专利名称：白细胞介素-6的生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明公开的是一种具有明显抗癌性能，增加血小板的生物细胞因子的生产方法，特别是使该生物活性蛋白通过工程菌种发酵提取的方法及其相关提纯步骤。
白细胞介素-6(Interleukin-6)是一种生物学活性非常广泛的细胞因子，许多细胞可产生白细胞介素-6(即IL-6)，包括T细胞、B细胞、单核细胞、圆锥母细胞、内皮细胞等。分裂素和抗原可刺激T细胞和B细胞产生IL-6。IL-6具有明显抗癌活性，增加血小板的生物免疫调节，可用于肿瘤和造血功能障碍的治疗。通常的利用培养人体细胞或者细胞株生产IL-6的方法产量很低，无法满足临床试验或作为治疗药物的需要，本发明是随着基因工程的突起和发展而发明的。使生物活性蛋白能通过菌种的发酵提取，使该菌种具有IL-6插入结构基因。
本发明的目的是提供一种从菌种的前期构建、培养，到蛋白纯化的生产工艺过程，即一种符合工业化要求，成本低，而有高收率，可用于人体的IL-6的生产工艺。
本发明的工艺过程包括a利用PCR技术，构建高效表达的白细胞介素-6的工程菌种;
b对上述菌种5′末端功能基因段中的碱基进行修饰，并插入第二个SD序列，即构建其表达载体;
c发酵，大肠杆菌高效表达该菌种。
该工艺过程还包括用分子筛凝胶过滤及高效液相层析的提纯过程。
前述工艺过程a可以改为(1)从培养U937细胞株中，抽取MRNA，转录成CDNA;(2)设计、合成寡核苷酸引物，包括五末端引出物中HindⅢ和Ndel酶切位置和三末端引物的Xbal的酶切位置;(3)以U937CDNA为模板，PCR扩增，得到白细胞介素-6基因片段;(4)用凝胶电泳将该片段分离回收;(5)将该片段克隆到PCR2000载体中转入DH25受菌体;(6)进行筛选白斑菌落，酶切。
前述工艺过程b中的对上述菌种5′末端动能基因段中的碱基进行修饰可包括(1)将通过转译理论合成的6个DNA片段经T4磷酸化酶、连接酶、电泳进行分离，得到143碱基对的DNA片段;(2)从PCR白细胞介素-6载体中，经TaqⅠ/XbaⅠ酶切、分离，得到454碱基对的DNA片段;(3)将454碱基对片段与上述143碱基对的DNA片段连接，得到597碱基对片段。
前述工艺过程中，构建的白细胞介素-6的表达体为(1)载体PEX-2经BsrBI/SspI酶切、分离，得到DNA大片段；(2)除去Amp基因，与Kan基因片段连接得到PKEX-2；(3)PKEX-2经HindⅢ和XbaⅠ酶切，再与597碱基对的DNA片段连接，转化到DH25受菌体中，经酶切和DNA序列鉴定，得到阳性克隆PKEXIL-6;(4)将PKEXIL-6载体DNA转到N4830-1大肠杆菌中，得到白细胞介素-6的工业菌种。
前述工艺过程中所述的发酵用大肠杆菌高效表达该菌种可改为(1)将阳性克隆PKEXIL-6在100mlLB培养基接种过夜;(2)以1∶50稀释到发酵培养液中，在25-35℃振摇过夜，温度达42℃时，诱导3-6小时，收菌，用SDS-PAGE电泳，染色;(3)将菌种破碎细胞、离心、分离，将沉淀物洗涤、离心、得到包涵体。
前述工艺过程中所述的提纯过程可改为(1)将用大肠杆菌高效表达的白细胞介素-6的包涵体溶解于盐酸胍溶液，搅拌0.8-1.2小时，用分子凝胶过滤，SDS蛋白电泳、收集主峰;(2)在缓冲溶液中稀释，使复性;(3)经超浓缩后用凝胶柱层析，收集主峰，高效液相纯化。
本发明的优点在于1、用该方法进行生产，产量明显提高，用大肠杆菌高效表达的白细胞介素-6中，IL-6蛋白占菌体总蛋白不低于20%。
2、用该方法生产的IL-6纯度高，经纯化的IL-6纯度不小于97%，可直接临床应用于人体。
3、构建出高效表达IL-6的工程菌种，使IL-6能够工业化生产，为其进一步的临床应用开辟了道路。
4、用本方法生产的IL-6成本远低于原有的实验方法。
5、活性高，最终纯品的比活性不低于1×108单位/ml。
