一种他克莫司浸提方法
【专利摘要】本发明属于医药技术领域，特别涉及从一种链霉菌菌体中流化床浸提他克莫司的新工艺，包括发酵液的预处理、板框过滤菌体的收集、闪蒸干燥、菌体流化床浸提。利用本发明流化床方法浸提他克莫司，提取收率最高可达94％以上，溶剂使用量少。且本发明工艺设备投资少，操作步骤简单，浸提得到的他克莫司有助于后续工艺的纯化，该方法通用性强，易推广，可以进行工业化生产。
【专利说明】
_种他克莫司浸提方法
技术领域
[0001]本发明属于医药生物技术领域，特别涉及一种他克莫司浸提方法。
【背景技术】
[0002]他克莫司是微生物的次级代谢产物，具有选择性较好的强免疫抑制作用，主要用于器官移植后的抗排斥用药，他克莫司和孢菌素A的发现极大推动了器官移植的发展。
[0003]他克莫司由日本藤泽公司研发，作用机制和环孢菌素相同，抑制T细胞活化基因的产生(对γ-干扰素和白细胞介素-2等淋巴因子的mRNA转录有抑制作用)，同时还抑制白细胞介素-2受体的表达，但不影响抑制型T细胞的活化。其口服制剂于1994年在美国首次上市。本品有如下特点:①该药的免疫抑制作用无论在体外还是在体内试验都是环孢菌素的数十倍到数百倍，在临床上本品的有效浓度极低;②以往以环孢菌素为基础的免疫抑制方案中，不可逆的慢性排斥反应问题依然存在，增加剂量虽然有进一步效果，但会带来严重的不良反应，而他克莫司可减少肝肾移植受体的急、慢性排斥反应，其中用于肾移植后的急性排斥率只有14%，低于环孢菌素(32%)。③用他克莫司的患者，细菌和病毒感染率也较环孢菌素治疗者的低，尤其对肝移植的功效高100倍，因而大大降低了临床使用剂量，治疗费用可降至原来的1/3?1/2，同时不良反应也明显降低，此外它还具有低死亡率、高移植存活率、移植物具有良好成功率及对类留醇的相对非依赖性等优点。
[0004]他克莫司除了在抑制器官移植排斥反应方面具有显著疗效外，还广泛应用于斑秃、牛皮癣、银肩病、鱼鳞病、糖尿病、白塞氏病、变应性皮炎、类风湿性关节炎以及多发性硬化病等自身免疫疾病的治疗。
[0005]目前，在他克莫司发酵液的浸提阶段存在两个主要难题:一是他克莫司浸提溶剂用量大，成本高;二是浸提收率普遍不高，均在90 %以下。
[0006]专利CN102936253A公开了一种浸提他克莫司的方法，发酵液预处理后直接采用中等极性的溶媒浸提，由于菌饼含水量高，势必造成溶媒用量大且后续回收困难。
[0007]专利CN101481715B公开了他克莫司的提取方法，发酵液利用板框压滤机过滤，收集菌体，将滤饼转入提取罐，使用丙酮等溶液作为浸提溶剂，浸提一次后收集滤液，再将滤渣使用上述方法进行二次浸提，收集二次浸提后的滤饼并将滤渣继续循环上述步骤，总浸提3-4次后合并每次浸提得到滤液。但是采用上述方法一方面浸提工序复杂，劳动强度大，浸提周期长，生产效率低。另一方面浸提方法所用有机溶剂使菌体脱水，容易结块，他克莫司溶出不均匀，且浸提量较少，浸提收率不理想。
[0008]当代流化床技术应用范围非常的广泛，在生物方面主要有污水处理、蛋白分离、以及植物、微生物中有效成分的提取分离。
【发明内容】
[0009]为了解决他克莫司浸提收率不高及提纯过程中溶媒用量大，工艺步骤繁琐的缺陷，浸提收率低等缺点，发明人经过大量的试验，提供了一种流化床浸提他克莫司浸提新工艺。具体包括发酵液的预处理、菌饼闪蒸干燥、菌体流化床浸提。
