专利名称：一种黄牛肠激酶催化亚基的基因工程生产方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属基因工程技术领域。
背景技术：
基因工程实践中经常使用融合表达进行目标蛋白质的表达、生产，运用最多的融合蛋白或短肽标签为大肠杆菌硫氧还蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、金黄色葡萄球菌蛋白A、大肠杆菌麦芽糖结合蛋白或六组氨酸短肽等。借助于融合蛋白或短肽的生化特征和性质，融合表达能大大简化、方便产物的检测，性质研究和分离纯化。因此目前在基因工程中，从原核表达体系(如大肠杆菌)到真核表达体系(如哺乳动物细胞)都经常采用融合表达方法进行重组目标蛋白质的生产。但这同时也带来了新的问题，即融合蛋白的特异性去除问题。当重组蛋白质作为基因工程药品及其它一些用途时，目标产物必须是像天然蛋白质一样的完整产物，而不能以融合蛋白形式使用。因此融合表达产物必须进行产物后加工即融合蛋白在体外实施特定氨基酸序列的切割或断裂，才能获得完整的目标产物。目前最为常用的裂解方法为1.化学法用溴化氢断裂；2.蛋白酶法用凝血酶，活化的X因子或肠激酶特异性裂解。由于溴化氰为剧毒化合物，而且其切割识别位点为Met，因此实用性不强。而用蛋白酶进行切割时，要求工具蛋白酶1.能够识别并裂解特定的的氨基酸序列，而且要求特异性好；2.为避免杂质蛋白酶引发的不必要的裂解反应发生，需要高纯度的工具蛋白酶。目前国际上最常用的工具蛋白酶为凝血酶(识别位点Leu-Val-Pro-Arg↓Gly--Ser)，因子Xa(识别位点Ile-Glu/Asp-Gly-Arg↓)和肠激酶(识别位点Asp-Asp-Asp-Asp-Lys↓)，其中肠激酶和Xa切割后的产物和天然产物完全一致，而凝血酶切割后的产物比天然产物分别多二个氨基酸。目前使用的这些蛋白酶都是从天然来源(动物血液或肠)分离、纯化的，得率低，纯度高，因此价格昂贵，而且全部为进口产品，因此在大规模生产运用时，无疑会大大增加成本，而且由于痕量天然杂质蛋白酶的存在，会导致产物的降解。因此用基因工程方法生产这些工具蛋白酶已成为生物工程制药业及基因工程研究人员的急需。用基因工程方法生产肠激酶不仅能极大地降低成本，而且有效去除杂质蛋白酶、提高纯度，这一点对国内的生物工程制药业及基因工程研究人员尤为重要，因为国内使用的这些工具蛋白酶全部来源于进口。
发明内容
牛肠激酶为一异二聚体(在人则为异三聚体)的丝氨酸蛋白酶，体内主要产生部位为十二指肠，主要生理作用是将胰蛋白酶原转变为胰蛋白酶，它具有切割特异性好，裂解产物与天然产物一致(不残留任何识别序列氨基酸)，温度及PH适应范围宽，稳定性好。其轻链(即小亚基)为催化亚基，分离的轻链即具有肠激酶的酶活性和特异性。因此用基因工程方法生产肠激酶催化亚基，成为最为可行和简便的生产工具蛋白酶的路线和方法。肠激酶在COS细胞中表达水平较低。研究人员在大肠杆菌中将肠激酶催化亚基和DsbA融合表达，融合蛋白前引入信号肽序列，结果大多数表达产物仍为包涵体，在125克细胞中仅获得1mg活性肠激酶催化亚基(Bio-Technology 13982-987，1995)。而在毕赤氏酵母中表达的完整的肠激酶催化亚基产量为6.3mg/L，但是其分离纯化工艺比较复杂，必须经过离子交换柱层析Q-Sepharose和亲和层析STI-Sepharose等多步纯化(Bio-Technology 1477-81，1996)。
本发明专利需要解决的问题是在毕赤氏酵母中分泌表达有生物活性的黄牛十二指肠肠激酶催化亚基衍生物---肠激酶催化亚基-His6，并通过一步亲和层析进行分离纯化，获得的肠激酶催化亚基具有很好的切割融合蛋白的生物活性，完全达到和满足实际应用的需要，为基因工程下游过程中重组融合蛋白质的切割提供一个有效、价廉的工具酶。本发明具有重要的实用意义，尤其是对国内的生物工程制药业及基因工程研究人员具有重要的实用价值。
