专利名称：：一种链霉菌及其在多阶段发酵生产他克莫司方法中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于发酵工程
技术领域：
，具体涉及一种高产大环内酯类免疫抑制剂他克莫司的产生菌链霉菌&re/^0m_yCeiysp.多阶段发酵生产方法。
背景技术：
：他克莫司(tacrolimus,FK506)是一种重要的大环内酯类免疫剂，由日本藤泽制药于1984年首次发现，目前已广泛应用于肝脏、骨髓移植、对其他药物耐药肾移植的排斥防治、白塞氏病、变应性皮炎、银屑病、鱼鳞病、斑秃、类风湿性关节炎、牛皮癣、多发性硬化病、糖尿病等多种自身免疫疾病的治疗。自在中国上市的短短时间内，市场份额迅速上升，已成为肝脏及肾脏移植后排斥反应的临床一线药物，但目前国内市场绝大部分被日本和美国等国家占领，开发具有自主知识产权且能转化为生产力的他克莫司生产技术迫在眉睫。他克莫司通过链霉菌属(&r印/om少CM)发酵而得，国外在菌种改良、发酵条件优化方面取得重大进展，并建立了可信的HPLC定量分析方法，解决了发酵、提取、精制工艺放大过程中遇到的许多问题，20世纪90年代日本就已实现工业化生产。目前国内对他克莫司的发酵研究仍处于起步阶段，已有报导华北制药和华东制药对他克莫司产生菌进行了初步诱变选育，上海农药所公开了一株新的他克莫司产生菌及生产方法，发酵产物他克莫司的平均浓度为150!xg/mL，但对于如何分离提取产物并未具体说明。由于发酵液中存在多种他克莫司类似物，这对发酵后期的分离提取提出了很高要求。针对当前国内外发酵法生产他克莫司均存在发酵周期长、中间产物多、提取分离步骤长、高浓度产物底物抑制等问题，如能建立起一套系统的发酵法生产他克莫司的多阶段反应与分离耦合基础理论，特别对产物的分离提取及转化进行深入研究，为生物法生产抗生素等次生代谢产物提供模板，对进一步夯实生物法合成抗生素的平台具有重大意义。
发明内容本发明目的在于提供一种链霉菌及其该链霉菌在多阶段发酵生产他克莫司方法中的应用；本发明的另一目的还提供了利用该链霉菌S加声omyc"sp.多阶段发酵生产他克莫司的方法。本发明的技术方案为一种链霉菌，其分类命名为链霉菌，菌种的拉丁学名是5^/7fom少c^sp.，参据的微生物(株)NJYH2618，保藏日期是2008年5月26日，保藏中心登记入册编号是CGMCCN0.2519。本发明还提供了该链霉菌在多阶段发酵生产他克莫司方法中的应用。一种利用上述的链霉菌多阶段发酵生产他克莫司的方法，其具体步骤如下利用链霉菌培养发酵种子液；将发酵培养基进行接种前准备灭菌；然后将发酵种子液按发酵培养基体积的3-5%比例接种于发酵培养基，通过控制葡萄糖浓度进行有氧多阶段发酵，制得他克莫司。所述的培养发酵种子液为从高氏一号培养基上挑2-3个链霉菌(菌种的拉丁学名是5^印to/^c^sp.，参据的微生物(株)NJYH2618，保藏中心登记入册编号是CGMCCN0.2519)菌落到装液10-40mL—级种子培养基的250mL摇瓶中，在温度为25~35°C，pH为6.5-8.5，转速为220rpm的摇床中培养30-72h，得到一级种子培养液；再将上述得到的一级种子培养液到装液10-40mL二级种子培养基的250mL摇瓶中，在同一级种子培养相同条件下培养，即得发酵种子液。上述的一级种子培养基组成为(g/L):可溶性淀粉5-10，葡萄糖1-3，酵母粉1-5，NaCl0.2-0.5;所述的二级种子培养基组成为(g/L):可溶性淀粉5-10，葡萄糖l-5，酵母粉1-5，K2HP040.2-0.5，MgS04'7H200.2-0.5，CaC031-3。所述的发酵培养基接种前准备为将发酵培养基溶于水中，倒入发酵罐中，通入冷却水，灭菌，灭菌过程中校正溶解氧DO为0%;其中所述的发酵培养基的组分(g/L):可溶性淀粉10-20，葡萄糖5-20，酵母粉1-5，玉米浆10-20，黄豆饼粉5-20，K2HP040.2-0.5，NaCl0.5-2，微量元素0.312-0.543。