作利用亚种内杂种优势对水稻"三系法"配套制种取得突跛，曾使水稻单产水平产生过两次 质的飞跃，对稳定中国乃至世界的粮食产量起着重要的作用。但自上世纪80年代中期以 来，水稻产量一直徘徊不前（闵绍楷等，1996)，原因在于水稻种质资源的不足及种间及亚种 间的杂种严重不育阻碍了种间及亚种间杂种优势的有效利用。
[0003] 杂种优势是指遗传组成不同的两亲本的杂种F1在生活力、生长势、抗逆性、产量和 品质等方面优于亲本的现象。两亲本亲缘关系越远缘，两亲本的遗传背景差异也就越大，杂 种后代优势表现也就越明显。水稻种间如亚洲栽培稻Z.)与非洲栽培稻之 间（A 1SrZaAerriffia)比亚种间如籼稻（iflt/ica)与粳稻之间杂种优势表现更明 显，亚种间又比亚种内品种间如恢复系与不育系之间杂种优势表现更明显，但是，杂种不育 这种生殖障碍表现也越突出。因此，研宄引起杂种不育的原因，克隆其相关基因，阐明其作 用机理，从而逐步克服杂种不育性达到杂种优势利用的目的，是科研工作者一项长期、艰巨 的使命。
[0004] 水稻杂种不育是一个复杂的生物学现象，研宄者采取不同的水稻杂交组合，在不 同的地理环境与气候环境条件下，不断探索，得出的水稻杂种不育现象主要表现在以下 情况：配子体发育受阻（Kitamura, 1962)，雌配子败育（Ikehashi, 1986, 1988;刘永胜等， 1997 ;朱晓红等，1996)，雄配子败育（Oka，1957 ;黄厚哲，1982 ;张桂权等，1991、1993 ;何光 华，1994;朱英国等，1996)，雌雄配子同时败育（Sano, 1990 ;Koide ei a人2008)，雌雄配子 发育不一致(刘永胜等，1997 )，花粉在柱头上萌发障碍和环境条件影响（高勇，1993)，胚乳 发育受阻(朱英国等，1996 )，花药不开裂（Maekawa，1991)等。其中雌配子败育和雄配子败 育表现最为常见。
[0005] 那么，在匕体内又是什么样的遗传机理导致杂种不育现象发生的呢？目前的解释 有三种：细胞质效应、染色体隐微结构差异和基因控制论。由于细胞质效应与染色体的隐微 结构差异引起杂种不育只限于一些特定的组合，在大多数组合中正反交杂种育性没有明显 的差异，杂种F 1染色体畸变频率很低，与F i的不育性也没有直接联系，因此，目前国内外学 者普遍认同的是基因控制理论。Kitamura (1962)首先提出了单座位孢子体-配子体互作 模式，认为杂种的结实率偏低是由等位基因的互作引起的。Oka (1974)把栽培稻杂种不育 可能出现的基因作用模式归为4种：重复隐性配子致死、单座位孢子体一配子体互作、单座 位孢子体不育性和互补孢子体不育性。其中重复隐性配子致死模式和单座位孢子体一配子 体互作模式是两种主要的杂种不育基因遗传模式，而单座位孢子体一配子体互作又有两个 最有代表性理论即广亲和理论和特异亲和理论支持该模式。Ikehashi and Araki (1984， 1986)根据其研宄结果提出了"广亲和基因"理论，认为亚种间杂种不育性主要是受各座位 上的一组复等位基因（&?/、〇控制，其中籼稻型标记为皮，粳稻为沒，中间类型为5^。 当5Τ与皮或结合或等位基因纯合时均表现为正常可育，而当皮和结合时，携带 的雌配子发生败育。Chen (2008)已经克隆出了 基因，它编码的是一个天冬氨酰 蛋白酶。I-i和I-J之间仅有两个碱基的差别，引起相应蛋白质中两个氨基酸的替换，造 成其杂种的不育。I-/?则在其编码蛋白的N端有一大片段序列的缺失，导致其蛋白亚细胞 定位的改变，这可能导致其功能丧失，无论与籼稻还是粳稻杂交，都不影响杂种的育性。