本发明的技术方案是1.构建一种含有组氨酸标签(His6)的中国黄牛肠激酶催化亚基编码基因和重组表达质粒用PCR方法扩增获得酿酒酵母α-MF信号肽基因-中国黄牛肠激酶催化亚基编码基因-His6融合基因，将此融合基因克隆至毕赤氏甲醇营养酵母整合型表达载体pAO815(Invitrogen公司)中，通过DNA序列分析。
2.含有组氨酸标签(His6)的重组中国黄牛肠激酶催化亚基表达菌株的构建和表达将重组表达质粒转化毕赤氏酵母，经过筛选获得阳性克隆，肠激酶催化亚基基因处于AOX启动子的控制下，经甲醇诱导得到肠激酶催化亚基-His6的分泌型表达。
3.含有组氨酸标签(His6)的重组中国黄牛肠激酶催化亚基的分离纯化表达上清经过透析，Ni2+柱一步纯化得到最终获得具有肠激酶生物活性的重组黄牛肠激酶催化亚基-His6产物。重组肠激酶催化亚基-His6为SDS-PAGE电泳一条带纯。
4.含有组氨酸标签(His6)的重组中国黄牛肠激酶催化亚基的性质研究该重组黄牛肠激酶催化亚基-His6能够用作为重组融合蛋白质特异性切割的一种有效、价廉的工具酶。在16℃下反应16小时，16ng重组肠激酶催化亚基-His6能够有效地切割20ug GST-VAS(Glutathione-S-transferase-Vasostatin)融合蛋白质，酶切效率达到95％以上。
5.含有组氨酸标签(His6)的重组中国黄牛肠激酶催化亚基的去除经过重组肠激酶催化亚基-His6切割过的GST-VAS混合物经过Ni2+亲和层析柱，收集穿过峰，从而获得去除了重组肠激酶催化亚基-His6的GST-VAS酶切产物。
本发明专利同已有的商业化的肠激酶不同之处在于，本发明的特色是在毕赤氏酵母中分泌表达了一个末端带有六个组氨酸的中国黄牛肠激酶催化亚基，并且通过一步Ni2+亲和层析柱纯化，获得了SDS-PAGE电泳一条带纯的、具有肠激酶生物活性的重组黄牛肠激酶催化亚基-His6产物，而且在反应结束后仍然可以通过一步Ni2+亲和层析柱从产物中去除重组黄牛肠激酶催化亚基-His6。
现有的、商业化的、从天然牛肠道中提取获得的肠激酶全酶分离、纯化困难，得率低，价格昂贵。而且由于牛肠道中有许多性质类似的丝氨酸蛋白酶存在，因此很难免有痕量天然杂质蛋白酶的存在，这些杂质蛋白酶在长时间作用时会导致目标产物的降解，降低目标产物的收率，并增加副产物。
本发明的生产工艺与已有报道的重组黄牛肠激酶催化亚基的生产工艺有明显的不同。首先，本发明表达的是源于中国黄牛肠道组织的肠激酶催化亚基；其次，国外学者在大肠杆菌中融合表达了DsbA--肠激酶催化亚基，融合蛋白前引入信号肽序列，但是结果大多数表达产物仍为包涵体，在125克细胞中仅获得1mg活性肠激酶催化亚基(Bio-Technology 13982-987，1995)，我们也曾在大肠杆菌中实现了中国黄牛肠激酶催化亚基和Trx的融合表达，表达产物具有较好的可溶性，对肠激酶小分子底物具有很好的催化活性(中国发明专利申请号01113770.3)，但是当我们继而将之作用于蛋白质大分子底物时，其蛋白酶活性却表现得较低。虽然完整的肠激酶催化亚基在毕赤氏酵母中也获得了表达，其表达产量为6.3mg/L，但是其分离纯化工艺比较复杂，必须经过离子交换柱层析Q-Sepharose和亲和层析STI-Sepharose等多步纯化(Bio-Technology 1477-81，1996)，STI-Sepharose是一种价格昂贵、稳定性和使用寿命较差的一种亲和层析介质。当在黑曲霉中表达时，肠激酶催化亚基纯化后的最高得率为1.9mg/L(J.Biotechnol.76(2-3)245-51，2000)。