所述的微量元素由下列成分组成(g/L):MgS04'7H200.3-0.5，FeS04'7H200.005-0.025，ZnS04'7H200.005-0.01，MnCl'4H200.001-0.005，CoCl'6H200.001-0.003。所述的接种过程中发酵培养基的培养温度2535"C，控制pH6.5-8.5;调节好转速、空气流量及罐压以校正溶氧DO达100%;所述的有氧多阶段发酵为位于发酵过程的前4860h的菌丝生长阶段，空气流量为2.5-3.5L/min,搅拌速度为300-360rpm，溶氧水平DO控制在50-100%;位于发酵过程的60h之后的他克莫司产生阶段，当细胞光密度(O.D.)水平达到25-32时，转入微氧发酵阶段，但是由于发酵液粘度极高，因此氧的传递速率会相对下降，而高强度搅拌增加氧的供给会对菌丝体造成机械损伤，将加大空气流量与增加搅拌强度相结合有助于解决此问题。此阶段调节空气流量为4.0-5.0L/min，搅拌速度为360-400rpm'溶解氧水平控制在20-30%。在有氧多阶段发酵过程中，当葡萄糖浓度低于5g/L时，开始流加底物，并以发酵液中葡萄糖的浓度来指导底物流加速度，使发酵罐内葡萄糖浓度控制在5-6g/L范围内发酵5-8天；其中流加底物组成为(g/L):葡萄糖250-350，酵母膏100-200,K2HPO45-10上述链霉菌5yw/7/o附少CMsp.，参据的微生物(株)NJYH2618是由本实验室从南京中山陵地区的土壤中，初筛得到31株能抑制假丝酵母生长的放线菌；经摇瓶复筛，用HPLC(高效液相色谱)检测获得一株他克莫司产生菌，通过生理生化特性实验和16SrDNA序列相似性分析，分类鉴定命名为链霉菌，并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其简称为CGMCC，登记入册的编号是CGMCCNo.2519，保藏日期是2008年5月26日。以此菌种作为生产菌株。CGMCCNo.2519菌株具有下述性质1、形态特征菌株在高氏一号培养基上生长中度，气生菌丝生长中度，孢子丝呈波曲状，孢子成链状排列，在电子显微镜下孢子成椭圆形。2、培养特征28'C培养7-14天，观察菌株在下列各种培养基上的特征。表1CGMCCNo.2519菌株的培养特征<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>3、生理生化性质:表2CGMCCNo.2519菌株的生理生化性质<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>+:为可利用；-:为不可利用4、16SrDNA序列分析用溶菌酶法从新鲜菌体提取基因组DNA，采用链霉菌通用引物进行16SrDNA扩增，PCR产物经检测、纯化后交由TAKARA公司进行测序。所测的16SrDNA序列经校对、拼接后与GenBank数据库中相关种属的序列进行BLAST比较，菌株S加;toW3;c^sp.NJYH2618(CGMCCNo.2519)的16SrDNA序列与已注册的他克莫司产生菌序列均有较大差别，最高同源性为97%。测得16SrDNA大部分序列1433bp，具体如下:GCGATTGGGACGAAGTCGTAACAA陽3、有益效果采用本发明的链霉菌(S&印tom;;mysp.)多阶段发酵生产他克莫司的方法，经过种子的培养、接种前准备及接种、多阶段溶氧控制、分批补料发酵阶段，这是一个有氧、微氧等多阶段集成发酵，实现了他克莫司生产菌链霉菌sp.的多阶段培养，使sp.的次级代谢产物他克莫司效价有大幅度提高。本发明成本低，操作简易，发酵液中目标产物他克莫司的效价较高，有利于工业化规模生产。保藏信息上述链霉菌S^e/tom_yce;ysp.，参据的微生物(株)NJYH2618是由本实验室选育并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所)，其简称为CGMCC，登记入册的编号是CGMCCNo.2519，保藏日期是2008年5月26日。具体实施例方式本发明提供一种链霉菌5^印to/^c"sp.多阶段发酵生产他克莫司的方法，下面列举实施例予以进一步说明。