专利名称：一种人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白Ⅰ的生产及活性检测方法
技术领域：
本发明属基因工程生物技术领域。
背景技术：
肌钙蛋白(Troponin)包括3个亚基肌钙蛋白C，I，和T。肌钙蛋白I(Troponin I)是一个182个氨基酸的蛋白，它能够抑制肌动球蛋白的ATPase活性。1999年，Moses等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1999，962645-2650)首先在软骨中发现一个蛋白质，具有抑制bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)刺激的毛细血管内皮细胞增殖的活性，并证明该蛋白质为人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I。进一步的研究表明人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I具有抑制血管生成和肿瘤转移的生物活性(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1999，962645-2650)，其作用机理可能是通过和bFGF竞争bFGF受体而发挥作用(MicrovascularResearch，2002，6341-49)。由于肌钙蛋白I具有抑制血管新生和肿瘤转移的生物活性，因此在肿瘤和其它血管生成相关疾病的治疗上显现出良好的应用前景。
作为一个具有药物开发前景的蛋白质，建立高效的人源快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I生产方法和简易快速的生物活性鉴定方法是其走向应用的二个必要的基本条件。用重组DNA技术进行肌钙蛋白I的基因工程生产，成为最为可行和简便的生产路线和方法。Moses等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1999，962645-2650)在大肠杆菌中率先表达、纯化了重组人肌钙蛋白I，其主要生产工艺为包涵体产物变性、复性、浓缩、Progel-TSK G3000SWXL柱层析、Q-Sepharose HP柱层析。其主要生物活性测定方法为毛细血管内皮细胞增殖实验、鸡胚尿囊膜血管抑制活性实验、动物角膜口袋血管新生实验、动物肿瘤模型实验。国内重庆康尔威药业股份有限公司周益群等人(中国发明专利申请02129407.0，重组人肌钙蛋白I在大肠杆菌中的表达及其在抗肿瘤中的应用)也在大肠杆菌中表达、纯化了重组人肌钙蛋白I-His6。为了人肌钙蛋白I分离纯化的便利，他们在人肌钙蛋白I的C末端加上了6个连续的His，以便用Ni2+一亲和层析柱进行分离纯化。其生物活性测定方法为人血管内皮细胞生长抑制实验、肿瘤动物实验。周益群等人的纯化工艺较为简便，但是由于其最终纯化的产物为重组人肌钙蛋白I-His6，即在人肌钙蛋白IC末端加上了6个连续的His，重组人肌钙蛋白I-His6已经成为一个新的蛋白质，其在体内的安全性等性质将需要重新进行评价。在Moses等人的工艺中，使用的层析介质Progel-TSKG3000SWXL价格昂贵，在国内难以购买。而且两者的测活方法都是依赖于毛细血管内皮细胞增殖实验和各种动物模型实验，费时、代价昂贵、而且数据波动性大、重复性差。而所使用的血管内皮细胞目前没有细胞株、都是原代细胞，不同批次制备的原代血管内皮细胞由于材料来源的不同、实验之间的差异等原因而存在差异，因此用毛细血管内皮细胞增殖实验作为重组人肌钙蛋白I的生物活性测定方法和质量控制指标无疑存在着误差大、难以标准化等问题。而用动物模型实验作为日常的生物活性测定方法和质量控制指标则更加费时、费力、误差更大、难以标准化。因此发展更为适用、简便的重组人肌钙蛋白I的纯化工艺、以及建立稳定、简易的生物活性测定方法作为日常的质量控制指标是重组人肌钙蛋白I走向实用的两个重要的基本条件和基础。
发明内容
本发明专利需要解决的问题是建立适用、简便、廉价的重组人肌钙蛋白I纯化工艺、建立稳定、简易的重组人肌钙蛋白I生物活性测定方法作为重组人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I日常的质量控制指标，为人肌钙蛋白I作为抑制血管新生和肿瘤转移的治疗药物用于治疗肿瘤和其它血管生成相关疾病建立大规模、廉价生产的基础和简便、快速的生物活性监测和质量控制方法。本发明对于重组人肌钙蛋白I作为治疗肿瘤和其它血管生成相关疾病药物的开发和研究具有重要的实用意义。