而本发明表达的肠激酶催化亚基-His6在毕赤氏酵母中呈分泌型表达、表达产物只要经过一步Ni2+亲和层析柱纯化即可获得具有肠激酶生物活性的重组黄牛肠激酶催化亚基-His6产物，其产率为5mg/L。整个纯化过程简便、快速、价廉。重组黄牛肠激酶催化亚基-His6对大分子的、含有肠激酶切割位点的融合蛋白底物具有很好的肠激酶催化活性。和Roche商品化的肠激酶催化亚基相比较，本发明获得的重组肠激酶催化亚基-His6的酶活性并没有因His-tag受到影响，其活性甚至高于Roche商品化的肠激酶催化亚基产品。Roche公司商品化的肠激酶催化亚基(3×3μg包装)售价210多美圆，使用时按1∶50酶切10-16小时，而本发明专利生产的重组肠激酶催化亚基-His6使用时按1∶1000的比例，活性明显高于Roche公司产品。由于本发明获得的重组肠激酶催化亚基-His6带有His-tag，因此在酶切完成后可以很方便地将酶解产物通过一步Ni2+亲和层析柱去除反应体系中的Ni2+亲和层析柱，极大地便利了目标产物的分离纯化。
四
图1.重组肠激酶催化亚基-His6表达产物SDS-PAGE分析图谱。
1.分子量标准蛋白质，分子量分别为94、66、43、31、14kDa(自上而下)；2.纯化后的重组肠激酶催化亚基-His6；
3.含有肠激酶位点的重组GST-VAS(GST-Vasostatin)蛋白质；4.经重组肠激酶催化亚基-His6切割后的重组GST-VAS蛋白质降解产物。
图2.不同剂量重组肠激酶催化亚基-His6切割重组GST-VAS(GST-Vasostatin)效率分析不同剂量的重组肠激酶催化亚基-His6(0，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0ng)加入到含20μg重组GST-VAS的50mM Tris-HCl，pH8.0溶液中，在16℃反应16小时，测定被降解的重组GST-VAS量。
图3.重组肠激酶催化亚基-His6切割重组GST-VAS(GST-Vasostatin)的动力学分析8.0ng重组肠激酶催化亚基-His6加入到含20μg重组GST-VAS的50mMTris-HCl，pH8.0溶液中，在16℃分别反应0，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，12.0，16.0小时，测定被降解的重组GST-VAS量。
五具体实施例方式1.合成下述PCR引物ASIG FWDccggtctcgaattcaaacgatgagatttccttcaatttttactgc；EK-ASG RVSctctggagtcacttcctccgacaattcttttctcgagagataccccttcttc；ASIG-EK FWDctcgagaaaagaattgtcggaggaagtgactccagag；EKHIS-RVSccggtctcgaattctaatgatgatgatgatgtagaaaactttgtatccactctg；其中引物ASIG FWD和引物EKHIS-RVS中引入了EcoR I的酶切位点。
引物ASIG FWD和引物EK-ASG RVS用来扩增来源于酿酒酵母的α-MF信号肽基因，引物ASIG-EK FWD和引物EKHIS-RVS用来扩增C末端带有六个组氨酸的肠激酶催化亚基-His6编码基因。由于引物EK-ASG RVS和引物ASIG-EK FWD具有互补配对区，将两种PCR产物各1μl混合，通过热变性、退火延伸，少量循环得到完整的α-信号肽-肠激酶催化亚基-His6基因。以之为模板，加入引物ASIGFWD和引物EKHIS-RVS，PCR得到大量α-信号肽-肠激酶催化亚基-His6全基因。两种PCR产物退火延伸条件如下94℃ 2分钟；94℃1分钟，68℃5分钟，8个循环；68℃4分钟。全基因扩增条件94℃5分钟；94℃1分钟，62℃1分钟，72℃1分钟，28个循环；72℃ 7分钟；4℃保温。