实例一①种子的培养从高氏一号培养基上挑2个S^声cw^eysp.(CGMCCN0.2519)菌落到装液30mL—级种子培养基的250mL摇瓶中，在温度为28°C，转速为220rpm的摇床中培养48h，得到培养液；再取4mL上述种子液到装液30mL二级种子培养基的250mL摇瓶中，在相同条件下培养，即得发酵种子液。其二级扩大培养的种子培养基组成为(g/L):一级种子培养基可溶性淀粉5，葡萄糖1，酵母粉1，NaClO.2;二级种子培养基可溶性淀粉5,葡萄糖I，酵母粉1，K2HPO40.2，MgSO4'7H2O0.2，CaC031。②接种前准备洗净发酵罐，组装好温度，pH(已校正)和泡沫传感器，将发酵培养基溶于水中，倒入发酵罐中，通入冷却水，灭菌，灭菌过程中校正溶解氧DO为0。/。，接好空气过滤器，冷却后接好其他附属设备。其发酵培养基的组成为(g/L):可溶性淀粉10，葡萄糖5，酵母粉1，玉米浆10，黄豆饼粉5,K2HPO40.2，NaC10.5，微量元素0.312。所述的微量元素由下列成分组成(g/L):MgS(V7H200.3,FeSO4'7H2O0.005，ZnS04.7H200.005，MnCl'4H200.001，CoCl'6H200.001。③接种在火焰圈保护下，以3%接种量将链霉菌S"印tom;;c"sp.(CGMCCN0.2519)接种于7L自动控制发酵罐中，装液量4L，空气流量2.5L/min，搅拌转速为300r/min，培养温度28。C，校正溶氧100%，自动流加氨水控制pH7.0土0.5，调节好转速、空气流量及罐压。④多阶段溶氧控制他克莫司发酵过程分为菌丝生长和他克莫司产生两个阶段。菌丝生长阶段为发酵过程的前60h，这一阶段需要大量氧，初始空气流量为2.5L/min，搅拌速度为300rpm，溶氧水平DO控制在50-100%;他克莫司产生阶段位于发酵过程的60h之后，当细胞光密度(O.D.)水平达到30时，转入微氧发酵阶段。但是由于发酵液粘度极高，因此氧的传递速率会相对下降，而高强度搅拌增加氧的供给会对菌丝体造成机械损伤，将加大空气流量与增加搅拌强度相结合有助于解决此问题。此阶段调节空气流量为4.0L/min，搅拌速度为380rpm，溶解氧水平控制在20-30%。⑤分批补料发酵菌体经过一段时间适应期后进入对数生长期。当营养物质的消耗完毕，当葡萄糖浓度低于5g/L时，开始流加底物，并以发酵液中葡萄糖的浓度来指导底物流加速度，使发酵罐内葡萄糖浓度控制在5-6g/L范围内发酵5天。其流加底物组成为(g/L):葡萄糖250，酵母膏100，K2HP045。最终测得他克莫司效价为253pg/mL。实例二①种子的培养从高氏一号培养基上挑2个S加;tom少cMsp.(CGMCCN0.2519)菌落到装液40mL—级种子培养基的250mL摇瓶中，在温度为28'C，转速为220rpm的摇床中培养48h，得到培养液；再取4ml上述种子液到装液40ml二级种子培养基的250ml摇瓶中，在相同条件下培养，即得发酵种子液。其二级扩大培养的种子培养基组成为(g/L):一级种子培养基可溶性淀粉7，葡萄糖2，酵母粉3，NaC10.3;二级种子培养基可溶性淀粉7，葡萄糖2，酵母粉3，K2HPO40.3，MgS04'7H200.3，CaC032。②接种前准备洗净发酵罐，组装好温度，pH(已校正)和泡沫传感器，将发酵培养基溶于水中，倒入发酵罐中，通入冷却水，灭菌，灭菌过程中校正溶解氧00为0%，接好空气过滤器，冷却后接好其他附属设备。其发酵培养基的组成为(g/l):可溶性淀粉15，葡萄糖12，酵母粉3，玉米浆.15，黄豆饼粉12，K2HP040.3，NaC11.25，微量元素0.4275。所述的微量元素由下列成分组成(g/L):MgSCV7H200.4，FeSO4.7H2O0.015，ZnS(V7H200.0075，MnCl'4H200.003，CoC1.6H200.002。③接种在火焰圈保护下，以4%接种量将链霉菌■Sre/j/omyc^sp.(LGMCCNO.2519)接种于7L自动控制发酵罐中，装液量4L，空气流量3L/min，搅拌转速为320r/min，培养温度28'C，校正溶氧100%,自动流加氨水控制pH7.0土0.5，调节好转速、空气流量及罐压。