专利名称：N-糖基化基因工程改造毕赤酵母的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明提供了一种对毕赤酵母的 糖基化旁路进行基因工程改造的方法，包括有关的工程菌的构建。
背景技术：
毕赤酵母表达系统引起了广泛重视，并逐渐应用于药用蛋白质的生产。 但是，影响毕赤酵母表达系统在药用蛋白质领域的进一步广泛应用的主要限 制因素是毕赤酵母表达的糖蛋白质的糖苷链的结构与哺乳动物的不同，不能 用于人体。迄今为止，所有用于人体的基因重组糖蛋白都是用哺乳动物细胞或昆虫 细胞表达的。由于这两个系统本身的原因，使得重组糖蛋白药物的产量受限， 价格昂贵。如果毕赤酵母表达的糖蛋白具有人的糖苷链结构，将会有很大的 经济和社会意义。毕赤酵母的N —糖基化通路在起始阶段与哺乳动物的相同，在 oligosaccharyltransf erase作用下使(Glc) 3- (Man) 9- (GlcNAc) 2在内质网中 转移到新合成的蛋白上，接着在glucosidase I和II以及a-1, 2-mannosidase 作用下，成为带有Man8GlcNAc2的糖蛋白，此时糖蛋白从内质网进入到早期高 尔基体。在哺乳动物中，Man8GlcNAc2糖苷降解成Man5GlcNAc2，然后在 (3-N-acetylglucosaminyltransferase I (GnTI)酶的作用下力口上GlcNAc，在 mannosidase 1I作用下除去2个甘露糖残基，在GlcNAc transferase作用下加 上GlcNAc ， 在galactosyltransferase作用下加上半乳糖，在 sialyltransferase作用下唾液酸化。在酵母中，Man8GlcNAc2在 a—1， 6—mannosyltransf erase (Ochlp)白勺作用下^恭力口甘露、糖。a—1， 6—mannose 在mannosyltransferase禾口phosphomanosyltransferase作用下，继续延长， 形成高甘露糖糖苷结构。国外研究人员对毕赤酵母蛋白糖基化修饰途径和人源化改造情况进行了 研究。认为首先要去除酵母内源性糖基化反应的机制，然后在酵母的内质网 和高尔基体中导入人的糖基化反应因子，可达到酵母人源化糖基改造的目的。
Choi等用同源重组的方法，将毕赤酵母的a 1，6-甘露糖转移酶(0chlp)活 性的消除。将霉菌来源的a-1， 2-mannosidase C末端加上ER定位序列HDEL转入 到该细胞株。接着构建了三个文库第一个由定位于酵母内质网和高尔基体 的膜蛋白的N —端穿膜序列DNA的前导文库；第二个为含人、鼠、霉菌、线虫、 果蝇a-1，2-mannosidase催化区域DNA的文库；第三个为含人、蛙、线虫GnTI 催化区域DNA的文库。第一个前导文库如果与第二个或第三个联合应用时前导 结构即与催化区域结合产生一个编码嵌合蛋白的基因。作者以人纤溶酶原K3 片段为报告基因，用这三个文库转染上述基因改造过的细胞，进行联合筛选， 得到酿酒酵母顧N9前导序列与人GnTI催化区域组成的嵌合蛋白可以在酵母内 合成人源化糖苷链。以上研究表明，通过对酵母N-糖基化路径进行基因工程改造，即可产生 出人源化寡糖修饰的重组蛋白。同时，对毕赤酵母用基因工程的方法进行改 造不影响细胞的存活。该技术可以广泛应用到药用蛋白质的生产及蛋白质功 能的研究领域。发明内容本发明的目的就是提供一种对酵母N-糖基化路径进行基因工程改造的方法。本发明的另一目的就是提供经过糖基化基因工程改造，用于糖基化蛋白 表达的表达载体及工程菌株。在本发明的第一方面，就是提供了一种对毕赤酵母的糖基化旁路进行基因 工程改造的方法，其特征在于，其改构后的细胞株表达的糖基链更短，和人 的糖基之间的同源性更高，且不会影响宿主菌的生存活性。在本发明的第二方面，就是提供了一种通过权利要求书2所述方案获得的 酵母细胞株，其可以表达含有完整人源化糖苷链的糖蛋白。
图l: M5/pPIC9/HCGP-oLHa的诱导后SDS-PAGE鉴定结果。1-3:1号克隆 依次48， 72， 96hr的电泳；4-6: 2号克隆依次48， 72， 96hr的电泳；7-9: 4 号克隆依次48， 72， 96hr的电泳图2: M5/pPIC9/HCGP-oLHa酵母小摇上清的Western blot鉴定结果。M: Marker (97. 4KD， 66. 2KD， 42. 7 KD， 31. 0 KD， 20. 1 KD， 14. 4 KD) ; 1-3:分别
为l号克隆48h、 72h、 96h发酵上清的Western blot鉴定结果；4-6:分别为2 号克隆48h、 72h、 96h发酵上清的Western blot鉴定结果；7-9:分别为4号克 隆48h、 72h、 96h发酵上清的Western blot鉴定结果。
具体实施方式