2.用限制性内切酶EcoR I酶切α-信号肽-肠激酶催化亚基-His6 PCR产物，同样用EcoR I酶切质粒毕赤氏酵母表达质粒pA0815，进行连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。PCR筛选阳性克隆并提取质粒进行酶切分析，并进行DNA序列分析确定。
3.将重组质粒pAO815-EKL-His6用Sal I酶切线性化，并用原生质球法转化P.pastoris GS115(his4)菌株(Invitrogen公司)。实验方法按照Invitrogen提供的标准操作进行。先将转化产物涂RD平板，待克隆长出后转移到MM平板和MD平板上筛选Mut+和Muts型转化子。挑取单菌落进行培养，培养后直接取菌液以5’AOX1和3’AOX1引物(Invitrogen)进行PCR分析。若α-信号肽-肠激酶催化亚基-His6基因整合到酵母基因组中并且为Mut+表型，PCR产物应有两条DNA条带2.2kb的醇氧化酶基因片段和1.2kb的目的DNA条带；若为Muts表型，则只有1.2kb的目的DNA条带。
4.肠激酶催化亚基-His6在毕赤氏酵母中的小量表达和筛选选取PCR鉴定为阳性的克隆进行3ml体系的小量表达，直接取表达上清酶切GST-VAS融合蛋白(含有EK酶切位点)确定其活性。选取表达上清液中肠激酶活性高且杂蛋白少的克隆进行大量表达。
5.肠激酶催化亚基-His6在毕赤氏酵母中的大量表达挑单菌落于25mlBMGY培养基(Invitrogen公司操作手册)中，30℃、300转/分钟振荡培养过夜至OD600＝2-6。室温下3000g收获菌体，转接于200ml BMMY(Invitrogen公司操作手册)中诱导表达。每隔24小时补加甲醇至终浓度0.5％，诱导表达四天。
6.肠激酶催化亚基-His6的分离纯化将200ml发酵液离心去除菌体，上清液对4升(20倍体积)10mM Tris-Cl，pH8.0透析48小时。透析产物直接过Ni2+螯合亲和层析柱，柱体积为5ml。平衡缓冲液为50mM Tris-Cl、10mM咪唑，洗脱缓冲液为50mMTris-Cl、250mM咪唑。以0.8ml/分钟流速上样，相同流速洗至基线后以0.5ml/分钟流速洗脱。洗脱峰对10mMTris-Cl，pH8.0透析24小时后冻存备用。
7.肠激酶催化亚基-His6活性分析以GST-VAS(GST-Vasostatin)为底物验证重组肠激酶催化亚基-His6的酶切活性。重组肠激酶催化亚基-His6的不同剂量效应分析每管酶切反应体系中加入底物GST-VAS 20μg，分别加入0，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0ng重组肠激酶催化亚基-His6，反应16小时。重组肠激酶催化亚基-His6的反应动力学分析每管酶切反应体系中加入底物GST-VAS 20μg和8ng重组肠激酶催化亚基-His6，分别反应0，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，12.0，16.0小时。反应缓冲液为50mM Tris-Cl，反应温度16℃。
以上反应结束后，用SDS-PAGE检验酶切结果并用Grab-it 2.5和Gelwork(UVP)软件进行定量分析，计算被酶切底物量。根据分析结果分别作酶切的酶量曲线和时间曲线。
8.将经过重组肠激酶催化亚基-His6切割过的GST-VAS混合物经过Ni2+亲和层析柱，收集穿过峰，从而获得去除了重组肠激酶催化亚基-His6的GST-VAS酶切产物。