④多阶段溶氧控制他克莫司发酵过程分为菌丝生长和他克莫司产生两个阶段。菌丝生长阶段为发酵过程的前60h，这一阶段需要大量氧，初始空气流量为3L/min，搅拌速度为320rpm，溶氧水平DO控制在50-100%;他克莫司产生阶段位于发酵过程的60h之后，当细胞光密度(O.D.)水平达到32时，转入微氧阶段。但是由于发酵液粘度极高，因此氧的传递速率会相对下降，而高强度搅拌增加氧的供给会对菌丝体造成机械损伤，将加大空气流量与增加搅拌强度相结合有助于解决此问题。此阶段调节空气流量为4.5L/min，搅拌速度为400rpm，溶解氧水平控制在20-30%。⑤分批补料发酵菌体经过一段时间适应期后进入对数生长期。当营养物质的消耗完毕，当葡萄糖浓度低于5g/L时，开始流加底物，并以发酵液中葡萄糖的浓度来指导底物流加速度，使发酵罐内葡萄糖浓度控制在5-6g/L范围内发酵6天。其流加底物组成为(g/L):葡萄糖320，酵母膏150，K2HP047。最终测得他克莫司效价为383吗/mL。实例三①种子的培养从高氏一号培养基上挑2个5fr印tow;;c"sp.(CGMCCN0.2519)菌落到装液40mL—级种子培养基的250mL摇瓶中，在温度为28°C，转速为220rpm的摇床中培养48h，得到培养液；再取4mL上述种子液到装液40mL二级种子培养基的250mL摇瓶中，在相同条件下培养，即得发酵种子液。其二级扩大培养的种子培养基组成为(g/L):一级种子培养基可溶性淀粉10，葡萄糖3，酵母粉5，NaCl0.5;二级种子培养基可溶性淀粉10,葡萄糖3,酵母粉5，K2HPO40.5，MgS04'7H200.5，CaC033。②接种前准备洗净发酵罐，组装好温度，pH(已校正)和泡沫传感器，将除葡萄糖之外的分批发酵培养基溶于水中，倒入发酵罐中，通入冷却水，灭菌，灭菌过程中校正溶解氧DO为0。/。，接好空气过滤器，冷却后接好其他附属设备。其发酵培养基的组成为(g/L):可溶性淀粉20，葡萄糖20，酵母粉5，玉米浆20，黄豆饼粉20，K2HP040.5，NaC12，微量元素0.543。所述的微量元素由下列成分组成(g/L):MgS(V7H200.5,FeSO4'7H2O0.025，ZnS04'7H200.01，MnC14H200.005，CoC16H200.003。(D接种在火焰圈保护下，以5。/。接种量将链霉菌5^^ww少ceysp.(CGMCCN0.2519)接种于7L自动控制发酵罐中，装液量4L，空气流量3.5L/min，搅拌转速为350r/min，培养温度28。C，校正溶氧100%，自动流加氨水控制pH7.0士0.5，调节好转速、空气流量及罐压。④多阶段溶氧控制他克莫司发酵过程分为菌丝生长和他克莫司产生两个阶段。菌丝生长阶段为发酵过程的前60h，这一阶段需要大量氧，初始空气流量3.5L/min，搅拌速度为350rpm，溶氧水平DO控制在50-100%;他克莫司产生阶段位于发酵过程的60h之后，当细胞光密度(O.D.)水平达到32时，转入微氧阶段。但是由于发酵液粘度极高，因此氧的传递速率会相对下降，而高强度搅拌增加氧的供给会对菌丝体造成机械损伤，将加大空气流量与增加搅拌强度相结合有助于解决此问题。此阶段调节空气流量5L/min，搅拌速度为360rpm，溶解氧水平控制在20-30%。⑤分批补料发酵菌体经过一段时间适应期后进入对数生长期。当营养物质的消耗完毕，当葡萄糖浓度低于5g/L时，开始流加底物，并以发酵液中葡萄糖的浓度来指导底物流加速度，使发酵罐内葡萄糖浓度控制在5-6g/L范围内发酵8天。其流加底物组成为(g/L):葡萄糖350，酵母膏200，K2HPO410。最终测得他克莫司效价为426pg/mL。本发明用于大环内酯类免疫抑制剂他克莫司的生产，具有广阔的应用前景。通过开发链霉菌5^e声o;^c"sp.多阶段发酵生产工艺，降低生产成本、提高了他克莫司的效价，有利于工业化规模生产。〈110〉南京工业大学<120>—种链霉菌及其在多阶段发酵生产他克莫司方法中的应用〈160〉1〈210〉1<211>1433<212〉腿<213〉链霉菌S呻詢戸"p.