本发明人通过深入而广泛的研究，首先，根据GeneBank中的信息，设计 0CH1引物，用PCR方法，获得毕赤酵母的0CH1序列，在OCHl序列ORF靠近5'端 引入2个终止子，重组到pPICZB质粒中，该质粒转染到GS115细胞内，获得0CH1 基因失活的重组子。用PCR方法，获得T. reesei 1， 2-mannosidase序列和酵 母HDEL序列，并将此二序列按ORF保持不变的方式拼接后，重组到pGAPZaA质 粒内，将此质粒转染到上述重组子，获得二级重组子M5。用PCR方法，从人细 胞中获得GnTI序列，从酿酒酵母中获得a-mannosyltransferase Kre2p序列， 将Kre2p的N-端穿膜序列与GnTI催化区域序列拼接后装入到pPIC9中，再转染 M5，获得糖基人源化的毕赤酵母细胞株，在此基础上完成了本发明。在本发明的一个实例中，获得了糖基人源化的毕赤酵母细胞株。在本发明的另一个实例中，构建并鉴定了工程菌M5/pPIC9/hCGP-oLHa ， Western blot鉴定证明蛋白降解现象较少。本发明的优点在于(1) 将pichia pastoris (毕赤酵母)的糖基化旁路进行基因工 程改造，获得改构后的细胞株M5，改构后的细胞株表达的糖 基链更短，和人的糖基之间的同源性更高，而且不会影响宿 主菌的生存活性。因此更有利于表达用于治疗的蛋白。(2) 将毕赤酵母M5用于蛋白表达，由于糖基较短，因此不仅可以 使蛋白在SDS-PAGE电泳上的条带比较清晰，而且使纯化更易 于进行。由于毕赤酵母M5的糖基经过改构，该菌的糖基为酵 母和人共有的基础糖苷链，因此纯化后用于人体可能引起的 潜在免疫反应会减弱，更有利于临床应用。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于 说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实 验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按 照制造厂商所建议的条件。
实施例l改构细胞株的获得首先，根据Gene Bank中的信息，设计0CH1引物，用PCR方法，获得毕赤 酵母的0CH1序列，在0CH1序列0RF靠近5'端引入2个终止子，重组到pPICZB质 粒中，该质粒转染到GS115细胞内，获得0CH1基因失活的重组子。用PCR方法， 获得T. reesei 1， 2-mannosidase序列和酵母HDEL序列，并将此二序列按ORF 保持不变的方式拼接后，重组到pGAPZaA质粒内，将此质粒转染到上述重组 子，获得二级重组子M5。用PCR方法，从人细胞中获得GnTI序列，从酿酒酵母 中获得a-mannosyltransferase Kre2p序列，将Kre2p的N-端穿膜序列与GnTI 催化区域序列拼接后装入到pPIC9中，再转染M5，获得糖基人源化的毕赤酵母 细胞株。实施例2工程菌M5/pPIC9/hCGP -oLHa的构建和鉴定首先构建pPIC9/HCGP -oLHa质粒，电转M5感受态得到的M5/pPIC9/HCGP -oLHa，选择表达量较高的克隆株作为宿主菌制备感受态细胞，再把构建好 的pPIC9K/HCG P -oLH a质粒转入M5/pPIC9/HCG P -oLH a中，通过G418筛选含 有pPIC9K/HCG P -oLH a质粒的高拷贝工程菌M5/pPIC9/HCG e -oLH a /pPIC9K/HCGP -oLHa 。由于GS115的糖基化很复杂，导致SDS-PAGE电泳的HCG电泳的条带很模 糊，不能确定其条带大小。而改构的M5菌.糖基链比较短，因此在SDS-PAGE电泳上表现为一条比较单 一的带，也能为下游的蛋白纯化带来方便(见说明书附图l， 2)。由图l，图2显示在1、 2、 4号克隆的72h、 96h发酵上清的Westernblot鉴 定中，在43KD附近有一条很明显的条带，蛋白降解现象较少。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文 献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样 落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>上海新生源医药研究有限公司<120> N-糖基化基因工程改造毕赤酵母<160> 5〈210〉 1〈211〉 1134<212> 醒<213> 毕赤氏酵母(Pichia stipitis)<221> CDS〈222> (1). (1134)〈223〉 0CH1基因序列〈400〉 