序 列比对分析表明，S5中的两个突变位点氨基酸273和471都在中间结构域上。在这两个 变化的氨基酸中，Phe-273在动植物中都是很保守的，但氨基酸471是高度可变的，然而在 S5-j中保守的Phe-273 (疏水性，芳香族氨基酸）被Leu (疏水性，非芳香族氨基酸） 取代，这种变化也许减弱了该酶的稳定性和活性。但天冬氨酰蛋白酶活性的减弱到底在多 大程度上和雌配子（胚囊）的育性有关，为何功能缺陷型的妨-/?在纯合和杂合状态下反而 不影响雌配子（胚囊）的育性等问题，还需要进一步的研宄。
[0006] 针对中国水稻广亲和资源丰富、亲和谱各异的特点，袁隆平提出了"水稻亚种 间亲和性模式"，提出了广亲和基因和辅助亲和性基因的假说，按亚种间亲和性表现，将水 稻品种分成广谱广亲和系、部分广亲和系、弱亲和系和非亲和系（袁隆平，1990)。"广亲和 基因"可以解释多数典型籼粳亚种间杂种不育现象，但进一步研宄发现在解释水稻广泛而 复杂的亚种间杂种不育和亲和现象及指导"广亲和系"的选育均存在不少问题(张桂权等， 1987 ;申宗坦等，1992 ;Sano, 1993)。张桂权和卢永根（1989,1993)利用台中65及其6个花 粉不育基因近等基因系、籼稻品种、粳稻品种和中间型品种，对栽培稻亚种间杂种的不育和 亲和性的遗传基础进行了研宄，提出了"特异亲和基因"的学术观点。他们认为籼粳杂种不 育主要表现为花粉不育，杂种至少受6个不育基因座位（fe、％、5b、似、和分）控制，花 粉不育基因的遗传模式符合单座位孢子体一配子体互作模式。在这些不育基因座位上，籼 稻的基因型大多数为#/欠，而粳稻的基因型大多为夕/夕，当基因型纯合时或夕/5〇， 花粉表现正常可育；当基因型杂合时，带夕基因的雄配子败育，？ 1花粉表现为半不 育；杂种不育性的高低取决于匕花粉不育基因杂合座位的多少和杂合座位等位基因间分化 距离的大小。（张桂权等，1994)。另外，引起杂种F 1花粉不育的6个基因座中fe、％、5b、似 和5·^别被定位在第1，5, 3,1和12号染色体上。最近，5?已被Long ei a/ (2008)克隆 出来。5?实际上是由免你和两个相邻的基因组成的复杂座位，等位基因 fei/编码一 个由257氨基酸组成的类泛素修饰因子E3连接酶，而Sa#在第5内含子发生一个G -T 的单位点的突变，导致翻译提前终止，最终产物只有217氨基酸；编码一个476氨基 酸组成的F-box蛋白（F-box protein)。与相比，发生一个单核苷酸突变，导致 编码产物第287氨基酸由苯丙氨酸（Phe)置换为丝氨酸（Ser)，从而丧失了控制杂种不育 产生的生物学功能。在这个水稻杂种雄性不育的系统中，是作为一个配子体因子，而 SaMlP SaFi通过胞间运输在它们定位的小孢子中扮演角色。SaMi, SaMj和SaFi中缺少任 一组件时，将不会产生杂种雄性不育。这种"两基因/三元件互作模型"很好解释了此位点 的杂种雄性不育。
[0007] 另外，目前关于栽培稻种间杂种不育基因 SI的相关研宄还较为浅显。SI基因是 一个非洲栽培稻与亚洲栽培稻的种间普遍存在的杂种不育位点，位于第6染色体短臂的末 端。Sl同时作用于雌雄配子，其败育机制较为复杂。因此对Sl基因的研宄还有很远的路要 走。但是现有技术中，由于种种问题的困扰，Sl基因最基本的定位情况和序列尚没有相关 的报道，严重阻碍了 Sl基因与栽培稻种间杂种不育关系的研宄发展。
【发明内容】
[0008] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术中针对栽培稻种间杂种不育基因分的 研宄不足，提供栽培稻种间杂种不育基因分的具体定位和序列克隆。