<400〉1catgcagtcgaacgatgaaccacttcggtggggattagtggcgaacgggtgagtaacacg60tgggcaatctgcccttcactctgggacaagccctggaaacggggtctaataccggataac120acttccactctcctgggtggaggttsaaagctccggcggtg鄉g3tg3gcccgcggcct180atcagcttgttggtgaggtaatggctcaccasggcgacgacgggtagccggcctg柳gg240gcgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtgggg300aatsttgcacaatgggcgaaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttc360gggttgtaaacctctttcagcagggaagaagcg咖gtgacggtacctgc卿agaagcg420ccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggcgcaagcgttgtccggaatt480attgggcgtaaagagctcgtaggcggcttgtcacgtcgggtgtgaaagaccggggcttaa540ccccggttctgcattcgatacgggctagctagagtgtggt3gggg3g3tCggaattcctg600gtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcggatctctgg660gccattactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggta720gtccacgccgtaaacggtgggaactaggtgttggcgacattccacgtcgtcggtgccgca780gctaacgcattaagttccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaat840tgsicgggggcccgcacaagcELgcggagcatgtggcttaatttgacgcaacgcgaagaacc900ttaccaaggcttgacatacaccggaaagcatt3g3g3tagtgccccccttgtggtcggtg960tacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtg柳tgttgggttaagtcccgcaa1020cgagcgcaacccttgttctgtgttgccagcatgcccttcggggtgatggggactcacagg1080agaccgccggggtcaactcggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatgccccttat1140gtcttgggctgcacacgtgctacaatggcaggtacaatgagctgcgataccgtgaggtgg1200agcgaatctcaaaaagcctgtctcagttcgg3ttggggtCtgcaactcgaccccatgaag1260tcggagttgctagtaatcgcagatcagcattgctgcggtgaatacgttcccgggccttgt13203C3caccgcccgtcacgtcacgaaagtcggtaacacccgaagccggtggcccaacccctt1380gtgggsgggagctgtcgaaggtgggactggcgattgggacgaagtcgtaa143权利要求1、一种链霉菌，其分类命名为链霉菌，菌种的拉丁学名是Streptomycessp.，参据的微生物(株)NJYH2618，保藏日期是2008年5月26日，保藏中心登记入册编号是CGMCCNO.2519。