图1为IL-6DNA序列图;
图2为PKEX-2 IL-6表达构造图。
下面结合附图作进一步综合说明图1 IL-6DNA序列，由合成的IL-6五末端基因片段(1-101碱基)，与天然IL-6基因片段(102-558碱基)组成。所得IL-6蛋白结构与天然IL-6蛋白结构相同。
一、IL-6功能区基因的克隆从培养U937细胞株中，抽取mPNA，然后转录成CDNA设计合成寡核苷酸引物五末端引物CCA AGC TTC ATA TGC CAG TAC CCC CAG GA包括HindⅢ和NdeⅠ酶切位置三末端引物CTC TAG ACT ACA TTT GCC GAA G包括XbaⅠ酶切位置以U937CDNA为模板，PCR扩增，获得IL-6基因片段，将上述PCR扩增DNA片段，经凝胶电泳分离、回收后，直接克隆到PCR2000载体中，转入DH25受体菌，筛选白斑菌落，酶切和DNA序列检定，获得阳性克隆的PCRIL-6。
二、半合成的IL-6基因片段通过计算机分析，并运用最优化转译理论，本发明设计、合成了下面六段DNA片段(1)AGC TTG GGT ATT AAT AAT GTA TCG ATT AAA TAA GGA GGA ATA ACA(2)TAT GTT ATT CCT CCT TAT TTA ATC GAT ACA TTA TTA ATA CCC A(3)TAT GCC GGT TCC GCC TGG TGA AGA TTC TAA AGA CGT TGC TGC T(4)GGT GCG GAG CAG CAA CGT CTT TAG AAT CTT CAC CAG GCG GAA CCG GCA(5)CCG CAC CGT CAG CCG TTA ACC TCT TCC GAA CGT ATC GAC AAA CAG ATC CGT TAC ATC CT(6)CGA GGA TGT AAC GGA TCT TTG TCG ATA CGT TCG GAA GAG GTT AAC GGC TGA C上述DNA片段，经T4磷化酶、连接酶、电泳分离后，得到143碱基对的DNA片段。从PCRIL-6载体中，经TaqⅠ/XbaⅠ酶切，分离得到454碱基对的DNA片段。然后，与上述143碱基对的DNA片段连接，进而得到597碱基对的DNA片段。
三、构建IL-6的表达载体载体PEX-2经BsrBI/SspⅠ酶切，分离得到DNA大片段，除去Amp基因，然后与Kan基因片段连接，得到PKEX-2，PKEX-2经HindⅢ和XbaⅠ酶切，与上述597碱基对的DNA片段连接，转化到DH25受菌体中，经酶切和DNA序列分析鉴定，得到阳性克隆PKEXIL-6，最后，使PKEXIL-6载体DNA转到N4830-1大肠杆菌中，进而得到IL-6工程菌种。
四、大肠杆菌高效表达IL-6将上述阳性克隆，在100毫升LB培养基(10g/L Peptone，5g/L Yeast Extract 5g/L Nacl，20mg/L卡那霉素)接种过夜后，以1∶50稀释到发酵培养液中(5g/L Yeast Extract 5g/L葡萄糖7g/L K2HPO4，8g/L KH2PO4，5g/L(NH4)2SO4，1g/L mgSO47H2O，3ml/L微金属液，3ml/L维生素混合液，20mg/L卡那霉素)。在30℃下振摇过夜，当OD600达到10-50时，将温度增高至42℃，诱导3-6小时，常规收菌后，用SDS-PAGE电泳、染色。薄层扫描仪分析表明。IL-6蛋白占体总蛋白不低于20%。
收到的菌种，经French Pressarer在5MPa下，破碎细胞或用超声破碎仪破碎细胞、离心、分离，其沉淀物经2M脲素液洗涤后，离心，得到包涵体。