本发明的目的可以通过以下措施来达到将人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I cDNA基因克隆在大肠杆菌表达质粒中，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达，表达产物经过包涵体精制，阳离子交换树脂柱层析、阴离子交换树脂柱层析、包涵体复性，纯化获得重组人肌钙蛋白I，经SDS-PAGE电泳检验为一条带，并经Western blotting验证。我们建立了Acto-S1Mg-ATPase活性测定作为肌钙蛋白I生物活性检测的方法，我们同时以血管内皮细胞增殖抑制实验和鸡胚尿囊膜血管抑制活性实验测定了重组人肌钙蛋白I抑制血管新生的活性，发现Acto-S1 Mg-ATPase活性测定和血管内皮细胞增殖抑制实验、鸡胚尿囊膜血管抑制活性实验之间存在着良好的剂量对应关系。Acto-S1Mg-ATPase活性测定方法能够用以反映人肌钙蛋白I抑制血管新生的生物活性的高低，从而成为一种简便、快速、易行的人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I的生物活性检测方法，作为重组人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I的日常质量控制指标之一。重组人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I高效、简便、廉价的分离纯化工艺的建立则为肌钙蛋白I的大规模生产提供了条件和基础。本发明工艺生产的肌钙蛋白I可在制备治疗肿瘤和血管生成相关性疾病药物中应用。
同已有的肌钙蛋白I的生产工艺的相比，本发明的特色和创新之处在于(1)我们建立了一个简便、价廉、高效的重组人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I表达和分离纯化工艺，所用的试剂和层析介质都是最常用、最便宜的，过程简便，获得的产物和天然肌钙蛋白I序列一致，具有明显的抑制血管新生和抑制血管内皮细胞增殖的活性，其表达水平为占菌体总蛋白质的40％，最终产量为26.7mg/升培养基。而在Moses等人的报道和周益群等人的中国发明专利申请中从未提及纯化后的重组人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I的最终得率或产量；(2)除了将已有报道中常用的毛细血管内皮细胞增殖实验和血管新生动物模型实验作为重组人肌钙蛋白I的生物活性测定方法和质量控制指标外，本发明还根据肌钙蛋白I在肌肉中原有的抑制肌动球蛋白ATPase活性的性质，将此一性质运用于抗血管新生和肿瘤转移的重组快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I的生物活性检测和质量控制，从而克服了细胞和动物模型活性测定实验存在的误差大、难以标准化、操作要求高、实验周期长、费用高等问题。为作为抗血管新生和抗肿瘤转移的重组人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I的生物活性检测和质量控制标准提供了一个简易、快捷、经济、方便、易于标准化的生物活性测定方法，这种方法在所有有关快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I用于抗血管新生和肿瘤转移的文献报道中都没有提及和应用，这种方法和常用的毛细血管内皮细胞增殖实验和血管新生动物模型实验互为补充。
四
图1.重组人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I表达产物SDS-PAGE图谱。
1.经IPTG诱导的pET28a-肌钙蛋白I/BL21(DE3)菌体总蛋白；2.pET28a-肌钙蛋白I/BL21(DE3)表达上清；3.pET28a-肌钙蛋白I/BL21(DE3)表达包涵体；4.初步纯化后的包涵体；5.DEAE Sepharose Fast Flow柱层析纯化产物；6.SP Sepharose Fast Flow柱层析纯化产物；7.中分子量蛋白质标准品(20μg)，由上至下为97.4KDa、66.2KDa、42.7KDa、31.0KDa、14.4KDa。
图2.重组人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I的western blot分析结果1.SP Sepharose Fast Flow柱层析的穿过峰；2.SP Sepharose Fast Flow柱层析的洗脱峰；3.中分子量蛋白质标准，由上至下为97.4KDa、66.2KDa、42.7KDa、31.0KDa、14.4KDa。
图3.重组人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I抑制Mg-ATPase酶活性实验图4.重组人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I抑制b-FGF刺激的牛毛细血管内皮细胞增殖实验图5.重组人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I抑制未受b--FGF刺激的牛毛细血管内皮细胞增殖实验图6.重组人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I抑制鸡胚尿囊膜新生血管生成活性实验1.生理盐水对照；2. 0.5nmol重组人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I；3. 1.0nmol重组人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I；4. 1.5nmol重组人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I；5. 5nmol重组人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I。