[0010]菌粉加入流化介质如石英砂、陶瓷球、高铝矾土，在溶剂作用下，这些介质与菌体絮凝成一定密度的颗粒，在一定条件下，能够达到流化床的状态，因为石英砂、高招巩土、超瓷球，都能起着很好絮凝作用，从而可以增加菌体的密度，不至于菌体漂浮在床层上面而流出，以保证流出浸提液澄清。在流化床下部通入向上流动的有机溶剂，增加溶剂流速，使菌体颗粒床高度不断膨胀，直到达到一定的膨胀比例而处于稳定分层状态，这种状态更有利于从菌体中浸提他克莫司，研究发现菌体在流化状态下比在搅拌浸提状态下浸提效果好，流化床浸提收率可达94%以上;并且流化床浸提是采用循环浸提，这样就可以节省大量的溶剂，缩短浸提时间。总之，相比较多次浸提而言流化床浸提更有效率。
[0011 ]本发明的技术方案包括如下步骤:
[0012]a.发酵液预处理及菌体收集:微生物发酵液是链霉菌发酵得到的发酵液;将链霉菌发酵液预处理后，用板框压滤机过滤得到菌体；
[0013]b.闪蒸干燥:将菌体送入闪蒸干燥机进行干燥，制成含他克莫司的菌粉；
[0014]c.流化床的浸提:按重量比向菌粉中加入一定量的流化床介质混合均匀，装流化床层析柱，用有机溶剂或有机溶剂和水的混合溶液循环浸提流化床菌体物，循环一定时间后，再用有机溶剂或有机溶剂和水的混合溶液置换出流化床里的他克莫司，最终得含他克莫司浸提液。所述有机溶剂和水的混合溶液都是新配置的。
[0015]本发明对步骤a中菌种进行了筛选，筛选后的菌株是吸水链霉菌(ACCC N0.40417)菌株。其他菌株在使用本发明方法时，也可以显著提高收率。
[0016]本发明对步骤a中发酵液的预处理工艺进行了优选，优选地，发酵预处理液工艺为按质量kg体积L比计，加入I %的氯化钙，再加入I %的硫酸锌，搅拌I小时。
[0017]本发明对步骤b中闪蒸干燥制备菌粉的工艺进行了优选，优选地，闪蒸干燥制备的菌粉含水量为3%?10 %。
[0018]本发明对步骤c中浸提所用有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮或叔丁基甲基醚中的一种。所用有机溶剂与水的混合溶液为以体积比计，含水量少于20%的下列混合溶液中的一种:甲醇和水的混合溶液、乙醇和水的混合溶液、丙酮和水的混合溶液、叔丁基甲基醚和水的混合溶液;进一步优选为含水量10%的甲醇和水的混合溶液，含水量5 %的乙醇和水的混合溶液，含水量8 %的丙酮和水的混合溶液，含水量8 %的叔丁基甲基醚和水的混合溶液。
[0019]本发明对步骤c浸提所用流化床介质进行了优选，优选自石英砂、陶瓷球、高铝矾土中的一种。
[0020]本发明对步骤c中浸提所用流化床介质用量进行了优选，优选地，菌粉浸提所用流化床介质用量为菌体的质量的15%?25%。
[0021 ] 优选地，步骤c中流化床的浸提溶剂应从柱底部进入，从上端流出。
[0022]步骤c中流化床，其载体为两端可封闭并且耐受有机溶剂的圆柱形层析柱；
[0023]优选地，所述流化床层析柱的高度和直径之比应在2-8之间；
[0024]进一步优选地，所述流化床其介质在层析柱中的装量应不低于层析柱总体积的三分之二。
[0025]本发明与现有技术相比具有如下突出的优点:
[0026]①溶剂用量少，步骤简单，易于操作；
[0027]②他克旲司浸提收率尚，有利于后续广品的纯化；
[0028]③设备投资少，环境污染少，符合清洁生产的要求。
【具体实施方式】
[0029]以下通过具体实施例进一步描述本发明，但本发明所要保护的技术方案不仅仅限于以下实施例。
[0030]实施例1:
