一种牛肠激酶的cDNA片段、高效表达重组质粒及其基因工程菌和表达方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及牛肠激酶真核表达，具体涉及牛肠激酶的的重组质粒、基因工程菌及 其表达方法。
【背景技术】
[0002] 近年来国内外学者对重组肠激酶（Enterokinase，EK)进行了研宄，所做的尝试 多是克隆与表达具有酶学活性的235个氨基酸的肠激酶轻链（EKL)。2002年Yuan等运用 被Lavallie等认为不能有效表达具有生物活性肠激酶轻链的Trx融合表达体系，在大肠 杆菌中表达了重组牛肠激酶轻链。与之相似，Gasparian等在2003年运用肠 Trx融合表 达体系在大肠杆菌中融合表达了人肠激酶轻链，但发现可溶性融合产物没有切割活性，只 有通过包涵体复性的方法才能恢复活性。2003年，Huang等从中国北方黄牛的十二指肠组 织中提取总RNA，以RT-PCR方法扩增得到肠激酶轻链cDNA，通过DsbA融合体系在大肠杆 菌中进行了表达，纯化后的融合蛋白具有酶切活性。1996年，Vozza等首先报道了用甲醇 酵母pich pastoris作为宿主菌制备肠激酶轻链的方法，经过分泌表达和离子交换层析与 亲和层析后，从发酵上清液中得到了具有活性的目标蛋白。2001年，Choi等在酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae系统中尝试了牛肠激酶轻链的分泌表达，并将His亲和标记引 入蛋白C端，发酵上清液经过亲和层析纯化，活性目标蛋白产量达到lmg/ml。在融合蛋白的 酶切反应中，他们还发现由于肠激酶的自身特性而导致被切蛋白降解的现象。2006年，李德 华等在pich pastoris表达系统中构建了重组牛肠激酶轻链工程菌，并进行了高密度发酵、 纯化及活性鉴定等方法的研宄。
[0003] 低表达量和昂贵的分离纯化成本是当今制约肠激酶大规模生产和应用的主要原 因。目前只有少数几个实验室能够制备基因工程牛肠激酶，但表达量都较低。巴斯德毕赤酵 母作为一类简单的真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的 特点外，又具有真核生物可对表达的蛋白质进行正确加工、修饰、合理的空间折叠等功能， 非常有利于基因的表达。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种高效表达牛肠激酶的方法，其是通过将目的基因进行 优化后转入酵母表达细胞进行高效表达，并进行高密度发酵和纯化，最终得到可用于工业 化生产和应用的重组肠激酶轻链。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下： 本发明高效表达牛肠激酶的CDNA片段序列为SEQ ID No. 4。
[0006] 本发明高效表达牛肠激酶的CDNA片段C末端还设置有his标签的编码序列。
[0007] 本发明高效表达牛肠激酶的重组质粒为pPICZ a A/eH表达质粒，其中的编码 序列为 SEQ ID No. 4。
[0008] 本发明高效表达牛肠激酶的基因工程菌为转染有pPICZ a A/eA/表达质粒的甲醇 酵母，所述表达质粒中的cDNA序列为SEQ ID No. 4。
[0009] 本发明高效表达牛肠激酶的基因工程菌为毕赤酵母。
[0010] 本发明高效表达牛肠激酶的表达方法，使用上述基因工程菌进行表达，表达质粒 为pPICZaA/eH表达质粒的甲醇酵母，所述表达质粒中的cDNA序列为SEQ ID No. 4。
[0011] 本发明高效表达牛肠激酶的表达方法中培养所述基因工程菌的培养基中甘油的 质量比为0. 1%~〇. 5%，甲醇的的质量比为0. 3~1. 0%，培养基的pH为3~6。
[0012] 本发明高效表达牛肠激酶的表达方法中培养所述基因工程菌的培养基中甘油的 质量比为0. 5%，甲醇的的质量比为0. 5%，培养基的pH为5。
