专利名称：重组人白细胞介素-11的高表达方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明提供了一种高效表达重组人白细 胞介素-11 (Recombinant Human Interleukin 11， IL-ll)的方法，以及有关的序列优 化、表达载体及工程细胞的构建。
背景技术：
白细胞介素ll主要由间充质来源的粘附细胞(mesenchymal _ derived adherent cell)产生，如骨髓基质细胞、基质成纤维细胞、人胚肺成纤维细胞和滋养层细胞。 IL-11是一种促血小板生长因子，可直接刺激造血干细胞和巨核祖细胞的增殖，诱 导巨核细胞的成熟分化，增加体内血小板的生成，而血小板功能无明显改变。IL-11 是人类生长因子家族成员，该家族成员包括生长激素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF) 以及其他生长因子等。人IL-ll基因定位于19号染色体长臂13区(19ql3.3 —ql3. 4),含有5个外显 子和4个内含子，长约7Kb 。人IL一11基因5'端有多个潜在的转录调控序列，如TATA 盒样序列(TATATAA)和AP—1位点(5' GGTGAGTCAG3')，其3'端在5591和 6762个核苷酸处各有一个聚腺苷酸化位点，为此可形成1.5kb和2.5kb的mRNA转录 物。人IL-llcDNA含597个bp的单一长开放读码框，编码199个氨基酸的多肽，其 中N端21个氨基酸为导肽，成熟蛋白为178个氨基酸组成，理论分子量19. 144KD， 不含半胱氨酸残基，亦无潜在的糖基化位点。近年来，随着对IL-11体内外调控作用及分子生物学研究的不断深入，人们认识
到IL-11是一个多功能的细胞因子，具有广泛的细胞生物学活性。最初发现它能刺 激IL一6依赖的鼠浆细胞瘤细胞系T1165的增殖。这也是基因工程重组IL一ll体 外测活方法的依据。另外，IL-11对造血系统的作用非常广泛，主要表现为与其他造 血因子协同，对各系造血均有不同程度的促进作用。国内外新近研究发现，IL-11除 最常见的造血活性外，还具有免疫调节、抗感染和保护黏膜上皮等功能。人体内的IL-11能刺激原始造血干细胞的生长，并能诱导巨核细胞前体细胞的分 化和成熟，促进巨核细胞和血小板生成，增加体内血小板数量并保持其功能。这一 家族的共同特点是使用gpl30作为信号转导蛋白。从而发挥其药效学作用，白介素 -ll的生物学作用主要有以下几点1、 促进原始祖细胞的增殖IL-ll与IL-3、 IL-4、 SCF和GM-CSF等可发挥协同作用， 可刺激多能造血干细胞、多能定向干细胞和单能定向干细胞增殖，可促使这些细胞 从GO期进入活性周期，縮短了细胞周期。2、 促进巨核细胞和血小板的生成。IL-11对巨核细胞和血小板生成的不同阶段 都有刺激作用，不仅可以使形成的巨核细胞集落数目及大小增加，而且可以提高外 周血小板的数量。3、 在各种动物模型中，同时还观察到IL-11的一些非造血系统效应包括调节 肠上皮细胞的生长(促进胃肠道粘膜损伤愈合)，抑制脂质形成，诱导急性期反应 蛋白合成，刺激破骨细胞的发育和神经祖细胞的增殖。自从1990年发现IL-11后，美国Genetics Institute公司就开始了rhlL-ll的研 究，用基因重组技术将IL-11基因重组到大肠杆菌中进行表达，获得与人体IL-ll具 有相同活性的重组人白细胞介素-11，共177aa，分子量约19KD，与天然的白介素-11 相比仅缺乏N端的脯氨酸，该缺失对体内外生物活性均无影响无糖基化。。1997年 ll月美国FDA批准了该公司的重组产品上市，商品名为Neumega，用于治疗肿瘤放 化疗导致的血小板减少以免于血小板输注。每支为5mg冻干粉，不含人与动物的血 源物质，主要添加剂为甘氨酸，用无菌注射用水溶解。皮下给药10 50 u g/(kg *d)， 患者都能较好耐受。临床研究表明，在高剂量化疗肿瘤患者中应用该公司生产的 rhIL-ll后，28%的患者避免了血小板输血，而对照组只有3%的患者无需输血小板。
本发明提供了一种高效表达重组人IL-11的方法。通过优化编码重组人IL-11的 核苷酸序列，采用大肠杆菌BL21 (DE3)表达体系融合表达缺乏N端1个脯氨酸的人 IL-ll，优化表达载体/宿主菌组合，获得高表达、极具产业化价值的一种重组人IL-ll的表达方法。发明内容本发明的目的就是提供一种优化的重组人IL-11蛋白。本发明的另一目的就是提供一种高表达重组人IL-11蛋白的方法，以及用于该方 法的表达载体及工程细胞构建。在本发明的第一方面，就是提供了一种优化的编码重组人IL-11蛋白的核苷酸 序列，在不改变IL-11的氨基酸序列的情况下，通过基因编码序列的优化设计，获 得优化的编码重组人IL-11蛋白的核苷酸序列。所述的核苷酸序列编码SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列 编码区与SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列有74%以上相同性。在另一优选例中，所述的核苷酸序列含有SEQ ID NO. l所示的核苷酸序列。在本发明的第二方面，提供了一种高表达重组人IL-11蛋白的工程细胞构建的方 法，通过将优化后的人IL-11编码序列与合适的表达载体连接，转入大肠杆菌，筛 选获得高表达工程细胞。在另一优选例中，所述的表达载体是pTHiohisA/IL-11。该载体提供了一个融 合蛋白一硫氧还蛋白(HP-Thioredoxin)。