五、IL-6的变性和纯化将上述包涵体容解于6M盐酸胍溶液(0.1M Tris-HCL5mMEDTA/1mm DTT PH8.0)在室温搅拌1小时，经分子凝胶过滤，SDS蛋白电泳鉴定后，收集主峰，然后，1∶10稀释在(0.1MTris-HCL PH8.0)缓冲溶液中，复性。此稀释液经超滤浓缩后，上样到另一凝胶柱中层析，收集主峰，最后经高效液相纯化，得到纯品，纯品由SDS-PAGE电泳和HPLC检定，纯度不小于97%。
六、活性测定所有样品的活性测定，是用7TD1杂交细胞株进行测定的(Van Snick et al 1986 Proc Natl Aead Sci U S A 83∶9678-9683)最终纯品的CL活性不低于1×108单位/毫克。
权利要求
1.一种白细胞介素-6的生产工艺，其工艺过程包括a利用PCR技术，构建高效表达的白细胞介素-6的工程菌种；b对上述菌种5′末端功能基因段中的碱基进行修饰，并插入第二个SD序列，即构建其表达载体；c发酵用大肠杆菌高效表达该菌种。
2.根据权利要求1所述的白细胞介素-6的生产工艺，还包括用分子筛凝胶过滤及高效液相层析的提纯过程。
3.根据权利要求1或2所述的白细胞介素-6的生产工艺，所述工艺过程a可改为(1)从培养U937细胞株中，抽取MRNA，转录成CDNA;(2)设计、合成寡核苷酸引物，包括五末端引出物中HindⅢ和Ndel酶切位置和三末端引物的Xbal的酶切位置;(3)以U937CDNA为模板，PCR扩增，得到白细胞介素-6，基因片段;(4)用凝胶电泳将该片段分离回收;(5)将该片段克隆到PCR2000载体中转入DH25受菌体;(6)进行筛选白斑菌落，酶切。
4.根据权利要求1或2所述的白细胞介素-6的生产工艺，所述工艺过程b中的对上述菌种5末端动能基因段中的碱基进行修饰包括(1)将通过转译理论合成的6个DNA片段经T4磷酸化酶、连接酶、电泳进行分离，得到143碱基对的DNA片段，(2)从PCR白细胞介素-6载体中，经TaqⅠ/XbaⅠ酶切、分离，得到454碱基对的DNA片段;(3)将454碱基对片段与上述143碱基对的DNA片段连接，得到597碱基对片段。
5.根据权利要求1或2所述的白细胞介素-6的生产工艺，所述的构建其表达载体为(1)载体PEX-2经BsrBI/SspI酶切、分离，得到DNA大片段；(2)除去Amp基因，与Kan基因片段连接得到PKEX-2，(3)PKEX-2经HindⅢ和XbaⅠ酶切，再与597碱基对的DNA片段连接，转化到DH25受菌体中，经酶切和DNA序列鉴定，得到阳性克隆PKEXIL-6;(4)将PKEXIL-6载体DNA转到N4830-1大肠杆菌中，得到白细胞介素-6的工业菌种。
6.根据权利要求1或2所述的白细胞介素-6的生产工艺，所述的发酵用大肠杆菌高效表达该菌种为(1)将阳性克隆PKEXIL-6在100ml LB培养基接种过夜;(2)以1∶50稀释到发酵培养液中，在25-35℃振摇过夜，温度达42℃时，诱导3-6小时，收菌，用SDS-PAGE电泳，染色;(3)将菌种破碎细胞、离心、分离，将沉淀物洗涤、离心、得到包涵体。
7.根据权利要求2所述的白细胞介素-6的生产工艺，所述的提纯过程为(1)将用大肠杆菌高效表达的白细胞介素-6的包涵体溶解于盐酸胍溶液，搅拌0.8-1.2小时，用分子凝胶过滤，SDS蛋白电泳、收集主峰;(2)在缓冲溶液中稀释，使复性;(3)经超浓缩后用凝胶柱层析，收集主峰，高效液相纯化。
全文摘要
白细胞介素-6的生产工艺。本发明系利用PCR技术获得白细胞介素-6(记为IL-6)的基因片断，并引入第二SD序列，从而得到半合成的IL-6的功能基因，构建高效表达的IL-6的工程菌，该菌种在一种培养基中培养，并从工程菌中分离表达的包函体，经抽提复性后得到IL-6活性蛋白。本方法用来制作有明显抗癌活性，能增加血小板的生物调节剂IL-6，即利用基因工程的菌种发酵工艺工业化生产高纯IL-6。
文档编号C12P21/00GK1113954SQ9410660
公开日1995年12月27日 申请日期1994年6月24日 优先权日1994年6月24日
发明者奚绍祁, 孙玉昆 申请人:哈尔滨市医药工程技术研究开发中心