[0009] 本发明另一目的是提供所述分基因在水稻育种中的应用。
[0010] 本发明上述目的通过以下技术方案实现： 一种栽培稻种间杂种不育基因分，该分基因包括两个等位基因分-J和分-幻分-JW 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，分-成]核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。本发明的分基 因为国内首个克隆到的水稻的种间杂种不育基因，将为解决水稻种间杂种雌雄不育问题， 指导水稻育种，进一步提高水稻产量提供坚实的理论基础。
[0011] 本发明通过图位克隆的方法，首先开发出了适合分基因定位的多个分子标记，构 建出了适合定位的超大定位群体，对栽培稻种间杂种不育基因分进行了定位克隆，获得了 候选基因0RF12,并进一步测定了杂种双亲分等位基因各自的全长序列，发现杂种双亲的 Sl基因即表现出了等位相似性又表现出杂种不育性状原由的差异性。
[0012] 值得注意的是，本发明通过图位克隆的方法，逐步定位，最终获得了所述等位基因 分-J和分1韵核苷酸序列；在本发明的基础上，本领域技术人员可以通过其他方式，如人 工合成，合成所述分-J和分1韵核苷酸序列，以用于进一步的实际应用。
[0013] 所述栽培稻种间杂种不育基因分在水稻育种方面的应用也应该在本发明的保护 范围之内。
[0014] 本发明还提供了一组检测上述栽培稻种间杂种不育基因分的引物，包括上游引 物和下游引物；所述上游引物为48281F或51301F，下游引物为51682R ;其核苷酸序列分别 如SEQ ID NO. 3?5所示。
[0015] -种重组表达载体，由出发载体的多克隆位点插入上述栽培稻种间杂种不育基因 汾得到。
[0016] 一种重组基因表达盒，含有上述栽培稻种间杂种不育基因分。
[0017] -种转基因细胞系，含有上述栽培稻种间杂种不育基因分。
[0018] -种重组菌，含有上述栽培稻种间杂种不育基因分。
[0019] 水稻是人类最主要的粮食作物之一，也是我国的第一大农作物，世界上约有一半 的人口以稻米为主要粮食，而我国是世界上最大的水稻生产和消费国。水稻育种问题一直 是我们坚持不懈进行探索的重点课题。对于水稻的种间杂种不育问题，本发明经过大量探 索和研宄，首次克隆到了一种水稻种间杂种不育基因分，将为解决水稻种间杂种雌雄不育 问题，指导水稻育种，利用Sl位点的可知性培育替换掉Sl位点的杂种优势品种等，进一步 提高水稻产量提供坚实的理论基础。
[0020] 本发明利用粳稻IRAT216 (含分-J')及其包含非洲栽培稻分座位的近等基因系 IRAT216S1 (含分卞)构建的BC9F2分离群体，利用图位克隆法分离了分基因。定位工作主 要分三步进行。首先对3个分近等基因系（IRAT216Sl-gl，IRAT216Sl-g2, IRAT216Sl-g3) 的第6染色体短臂的整体扫描，找出它们的渗入染色体片段的相互重叠区，然后再利用小 群体进行分子标记连锁分析与初步定位，最后利用超大群体进行精细定位与基因预测。发 现了多个与分互作的基因。
[0021] 具体地，本发明对栽培稻种间杂种不育基因分的定位和克隆方法步骤如下： (1)近等基因系的获得与定位群体的构建。
[0022] 主要试验材料由粳型轮回亲本品种IRAT216和近等基因系IRAT216S1 (三类近等 基因系分别为 IRAT216Sl-gl，IRAT216Sl-g2, IRAT216Sl-g3)。
[0023] 近等