在本发明的第三方面，提供了一种工程细胞，其特征在于，整合有上述的表达载体。在另一优选例中，所述的工程细胞是大肠杆菌。在本发明的第四方面，提供了一种高表达重组人IL-ll蛋白的方法，该方法包括 步骤1. 挑选已确证构建成功的工程细胞，分别接种入相应管中，放入3(TC恒温摇床 上以200rpm转速培养过夜。2. 准备3个50ml离心管，加入LB和相应抗生素。取出过夜培养物，并按1%的 接种量转接到5mlLB培养基中，放入摇床中培养。3. 培养2~3小时左右，待培养物的OD,为0. 6 1之间，记录诱导起始点OD,值， 并取样lml，此为诱导前样品。4. 诱导表达在每个试管中加入诱导物IPTG(lmM)开始诱导。诱导开始4小时后， 每管分别取样lml。诱导16小时后再次每管分别取样lml。5. 测定诱导前后菌液的0D600，离心，收集菌体，用适当体积的水重悬，使各样 品的菌浓度一致。进行SDS — PAGE电泳检测。表达的融合蛋白经EK酶切后，经进一步纯化可获得目的蛋白重组人IL-ll。本发明的优点在于(1) 选用的是大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞，通过施加抗生素筛选出多拷贝转 化细胞，进而筛选出高表达工程细胞。(2) 优化后的重组人IL-11蛋.白基因非常适合在头肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞 中表达，具有高表达、高稳定的特点。 .(3) 蛋白高水平可溶、融合表达，纯化工艺简便，回收率高，生产成本降低。6
图l. IL-11理论序列与IL-ll优化序列的同源性比较。Query:天然IL-11基因 序列；Sbjct:优化的IL-11基因序列。
具体实施方式
本发明人通过深入而广泛的研究，通过基因编码序列的优化设计，将优化后的 人IL-11编码序列转入大肠杆菌，从而实现了人IL-ll高效表达。在此基础上完成了 木发明。本发明根据人IL-11天然氨基酸序列，按密码子偏爱性，在不改变氨基酸序列 的条件下，优化人IL-ll基因，然后全基因合成重组人IL-11蛋白的目的基因序列， 将该基因克隆到pUC57中测序验证。优化后的人IL-11编码序列与表达载体pTHiohisA连接，转入大肠杆菌，通过施 加抗生素筛选出的表达工程细胞，再通过小摇表达筛选获得高表达工程细胞。摇瓶试验表明，诱导4小时后，目的蛋白占总蛋白20%以上，表达水平100mg/L 以上。在本发明的一个实例中，构建了生产重组人IL-ll的大肠杆菌表达工程细胞， IPTG诱导，高水平可溶表达。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常 按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例l表达质粒的构建和高表达工程菌株的获得根据人IL-ll天然氨基酸序列，按密码子偏爱性，在不改变氨基酸序列的条件 下，全基因合成重组人IL-11蛋白的目的基因序列，将该基因克隆到pThioHisA中并 测序验证。通过PCR扩增得到目的人IL-11基因，用BamHI+EcoRI双酶切(MBI， 2*Tango , 37 °C) PCR产物及pThioHisA质粒(购自Invitrogen公司)。将两个片段用T4 DNA连接 酶进行连接，连接产物转化进入大肠杆菌DH5ci (购自Promega公司)，在含有氨苄青 霉素的LB平板上挑选克隆，小量制备质粒，通过双酶切/PCR鉴定筛选出阳性克隆。 大量扩增确证的pThioHisA/IL-11质粒，获得含有IL-ll的重组质粒 pThioHisA/IL-11。表达质粒pThioHisA/IL-ll经测序验证后，转化进入转化进入己制备好的大肠 杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，涂布含30u g/mL卡那霉素的LB平板，然后在转化平 板上挑取单克隆，用碱裂解法抽提并检测质粒。将确证含有表达质粒pThiHisA/PTH 的单克隆在含50u g/mL氨苄青霉素的LB平板上保存。实施例2重组人IL-11的表达及表达形式的确定挑选一株确证好的表达工程菌BL21 (DE3) /pThiHisA/IL-11，用LB培养基进行 培养及用IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳检测是否有目的条带的出现，并分析其表达 量。取一部分发酵后的菌液离心，重悬于pH 7.4， 20mM PB， +2. 5mM EDTA缓冲液， 在冰浴下超声破菌，离心收集超声上清和超声沉淀，SDS-PAGE电泳检测，确定其表 达形式。分析其超声上清和超声沉淀，目的蛋白绝大部分在上清中，表明目的蛋白