[0031]取吸水链霉菌(ACCC N0.40417)菌株他克莫司发酵液100L，其中发酵单位350mg/L(HPLC测定)，分别加入Ikg氯化钙、Ikg硫酸锌，搅拌I小时，经板框压滤机过滤，收集菌饼;将菌饼送入闪蒸干燥机进行干燥，得含他克莫司的菌粉I lkg，含水量为3%。向菌粉中加入2.75kg石英砂，混匀，干法装入两端可封闭并且耐受有机溶剂的圆柱形层析柱内，从层析柱底阀向上通入新配置的含水量5%的乙醇和水混合溶液，控制适当的流速，使床层翻腾起来，浸提循环I小时，停止循环。换用新配置的含水量5%的乙醇和水混合溶液置换出层析柱内含有他克莫司的溶液，共收集浸提液95L。浸提液经HPLC检测他克莫司含量，收率为97.3%。有机溶剂总用量在100L左右即可，不需要过多加入，根据流化床和菌粉因素综合考虑加入量即可。
[0032]实施例2:
[0033]取吸水链霉菌(ACCC N0.40417)菌株他克莫司发酵液100L，其中发酵单位340mg/L(HPLC测定)，分别加入Ikg氯化钙、Ikg硫酸锌，搅拌I小时，经板框压滤机过滤，收集菌饼;将菌饼送入闪蒸干燥机进行干燥，得含他克莫司的菌粉15kg，含水量为6%。向菌粉中加入2.25kg陶瓷球，混匀，干法装入两端可封闭并且耐受有机溶剂的圆柱形层析柱内，从层析柱底阀向上通入新配置的含水量20 %的甲醇和水混合溶液，控制适当的流速，使床层翻腾起来，浸提循环I小时，停止循环。换用新配置的含水量20%的甲醇和水混合溶液置换出层析柱内含有他克莫司的溶液，共收集乙醇浸提液98L ο浸提液经HPLC检测他克莫司含量，收率为 94.6%0
[0034]实施例3:
[0035]取吸水链霉菌(ACCC N0.40417)菌株他克莫司发酵液100L，其中发酵单位336mg/L(HPLC测定)，分别加入Ikg氯化钙、Ikg硫酸锌，搅拌I小时，经板框压滤机过滤，收集菌饼;将菌饼送入闪蒸干燥机进行干燥，得含他克莫司的菌粉10kg，含水量为3%。向菌粉中加入
2.0kg高铝矾土，混匀，干法装入两端可封闭并且耐受有机溶剂的圆柱形层析柱内，从层析柱底阀向上通入丙酮，控制适当的流速，使床层翻腾起来，浸提循环I小时，停止循环。再用丙酮置换出层析柱内含有他克莫司的溶液，共收集浸提液92L。浸提液经HPLC检测他克莫司含量，收率为96.2%。
[0036]实施例4:
[0037]取吸水链霉菌(ACCC N0.40417)菌株他克莫司发酵液100L，其中发酵单位302mg/L(HPLC测定)，分别加入Ikg氯化钙、Ikg硫酸锌，搅拌I小时，经板框压滤机过滤，收集菌饼;将菌饼送入闪蒸干燥机进行干燥，得含他克莫司的菌粉12kg，含水量为1 %。向菌粉中加入
2.4kg陶瓷球，混匀，干法装入两端可封闭并且耐受有机溶剂的圆柱形层析柱内，从层析柱底阀向上通入新配置的含水量8%的叔丁基甲基醚与水的混合溶液，控制适当的流速，使床层翻腾起来，浸提循环I小时，停止循环。换用新配置的含水量8%的叔丁基甲基醚与水的混合溶液置换出层析柱内含有他克莫司的溶液，共收集浸提液96L ο浸提液经HPLC检测他克莫司含量，收率为97.4%。
[0038]实施例5:
[0039]取吸水链霉菌(ACCC N0.40417)菌株他克莫司发酵液100L，其中发酵单位321mg/L(HPLC测定)，分别加入Ikg氯化钙、Ikg硫酸锌，搅拌I小时，经板框压滤机过滤，收集菌饼;将菌饼送入闪蒸干燥机进行干燥，得含他克莫司的菌粉17kg，含水量为1 %。向菌粉中加入3.06kg石英砂，混匀，干法装入两端可封闭并且耐受有机溶剂的圆柱形层析柱内，从层析柱底阀向上通入新配置的含水量10%的甲醇和水的混合溶液，控制适当的流速，使床层翻腾起来，浸提循环I小时，停止循环。换用新配置的含水量10%的甲醇和水的混合溶液置换出流化床里含有他克莫司的溶液，共收集浸提液93L。浸提液经HPLC检测他克莫司含量，收率为97.1% 0