五具体实施例方式1.以人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I cDNA为模板，合成下述PCR引物引物15’-CTCACCATGGAGATGAGGAGAAGC-3’；引物25’-GCCTCGAGTGGCCTAGGACTCGGAC-3’；以引物1和引物2为PCR引物，进行PCR反应，反应体系为5μl 10×TaqPolymerase缓冲液，4μl 4dNTP(2.5mmol·L-1)，3μl MgCl2(25mmol·L-1)，引物1，2(50μmol·L-1)各1μl，加无菌双蒸水至总体积50μl；混匀加1滴石蜡油，离心，95℃水浴5min，加入0.5μl Taq DNA聚合酶(约3个单位)，94℃1min；64℃ 1min；72℃，1min。共25个循环，然后72℃延伸10min。获得的PCR产物和质粒pET28a(Novagen公司)分别用Nco I和Xho I限制酶于37℃消化8小时，经1％琼脂糖凝胶电泳回收片段，加入T4 DNA连接酶16℃连接反应20小时，转化大肠杆菌Top10感受态细胞。在含100mg·L-1氨苄青霉素的LB平板上挑选多个单菌落扩增培养，提取质粒DNA，经NcoI和XhoI双酶切、1％琼脂糖凝胶电泳，筛选获得阳性克隆，获得的阳性克隆进行DNA序列分析测定。
2.获得的阳性克隆pET28a-Tn I重组质粒转化E.coli BL21(DE3)菌株(Novagen公司)，过夜菌以1∶100稀释接种于LB培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.6～0.8后，加入IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE(分离胶15％，浓缩胶为5％，考马斯亮蓝R250染色)(见附图1)。表达菌体经超声破碎细胞，8000rpm离心10min收集菌体。
3.1升表达菌体湿重为0.8克，用50ml SolutionA(20mM Tris-Cl，pH7.5，0.1M NaCl，1mM DTT，2mM EDTA)悬浮，冰浴超声20分钟(5秒超声，5秒间隔)。超声后的混合物12000rpm，4℃下离心30分钟。沉淀部分在50ml的SolutionA和50ml的Solution B(20mM Tris-Cl，pH8.5，0.05M NaCl，1mM DTT，2mMEDTA)中分别重悬2次和1次，在12000rpm，4℃离心30分钟，共3次。离心后的沉淀依次在50ml Solution C(20mM Tris-Cl，pH 7.5，0.1M NaCl，1mM DTT，2mM EDTA，0.5％Triton-X 100)和50ml Solution D(1M Urea，25mM TEA/HCl，pH7.5，1mM DTT， 2mM EDTA)中重新悬浮，充分洗涤，12000rpm，4℃离心30分钟，弃上清，沉淀溶于20ml Solution E(8M Urea，25mM TEA/HCl，pH7.5，1mMDTT，2mM EDTA)，室温2小时或者4℃过夜，于12000rpm，4℃离心30分钟，弃上清得到精制包涵体约70mg，可以保存于-20℃。
4.将精制包涵体上DEAE Sepharose Fast Flow层析柱，柱参数为柱高8cm，直径1.3cm，流速1ml/min，平衡缓冲液为8M Urea，25mM TEA/HCl，pH7.5，1mMDTT，2mM EDTA。收集穿过峰，用SDS-PAGE电泳检验。
将DEAE柱层析穿过峰上SP Sepharose Fast Flow层析柱，柱参数为柱高8cm，直径1.3cm，流速1ml/min，平衡为8M Urea，25mM TEA/HCl，pH7.5，1mMDTT，2mM EDTA。以洗脱缓冲液(8M Urea，25mM TEA/HCl，pH7.5，1mM DTT，2mM EDTA，0.5M NaCL)进行洗脱，收集洗脱峰。
5.取SP柱层析洗脱峰在复性缓冲液(20mM Tris-Cl，pH7.5，0.3M NaCl，5mM DTT，2mM EDTA)中或者1mMHCl中透析2-3天，进行复性，将样品冻干。
6.重组人肌钙蛋白I抑制Acto-S1 Mg-ATPase活性测定320μl反应体系中含有0.25nmol Myosin S1片断，1.5nmol F-actin，2mM MgCl2，以及25μl H2O或不同浓度的重组人肌钙蛋白I，在冰上混匀放置，然后加入2mM ATP，25℃反应25分钟，再加入中止液2.4mlAAM溶液(丙酮∶硫酸∶钼酸铵＝2∶1∶1)，240μl 1M柠檬酸。在355nm下测定各个试管中的吸光度，以不加ATP的的反应管作为空白。