11atgatt肌ca卿gggtgaggtt郷3ttgatagcagtgct￡Lgtcttgta_tttattgtac61ggctttttccgcacgttttccgtgccgggatcgtcacacagaacagaMcttcttcttct121aagttgcaatactcgagatacattccaattgggcta卿ctggactcaat181ttccagcccaac3肌aaggc朋gattacctctgtg3gax3gcaattatca241tttcagttcccatacgagtcg3gt犯gCCtatatctggcagacatggaaa301gtcgctttsgatgatgattcgtttccattgctt3cca^gt3Cttggg3t361gacaagaatcgtggc,tgatgtgtgcgaagagttgalc4213gCC3gttgtatctgacagttcctgacgttgctagagcttacaatatcatgcccaag兆c4813tCttg33ggccgacttcttcagatacctacc卿gg叫g541C3gt3ggtttg肌gCCg3t3gat卿tgggcactactttg601tacgacaaacCC3tC33CCCtggcttggttgtggg肌tcgaagctgacccagatagaccc661gactgggctg敏ggtacgccagacgtattcagttctgcctcaagccaaa721aaaggacatccaatgttgcgtgaattgatcgctgagatc3caga肌agactcttacaaga781gacagttg肌犯ggaggtgatatcatgaac841tggactggtcC3ggtalttggaccgalgccatttttaactacatgaacaacgttcttcaa901tcacccgaaaacttccagaatcacctggaagatcttcaca961ggcatgg咖tggccatagctatcgacgatgtattggttcttccaatcacttcgttcagt1021cccgatgtgggcca组gggagccaagaacatgaatgatccgatggcatacgctaagcat1081algtttctgggtagttgg肌acatgacgagatcacg犯accaaatgttaatt兆<210> 2〈211> 1572〈212〉 CDS<213〉 里氏木霉(Hypocrea jecorina)<223> T. reesei 1， 2-mannosidase基因序列<400> 2
atgagattccctagcagctccgtccttgcc61cc肌agccgggcgccacaaaacgtggatct121gccgcattcc卿cgtcgtg181cacccggtcagcaacagctttg￡ltg3tg3g241ggcttgg織cggctatcctC3tggggg3t301gtaccgcagatcaacttcaccacgactgcg361accaacattcggtacctcggtggcctgctt421agctccttgggaccctggta481gccaacggcctcaaggttgcgttcaxxact541ttcaaccctactgtccggag肌gtggtgca601ctggtgctcg兆tgg3C3Cggttgagcgac661gcgc卿sgggcgagtcgtatctcctgaat721ctgattggaacgtttgtc兆cacgagcaac781tccggcctcatggacagcttcta_cg3gta_c841gcgtttgcacactacaaggatcgctgggtc901ggctctcaccCgtCg3CgCgcaBggax:ttg961acgtcgccaaactcaggacatttggccagt1021attctcctgaacgagcaaaagtacattgac1081ggcacgtacacccagacggcttctggaatc1141gtgscgggcgccggcggctcgccgccctcg1201ttctgggtgscggcaccgtattacatcctg1261gcataccgcgtcacgggcgactccaagtgg1321attgagg3cgcatgccgcgccggcagcgcg1381肌cggcgggggtgcctctga1441gcgtacctgatctttgcggaggagtcggat1501tttgtcttta3C3Cgg郷Cgcaccccttt1561caccttgcttctcgggctca tcggacctgc gctggcgtat cccaacccta cgagggcggc agcagtcaag caccattttg cctttcccca tgacgacctc agaaacggct ggggctcgtc ggcaatcgat gccgacattg tgaacacgat ccttcagtat gttgccaacc aaggatcctc cgtgttcgag tctgcctatg acctgttgcg aggtcctttc aacagccttc tgaggcaggc tcaaacactg cccagcggtg tcccggaccc taccgtcttc tctagcaaca acgtcgctget aattggaagc ctgacgggaa acccgcagta tgcccagctt ccaaagggaa gcccggaggc atggcctggc ggtacctttc aggatagcag cggcagctgg ctgatcaaga