2、一种如权利要求1所述的链霉菌在多阶段发酵生产他克莫司方法中的应用。3、一种利用权利要求1所述的链霉菌多阶段发酵生产他克莫司的方法，其具体步骤如下利用链霉菌培养发酵种子液；将发酵培养基进行接种前准备灭菌；然后将发酵种子液按发酵培养基体积的3-5%比例接种于发酵培养基，通过控制葡萄糖浓度进行有氧多阶段发酵，制得他克莫司。4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的培养发酵种子液为从高氏一号培养基上挑2-3个链霉菌S&印to/7^c"sp.菌落到装液10-40mL—级种子培养基的250mL摇瓶中，在温度为25~35°C，pH为6.5-8.5，转速为220rpm的摇床中培养30-72h，得到一级种子培养液；再将上述得到的一级种子培养液到装液10-40mL二级种子培养基的250mL摇瓶中，在相同条件下培养，即得发酵种子液。5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的一级种子培养基组成为(g/L):可溶性淀粉5-10，葡萄糖1-3，酵母粉1-5，NaCl0.2-0.5;所述的二级种子培养基组成为(g/L):可溶性淀粉5-10，葡萄糖1-5，酵母粉1-5，K2HP040.2-0.5，MgS04.7H200.2-0.5，CaC031-3。6、根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的发酵培养基接种前准备为将发酵培养基溶于水中，倒入发酵罐中，通入冷却水，灭菌，灭菌过程中校正溶解氧DO为0%;其中所述的发酵培养基的组分(g/L):可溶性淀粉10-20，葡萄糖5-20，酵母粉1-5，玉米浆10-20，黄豆饼粉5-20，K2HP。40.2-0.5，NaCl0.5-2，微量元素0.312-0.543。7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述发酵培养基组分中的微量元素由下列成分组成(g/L):MgS04-7H200.3-0.5，FeS04'7H200.005-0.025，ZnS04.7H200.005-0.01，MnCl-4H200.001-0.005，CoCl'6H20O.OOl-O扁。8、根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的接种过程中发酵培养基的培养温度2535。C，控制pH6.5-8.5;调节好转速、空气流量及罐压以校正溶氧DO达100%;所述的有氧多阶段发酵为位于发酵过程的前48~60h的菌丝生长阶段，空气流量为2.5-3.5L/min，搅拌速度为300-360rpm，溶氧水平DO控制在50-100%;位于发酵过程的60h之后的他克莫司产生阶段，当细胞光密度水平达到25-32时，转入微氧发酵阶段，调节空气流量为4.0-5.0L/min，搅拌速度为360-400rpm，溶解氧水平控制在20-30%。9、根据权利要求3所述的方法，其特征在有氧多阶段发酵过程中，当葡萄糖浓度低于5g/L时，开始流加底物，并以发酵液中葡萄糖的浓度来指导底物流加速度，使发酵罐内葡萄糖浓度控制在5-6g/L范围内发酵5-8天；其中流加底物组成为(g/L):葡萄糖250-350，酵母膏100-200，K2HPO45-10。全文摘要本发明公开了一种链霉菌及其该链霉菌在多阶段发酵生产他克莫司方法中的应用；本发明还提供了利用该链霉菌Streptomycessp.多阶段发酵生产他克莫司的方法。该方法包括种子的培养、接种前准备及接种、多阶段溶氧控制、分批补料发酵阶段，以多阶段发酵生产链霉菌Streptomycessp.NJYH2618，使Streptomycessp.的次级代谢产物他克莫司效价有大幅度提高。本发明成本低，操作简易，发酵液中目标产物他克莫司的效价较高，有利于工业化规模生产。文档编号C12N1/20GK101407779SQ20081023480公开日2009年4月15日申请日期2008年11月18日优先权日2008年11月18日发明者杨文革,胡永红,林陈申请人:南京工业大学