是以可溶形式表达。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单 独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域 技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利 要求书所限定的范围。 序列表<110>上海新生源医药研究有限公司<120〉重组人白细胞介素-ll ^高表达方法<160> 2<210> 1<211〉 534<212> DNA<213> 人工序列<221> misc一feature<222〉(1). . (534)<223>优化的重组人IL-11基因<400> 1ggaccaccac ctggaccacc tcgtgtttct ccagatcctc gtgctgaact tgatagtaca 60gtacttctta cacgttctct tcttgctgat acacgtcaac ttgctgcaca acttcgtgac 120aaattcccag ctgatggaga tcacaatctt gattcacttc caactcttgc aatgagtgct 180ggagcacttg gagctcttca acttccaggt gtacttacac gtcttcgtgc tgatcttctt 240tcatatcttc gtcatgtaca atggcttcgt cgtgcaggtg gatcttcact taagactctt 300gaaccagaac ttggaactct tcaagcacgt cttgatcgtc ttcttcgtcg tcttcaactt 360cttatgtcac gtcttgcact tccacaacca ccaccagatc caccagctcc accacttgct 420ccaccatcat cagcttgggg aggtattcgt gcagcacatg ctatacttgg aggacttcat 480cttacacttg attgggcagt acgtggactt cttcttctta agactcgtct ttga 534 <210> 2<211> 177<212> PRT<213> 智人<400> 2Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala15 10 15Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp20 25 30Thr Arg Gin Leu Ala Ala Gin Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp35 40 45Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala50 55 60Gly Ala Leu Gin Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu65 70 75Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gin Trp Leu Arg80 85 90Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly95 ■ 105Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gin Leu110 115 120Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gin Pro Pro Pro Asp Pro Pro125 130 135Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly lie ArgGly Ala LeuArg Ala AspArg Ala GlyThr Leu Gin140 145 150Ala Ala His Ala lie Leu Gly Gly Leu 、 His Leu Thr Leu Asp Trp 155 160 165Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu 170 175 17权利要求
1.一种高表达人白细胞介素-11蛋白的方法，其特征在于，它包括步骤(a)获得优化的白细胞介素-11的DNA序列；(b)构建合适表达载体；(c)转化宿主细胞，筛选获得高表达的工程细胞。
2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，步骤(a)中所述的优化的白细胞介 素-ll的DNA序列编码如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列，较佳的，其核苷酸编 码序列为SEQ ID N0:1。
3. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，步骤(a)中所述的优化的白细胞介 素-ll的DNA序列被克隆入合适的表达载体。较佳地，步骤(b)中所述的表达 载体是pTHiohisA/IL-11。
4. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，步骤(c)中所述的工程细胞，含有 权利要求3所述的表达载体或权利要求2所述的编码重组人白细胞介素-ll的 DNA序列。较佳地，所述的工程细胞是大肠杆菌。
全文摘要
本发明提供了一种重组人白细胞介素-11的核苷酸序列，高效生产重组人白细胞介素-11的生产方法，以及有关的工程细胞构建、表达和纯化的工艺。优化后的重组人白细胞介素-11基因，非常适合在大肠杆菌中表达，同时通过发酵与纯化工艺优化，提高了表达量，具有高表达、高稳定的优点。本发明可高效、简便、低成本的获得重组人白细胞介素-11纯品。
文档编号C12N15/09GK101165181SQ20071016297
公开日2008年4月23日 申请日期2007年9月28日 优先权日2006年9月29日
发明者军 任, 朱飞云, 黄阳滨 申请人:上海新生源医药研究有限公司