7.鸡胚尿囊膜血管检测重组人肌钙蛋白I活性实验取孵化8～9天鸡胚，在血管丰富处挑去三角形蛋壳，挑破壳膜，将重组人肌钙蛋白I加在灭菌滤纸上，再将滤纸贴在尿囊膜上面。用无菌胶带封口。给药3天后，打开鸡胚，在给药处滴加等量甲醇和丙酮的混合液，室温固定15分钟，待血液凝固后剪下尿囊膜，放入水中展平，进行观察和拍照。
8.重组人肌钙蛋白I的细胞测活在添加20％小牛血清、抗生素及3ng/ml的人重组bFGF的DMEM培养基中培养BCE细胞(牛毛细血管内皮细胞)至足够数量，加入0.05％胰蛋白酶消化，细胞重悬于含20％小牛血清的DMEM培养基中。约12500个细胞/0.5ml(孔)加入24孔板中，37℃(10％CO2)培养24小时后分别加入25μl空白对照及不同浓度的重组人肌钙蛋白I于各个孔中。30分钟后加入bFGF至终浓度1ng/ml。72小时后，将各孔细胞消化后计数。比较样品及空白孔中的细胞个数，可以计算出不同浓度重组人肌钙蛋白I的抑制率。
重组人肌钙蛋白I的表达水平为占细菌菌体总蛋白质的40％，经过分离纯化和复性后获得的重组人肌钙蛋白I经15％SDS-PAGE凝胶扫描分析，纯度＞95％(见附图1，2)，HPLC分析显示纯度为93.5％。1升摇瓶表达液中表达的菌体经过各步纯化后可获得26.7mg具有生物活性的重组人肌钙蛋白I纯品。重组人肌钙蛋白I能够明显地、呈剂量依赖性地抑制肌动球蛋白ATPase活性，其IC50＝6μM(见附图3)。重组人肌钙蛋白I可以抑制BCE细胞的增殖，并且呈剂量依赖关系(见附图4、5)，其ED50＝7.5μg/ml，对于其它细胞(如293T等)则没有抑制细胞增殖的活性。重组人肌钙蛋白I具有明显的抑制鸡胚尿囊膜新生血管生成活性和明显的血管抑制作用，5nmol重组人肌钙蛋白I导致鸡胚死亡(见附图6)。在1mM HCl中透析复性的重组人肌钙蛋白I也具有明显的抑制鸡胚尿囊膜新生血管生成活性。
权利要求
1.一种人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I的生产方法，其特征是通过重组DNA技术即基因工程方法构建表达质粒、经表达、纯化、复性，制备获得重组人肌钙蛋白I。
2.根据权利要求1所述的一种人肌钙蛋白I的生产方法，其特征是在大肠杆菌中表达重组人肌钙蛋白I。
3.根据权利要求1所述的一种人肌钙蛋白I的生产方法，其特征是复性缓冲液用含有高浓度变性剂的缓冲液溶解重组人肌钙蛋白I包涵体产物，然后对低盐的复性缓冲液进行透析、复性。
4.根据权利要求1所述的一种人肌钙蛋白I的生产方法，其特征是可以对1mM HCl复性液进行透析、复性，获得有生物活性的人肌钙蛋白I蛋白质。
5.根据权利要求1所述的一种人肌钙蛋白I的生产方法，其特征是对重组人肌钙蛋白I包涵体产物用含有Triton-X 100去垢剂和低浓度、中等浓度变性剂的缓冲液进行多次洗涤，去除杂质，初步纯化包涵体。
6.根据权利要求1所述的一种人肌钙蛋白I的生产方法，其特征是用阳离子交换树脂柱层析、阴离子交换树脂柱层析联合使用纯化重组人肌钙蛋白I蛋白质。
7.一种重组人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I的生物活性的测定方法，其特征是测定肌钙蛋白I抑制Acto-S1 Mg-ATPase活性。
8.根据权利要求7所述的一种重组人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I生物活性测定方法可用于重组人肌钙蛋白I蛋白质产品的生物活性检测和质量控制。
9.根据权利要求7所述的一种重组人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I生物活性测定方法，其特征是能够与测定人肌钙蛋白I抗血管新生和肿瘤转移、抑制血管内皮细胞增殖的动物模型和细胞实验联合使用，用于重组人肌钙蛋白I蛋白质产品的生物活性检测和质量控制。
10.根据权利要求1所述的一种重组人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I生产方法生产的重组人肌钙蛋白I在制备治疗肿瘤和血管生成相关疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域。本发明建立了一种人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I的生产方法通过重组DNA技术构建表达质粒、表达产物经过包涵体精制，阳离子交换树脂柱层析、阴离子交换树脂柱层析、包涵体复性，纯化获得具有抑制血管内皮细胞增殖和血管生成的生物活性的重组人肌钙蛋白I。本发明还建立了一种利用人肌钙蛋白I抑制Acto－S1 Mg－ATPase活性实验作为测定重组人肌钙蛋白I的生物活性指标和日常质量控制的方法。利用本发明生产的肌钙蛋白I可制备治疗肿瘤和血管生成相关疾病的药物。
文档编号C12N15/70GK1570105SQ200410014859
公开日2005年1月26日 申请日期2004年5月10日 优先权日2004年5月10日
发明者华子春, 颜明 申请人:南京大学