tgtacctgta cgacccggtt cttggtgccg actcgaccat tgggcatctc acctttttgt cttcgtecaa cggacagtct tttggcggtg gcaacttcat cttgggaggc tttggaatca agcttgccag ctcgtacttt ggccccgaag gcttcgcgtg ggtggacagc tcccagtccg ggttctactc gtcggcagga cggccggaga cgctggagag cttgtactac caggacctgg cgtggg卿c gttgagtgcc tactcgtcca tcaacgacgt gacgcaggcc agcttctggt ttgccgaggc gctcaagtat gtgcaggtgc aggccaccgg cgggaacaaa agcatxcgtt catcatcacg acggggcggc〈210〉 3<211〉 12〈212〉 CDS〈213〉 酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)〈223〉 HDEL编码序列〈400〉 31 esc gsc gsg ttg 12<210〉 4〈211〉 1338〈212〉 CDS〈213〉 智人(Homo sapiens)<223〉 GnTI基因序列〈400〉 4<formula>formula see original document page 9</formula>
961 agaagtgaga aatacattag atttttcgag tacttggatt caaagggcgg tttttactat 1021 gaaaggtggg gagatgcacc agttcattcg attgctgcct cacttctttt gaaaaaagac 1081 gaaatcatcc attttgatga attaggctat aagcatatgc cttttggcac gtgtccatct 1141 gcatactacc tgagacttca acaaagatgt ctttgtgata gcaatcaccc agacaatatt1201 gatctcaatg tcatcagctg cctgagemga tggtggaagg acggcagcgg taaatacttc1261 c"tcaaacacg attcatag
权利要求
1. 一种对毕赤酵母的糖基化旁路进行基因工程改造的方法，其特征在于，它包括步骤a. 设计OCH1引物，用PCR方法，获得毕赤酵母的OCH1基因序列，在OCH1序列ORF靠近5’端引入2个终止子，重组到pPICZB质粒中，该质粒转染到GS115细胞内，获得OCH1基因失活的重组子。b. 用PCR方法，获得T.reesei 1，2-mannosidase的基因序列和酵母HDEL基因序列，并将此二序列按开放阅读框保持不变的方式拼接后，重组到pGAPZαA质粒内，将此质粒转染到上述重组子，获得二级重组子M5。c. 用PCR方法，从人细胞中获得GnTI序列，从酿酒酵母中获得α-mannosyltransferase Kre2p序列，将Kre2p的N-端穿膜序列与GnTI催化区域序列拼接后装入到pPIC9中，再转染毕赤酵母细胞株。
2. 如权利要求l所述的对毕赤酵母的糖基化旁路进行基因工程改造的方法，其特 征在于，步骤(a)中所述的0CH1基因为SEQ ID NO: 1所示的DNA序列。
3. 如权利要求l所述的对毕赤酵母的糖基化旁路进行基因工程改造的方法，其 特征在于，步骤(b)中所述的T. reesei 1, 2-ma皿osidase基因为SEQ IDN0:2所示的 DNA序列。
4. 如权利要求l所述的对毕赤酵母的糖基化旁路进行基因工程改造的方法，其 特征在于，步骤(b)中所述的HDEL基因为SEQ ID NO:3所示的DNA序列。
5. 如权利要求l所述的对毕赤酵母的糖基化旁路进行基因工程改造的方法，其 特征在于，步骤(c)中所述的GnTI基因为SEQ ID NO:4所示的DNA序列。
6. 如权利要求l所述的对毕赤酵母的糖基化旁路进行基因工程改造的方法，其 特征在于，步骤(c)中所述的oc-mannosyltransferase Kre2p基因为SEQ ID N0:5所 示的DNA序列。 .
全文摘要
本发明提供了一种将毕赤酵母的糖基化旁路进行基因工程改造的方法，除去酵母本身的糖基化旁路，同时将人源化糖基通路的基因导入到该细胞株，使其表达的糖蛋白具有哺乳动物细胞来源的特性，可直接用于人体。本发明可高效、简便、低成本地获得能表达完整人源化糖苷链的酵母细胞株，对一些具有潜在临床价值的糖蛋白进行表达和纯化的研究以及产业化研究。
文档编号C12N1/19GK101397561SQ20071016297
公开日2009年4月1日 申请日期2007年9月28日 优先权日2007年9月28日
发明者军 任, 孙九如, 翊 张, 梁光军, 娟 王, 黄阳滨 申请人:上海新生源医药研究有限公司