[0040]实施例6:
[0041 ] 取吸水链霉菌(ACCC N0.40417)菌株他克莫司发酵液100L，其中发酵单位347mg/L(HPLC测定)，分别加入Ikg氯化钙、Ig硫酸锌，搅拌I小时，经板框压滤机过滤，收集菌饼;将菌饼送入闪蒸干燥机进行干燥，得含他克莫司的菌粉15kg，含水量为8%。向菌粉中加入3.45kg高铝矾土，混匀，干法装入两端可封闭并且耐受有机溶剂的圆柱形层析柱内，从层析柱底阀向上通入新配置的含水量8%的丙酮和水的混合溶液，控制适当的流速，使床层翻腾起来，浸提循环I小时，停止循环。换用新配置的含水量8%的丙酮和水的混合溶液置换出层析柱内含有他克莫司的溶液，共收集浸提液94L。浸提液经HPLC检测他克莫司含量，收率为96.7%。
[0042]对比实施例1:
[0043]取吸水链霉菌(ACCC N0.40417)菌株他克莫司发酵液100L，其中发酵单位332mg/L(HPLC测定)，分别加入Ikg氯化钙、Ikg硫酸锌，搅拌I小时，经板框压滤机过滤，收集菌饼;将菌饼送入闪蒸干燥机进行干燥，得含他克莫司的菌粉13kg，含水量为6%。向菌粉中加入
3.9kg陶瓷球，混匀，干法装入两端可封闭并且耐受有机溶剂的圆柱形层析柱内，从层析柱底阀向上通入新配置的含水量为30%的乙醇和水的混合溶液，控制适当的流速，使床层翻腾起来，浸提循环I小时，停止循环。换用新配置的含水量为30%的乙醇和水的混合溶液置换出层析柱内含有他克莫司的溶液，共收集浸提液98L。浸提液经HPLC检测他克莫司含量，收率为81.2%。
[0044]对比实施例2:
[0045]取吸水链霉菌(ACCC N0.40417)菌株他克莫司发酵液100L，其中发酵单位318mg/L(HPLC测定)，分别加入Ikg氯化钙、Ikg硫酸锌，搅拌I小时，经板框压滤机过滤，收集菌饼;将菌饼送入闪蒸干燥机进行干燥，得含他克莫司的菌粉12kg，含水量为13 %。向菌粉中加入
1.2kg高铝矾土，混匀，干法装入两端可封闭并且耐受有机溶剂的圆柱形层析柱内，从层析柱底阀向上通入新配置的含水量40%的甲醇和水的混合溶液，控制适当的流速，使床层翻腾起来，浸提循环I小时，停止循环。换用新配置的含水量40%的甲醇和水的混合溶液置换出层析柱内含有他克莫司的溶液，共收集浸提液96L。浸提液经HPLC检测他克莫司含量，收率为78.5%。
[0046]对比实施例3:
[0047]取吸水链霉菌(ACCC N0.40417)菌株他克莫司发酵液100L，其中发酵单位319mg/L(HPLC测定)，分别加入Ikg氯化钙、Ikg硫酸锌，搅拌I小时，经板框压滤机过滤，收集菌饼;得到19.6kg菌丝体。在此菌丝体中加入196L的乙酸乙酯，浸泡、搅拌Ih后经板框压滤机过滤；重复浸提两次，并收集他克莫司浸提液380L。浸提液经HPLC检测他克莫司含量，收率为88.0%。
[0048]对比实施例4:
[0049]取吸水链霉菌(ACCC N0.40417)菌株他克莫司发酵液100L，其中发酵单位322mg/L(HPLC测定)，分别加入Ikg氯化钙、Ikg硫酸锌，搅拌I小时，经板框压滤机过滤，收集菌饼;得到19.8kg菌丝体。在此菌丝体中加入50L的乙酸乙酯，浸泡、搅拌Ih后经板框压滤机过滤;重复浸提两次，并收集他克莫司浸提液102L。浸提液经HPLC检测他克莫司含量，收率为70.0%。
[0050]总有机溶剂用量与本申请实施例1-6基本相同的情况下，单纯使用极性溶剂浸提，收率只有70%左右。
[0051 ] 对比实施例5:
[0052]取吸水链霉菌(ACCC N0.40417)菌株他克莫司发酵液100L，其中发酵单位345mg/L(HPLC测定)，加入珍珠岩适量，搅拌30min，经板框过滤机过滤，收集菌饼，加2倍体积丙酮浸提搅拌3h，离心；菌丝体如上方法再提取两次，收集每次所得丙酮浸提液共176L。浸提液经HPLC检测他克莫司含量，收率为72.4%。
【主权项】
1.一种他克莫司浸提方法，具体包括如下步骤: a.发酵液预处理及菌体收集:微生物发酵液是链霉菌培养得到的发酵液;将链霉菌发酵液预处理后，用板框压滤机过滤得到菌体； b.闪蒸干燥:将菌体送入闪蒸干燥机进行干燥，制成含他克莫司的菌粉； c.流化床的浸提:按重量比向菌粉中加入一定量的流化床介质混合均匀，装流化床柱，用有机溶剂或有机溶剂与水的混合溶液循环浸提流化床菌体物，循环一定时间后，再用有机溶剂或有机溶剂与水的混合溶液置换出流化床里含他克莫司的溶液，最终得含他克莫司的浸提液。2.根据权利要求1所述的方法，其特在于，步骤a所述链霉菌是吸水链霉菌(ACCCN0.40417)菌株。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中发酵液预处理是按质量kg/体积L计，加入I %的氯化钙，再加入I %硫酸锌，搅拌I小时。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中闪蒸干燥制备的菌粉含水量为3%?10%。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中浸提所用有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮或叔丁基甲基醚中的一种。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中浸提所用有机溶剂与水的混合溶液为以体积比计含水量少于20%的下列混合溶液中的一种:甲醇和水的混合溶液、乙醇和水的混合溶液、丙酮和水的混合溶液、叔丁基甲基醚和水的混合溶液;进一步优选为含水量10 %的甲醇和水的混合溶液，含水量5 %的乙醇和水的混合溶液，含水量8 %的丙酮和水的混合溶液，含水量8 %的叔丁基甲基醚和水的混合溶液。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中菌粉浸提所用流化床，其介质选自石英砂、陶瓷球、高铝矾土中的一种。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中菌粉浸提所用流化床介质的质量为菌体质量的15%?25%。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中流化床的浸提溶剂应从柱底部进入，从上端流出。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中流化床，其载体为两端可封闭并且耐受有机溶剂的圆柱形层析柱;优选地，所述流化床层析柱的高度和直径之比应在2-8之间；进一步优选地，所述流化床其介质在层析柱中的装量应不低于层析柱总体积的三分之--O
【文档编号】C07D498/18GK106046023SQ201610411370
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月10日
【发明人】张贵民, 李建涛, 孙颖, 马鲁南
【申请人】山东新时代药业有限公司