[0013] 本发明对基因的密码子进行优化，优化后的基因片段可以实现甲醇酵母 对EKL基因的高效表达。本发明在基因序列的C末端插入了组氨酸标签，以利于对目 标蛋白的纯化。本发明对甲醇酵母的表达条件进行了优化，可以使重组的基因工程菌表达 牛肠激酶的量再增加1倍，进一步提高发酵效率，提高牛肠激酶的生产能力。
【附图说明】
[0014] 附图1为pPICZaA/eH双酶切的凝胶电泳图； 附图2为不同重组酵母菌株培养上清液的酶切活性检测结果； 附图3为Western Blot检测培养重组酵母菌上清液中rEKL表达的实验结果； 附图4为rEKL Ni亲和层析纯化结果； 附图5为不同EKL表达序列构建的表达菌株发酵不同时间的菌密度检测结果； 附图6为不同EKL表达序列构建的表达菌株发酵不同时间EKL表达量检测结果。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合附图和实施例对本发明进一步详细的说明。
[0016] 本发明所使用的培养基如下： Yro培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖。
[0017] BMGY 培养基：1· 34% YNB ( Invitrogen)，4 xl(T5 % 生物素，1% 甘油，1% 酵母提 取物，2 % 蛋白胨，100 mmol/L PB，ρΗ6·0。
[0018] BMMY 培养基：1. 34% YNB ( Invitrogen)，4 χ1(Γ5% 生物素，1% 酵母提取物，2% 蛋 白胨，lOOmmol/L ΡΒ，ρΗ6·0,0·5 % 甲醇。
[0019] FM22 培养基：每升 FM22 培养基包含：42. 9 g H2PO4,5g (NH4)2SO4, L 0 g CaS04.2H20,14. 3g K2S04,11. 7 g MgS04.7H20,40g 甘油，ρΗ4· 5。
[0020] 微量元素 PMT4 :2. 0 g CuS04.5H20,0· 08 g Nal，3. 0 g MnS04.H20,0· 2 g Na2Mo04*2H20, 0.02 g H3BO3,0.5 g CaS04*2H20,0. 5 g CoCl2,7 g ZnCl2,22 g FeS04*7H20, 0.2 g biotin，I mL cone. H2SO4)用于发酵时的添加物。
[0021] 实施例1牛肠激酶cDNA密码子序列的优化 EKL的氨基酸序列为SEQ ID No. 1，原cDNA编码序列为SEQ ID No. 2,经过优化后，设计 三个EKL的编码序列分别为SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5。为便于后期的载 体构建，在各片段的5'端增加 Xho I酶切位点，在3'端增加 Not I酶切位点。
[0022] 原序列及优化后的序列均委托Invitrogen全序列DNA合成，并插入到pMD18-T simple载体中。
[0023] 实施例2 pPICZaA/eH的构建 用Xhol /NotI双酶切pMD18-T/EKL质粒及pPICZ a A质粒，经1%的Agarose电泳，用 E.Z.N.A. Gel extraction kit进行胶回收，获取EKL DNA片段和pPICZaA载体片段。其 中 pPICZ a A 质粒购自 Invitrogen。
[0024] 通过T4 DNA连接酶，将载体 pPICZ a A (Xhol/Notl)片段和 DNA 片段 EKL(XhoI/ NotI)按照摩尔比为1:5的比例进行连接，构建pPICZ a A/表达载体。
[0025] 构建完成的pPICZaA/eH质粒转化DH5 a大肠杆菌，涂布Zeocin+ LB平板，筛选 阳性克隆。阳性克隆菌落扩大培养后，利用质粒抽提试剂盒提取pPICZ a A/质粒。附图 1 中 1 为 Marker ;2 为 pPICZaA/eH质粒；3 为经 Xhol/Notl 双酶的 pPICZaA/EKL 质粒，结果 显示经Xhol/Notl双酶切后，1%的Agarose电泳可见740