由于在表达时，本发明在肠激酶催化亚基-His6基因前面添加了酿酒酵母α-MF信号肽，因此重组肠激酶催化亚基-His6可以在毕赤氏(Pichia)酵母中得到可溶性的、分泌表达。分泌表达的重组肠激酶催化亚基-His6由于C端引入了His-tag，可以通过Ni2+亲和层析柱一步得到纯化，从而极大地简化了分离纯化过程。通过与商品化的EKL(Roche)相比较，本发明获得的重组EKL-His的酶活性并没有因His-tag受到影响，甚至远高于商品化的EKL(Roche)的活性。Roche公司商品化的肠激酶催化亚基，使用时按1∶50酶切10-16小时；而本发明专利生产的重组肠激酶催化亚基-His6使用时按1∶1000的比例，活性明显高于Roche公司产品。本发明的重组肠激酶催化亚基-His6经过毕赤氏(Pichia)酵母表达和分离纯化后，最后的得率为5mg/L。获得的重组肠激酶催化亚基-His6具有良好的肠激酶活性，当以1∶1000(酶∶底物)稀释进行反应16小时后，基本可以完全酶解大分子蛋白质底物。其分离纯化方法非常简易、方便，而且由于重组肠激酶催化亚基-His6带有His-tag，极大方便了酶切反应完成以后肠激酶催化亚基的去除，从而最大程度地减少目标蛋白的污染。由于目前商品肠激酶的昂贵价格和在生物化学和分子生物学、生物工程、生物工程制药产业研究与开发中的广泛应用，本发明设计的中国黄牛肠激酶催化亚基-His6及其甲醇毕赤酵母表达菌株的构建、以及其分离纯化工艺具有广阔的实用前景。
权利要求
1.一种重组中国黄牛肠激酶催化亚基，其特征是该黄牛肠激酶催化亚基末端添加了组氨酸标签。
2.根据权利要求1所述的带有组氨酸标签的黄牛肠激酶催化亚基的基因工程生产方法，其特征是通过PCR方法构建末端添加了组氨酸标签的黄牛肠激酶催化亚基基因，将获得的基因克隆在毕赤氏酵母表达质粒中、转化毕赤氏酵母，带组氨酸标签的黄牛肠激酶催化亚基在信号肽的指导下分泌表达在培养基，经过Ni2+亲和层析分离纯化，制备获得重组黄牛肠激酶催化亚基。
3.根据权利要求1所述的重组黄牛肠激酶催化亚基的分离纯化方法，其特征是经过Ni2+亲和层析纯化、制备获得带有组氨酸标签的重组黄牛肠激酶催化亚基。
4.根据权利要求1所述的带有组氨酸标签的重组黄牛肠激酶催化亚基，其特征是能够特异性地识别并切割含肠激酶切割位点的底物。
5.根据权利要求1所述的带有组氨酸标签的重组黄牛肠激酶催化亚基的应用是作为工具蛋白酶用于蛋白质多肽及重组融合蛋白质的特异性断裂，适用于生物工程制药业及基因工程、生物化学、分子生物学等研究。
6.根据权利要求1所述的带有组氨酸标签的重组黄牛肠激酶催化亚基的去除方法，其特征是能够在酶切反应完成以后，利用Ni2+亲和层析从反应液中去除重组黄牛肠激酶催化亚基，从而最大程度地减少重组黄牛肠激酶催化亚基对目标蛋白的污染。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域。一种在末端添加了组氨酸标签的重组黄牛肠激酶催化亚基，该黄牛肠激酶催化亚基在毕赤氏酵母中获得了分泌性表达，经过Ni2+亲和层析一步分离纯化、制备获得带有组氨酸标签的重组黄牛肠激酶催化亚基，它能够特异性地识别并切割含肠激酶切割位点的底物，具有高效、价廉的特点，能够作为工具蛋白酶用于蛋白质多肽及重组融合蛋白质的特异性断裂，适用于生物工程制药业及基因工程、生物化学、分子生物学等研究。在酶切反应完成之后，利用Ni2+亲和层析能够方便地从反应液中去除重组黄牛肠激酶催化亚基。
文档编号C12N15/63GK1570097SQ200410014860
公开日2005年1月26日 申请日期2004年5月10日 优先权日2004年5月10日
发明者华子春, 方雷 申请人:南京大学