专利名称：重组人白细胞介素－4的生产方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明提供了一种高效生产重组人白细胞介素-4(IL-4)的方法，包括有关的工程菌的构建、重组人白细胞介素-4的表达和纯化工艺。
背景技术：
1982年，Howard发现T细胞培养上清中有一种促进B细胞增殖的生长因子，起初命名为B细胞生长因子-1(B cell growth factor-1，BCSF-1)。有的实验室称B细胞刺激因子(B cell stimulating factor-1，BSF-1)、T细胞生长因子-2(T cellgrowth-2，TCGF-2)。1986年基因克隆成功，国际统一命名为白细胞介素-4(interleukin-4，IL-4)。
IL-4是由辅助T细胞(Th细胞)产生的细胞因子，主要作用于B细胞，它能够激活处于休眠状态的B细胞，继而促进B细胞的增殖和分化，IL-4还对IgG合成起着重要的作用。能增加IgE介导的体液免疫和杀伤细胞的杀伤能力。研究发现，它能够抑制人类单核细胞IL-1B、TNF-α、IL-6细胞因子的分泌，降低B细胞中CD-5的表达，促进人类T细胞的生长。
由于IL-4具有多种生物学功能，其临床适应症较广。IL-4可用于某些肿瘤的治疗；在某些炎症或自身免疫病中有治疗价值，如应用于关节炎的治疗；IL-4还可能成为防治糖尿病的药物。目前国外应用重组IL-4治疗肿瘤已进入I期和II期临床试验。
白细胞介素-4是分子量大约从15kD到19kD的糖蛋白。IL-4前体分子由153个氨基酸组成，其中第1～24个为信号肽序列。成熟的人IL-4分子由129个氨基酸残基组成，理论相对分子量为15000。有两个可能的糖基化位点，经过不同的N糖基化可得到18-19KD，甚至60KD。成熟肽的氨基酸序列中共有6个Cys，分别位于成熟肽氨基酸序列的第3、24、46、65、99、127位，含有3对分子内二硫键(3-127，24-65，46-99)，二硫键对IL-4的活性是必需的。
IL-4的构型以α螺旋为主(9～21，45～64，74～96，113～129)。IL-4对多种蛋白酶敏感，例如胰蛋白酶、糜蛋白酶和V8蛋白酶。IL-4在4℃中可保存3个月以上，在室温中可保存1个月，56℃10min不被灭活。在pH2～10中保持稳定。
已有的研究表明，糖基对IL-4的生物活性似乎没有影响，大肠杆菌表达的IL-4具有与哺乳动物细胞中表达的产物相当的生物活性。大肠杆菌生产重组蛋白具有容易操作、生长迅速和培养基要求简单等优势。国内外对IL-4的表达和纯化工作已有报道，但是表达量不高，一般占菌体总蛋白的5-10％，而且以包涵体形式表达，包涵体变复性后，目的蛋白损失很大，以致IL-4最终得率很低。
因此，迫切需要开发新的高效生产重组人IL-4的方法，本发明采用了大肠杆菌表达系统表达IL-4，通过对人IL-4基因的优化，构建含有优化的人IL-4基因的表达载体，并获得了高水平的表达菌株；通过控制发酵条件，达到了较高蛋白表达率；在此基础上对包涵体表达的rhIL-4的纯化进行了大量的摸索和研究后，得到了高纯度、高得率、可供动物实验的rhIL-4蛋白。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高效和/或简便的生产重组人白细胞介素-4的方法。
本发明的另一目的就是提供优化的重组人白细胞介素-4的编码序列和用于该方法的表达载体及工程菌株。
在本发明的第一方面，就是提供了一种优化的编码重组白细胞介素-4的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列编码区与SEQ ID NO1所示核苷酸序列有区别。
在本发明的第二方面，提供了一种表达载体，含有权利要求1所述的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的表达载体是pET30a(+)/IL-4。
在本发明的第三方面，提供了一种工程细胞，其特征在于，含有权利要求2所述的表达载体。
在另一优选例中，所述的工程细胞是大肠杆菌BL21(DE3)，是多个蛋白酶的基因缺陷菌株，基因型为hsdSgal(λcIts857 ind1Sam7nim5lacUV5-T7基因)，非常适合外源基因的高效表达。
在本发明的第四方面，提供了一种生产重组人白细胞介素-4的方法，该方法包括步骤a)在适合的表达条件下，培养如权利要求4所述的宿主细胞，从而表达出人白细胞介素-4蛋白；较佳地，所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞BL21(DE3)。
b)分离纯化出表达的人白细胞介素-4蛋白。
在本发明的另一优选例中，所述的步骤(a)的培养条件包括培养分为培养阶段和诱导阶段，培养阶段培养菌液浓度达到OD600为5.0左右，诱导时间为3～4hr，发酵及诱导温度保持在37℃，微量元素的量为0.1-2ml/L，诱导期的pH值为7.0，诱导期IPTG浓度在0.1-1mg/L。
在本发明的另一优选例中，诱导过程还可以添加酪蛋白水解物(CA)、蛋白胨(peptone)、奶粉、精氨酸等作为保护剂。
在本发明的另一优选例中，所述的步骤(b)包括步骤i)对发酵样品通过离心和/或过滤方式去除上清，获得发酵后菌体；ii)对发酵沉淀进行匀浆破菌、洗涤获得包涵体；iii)对包涵体进行变性溶解；iv)层析纯化，所述的层析选自凝胶过滤层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析及其组合。
v)采用透析复性的方法，复性上清再进行阳离子交换层析进行浓缩。
在本发明的另一优选例中，包涵体变性后经凝胶过滤层析、Q Sepharose F.F.层析、SP-Sepharose F.F.层析、透析复性、浓缩以后得到纯度大于98％、得率在20％以上的纯品。
图1.IL-4理论序列与IL-4优化序列的同源性比较。Query天然IL-4基因序列；Sbjct优化的IL-4基因序列。
图2.pET30a(+)/IL-4表达质粒的构建路线图。
图3.表达工程菌表达形式确定。1.诱导前，2.诱导后，3、5.裂解细胞上清，4、6.裂解细胞沉淀。
图4.工程菌的发酵培养过程菌体生长和目的蛋白表达曲线。
图5.SP-Sepharose FF纯化电泳图。1.Marker，2.透析上清，3.SP-Sepharose FF离子交换层析穿透液，4-9.SP-Sepharose FF收集液。
具体实施例方式
本发明人通过深入而广泛的研究，通过优化设计人白细胞介素-4基因编码序列，将优化后的人白细胞介素-4编码序列构建入合适表达载体，转化宿主细胞，获得高表达菌株，并通过优化发酵、纯化工艺，实现了人白细胞介素-4高效表达，并且表达出的人白细胞介素-4保持生物学活性。在此基础上完成了本发明。
本发明根据人白细胞介素-4天然氨基酸序列，按密码子偏爱性，在不改变氨基酸序列的条件下，优化其核苷酸序列，全基因合成经优化的重组人白细胞介素-4蛋白的目的基因序列，将该基因克隆到pET3(+)中测序验证后，用分子克隆的常规方法，构建表达载体，转入大肠杆菌，通过施加抗生素筛选出表达工程细胞。试管筛选获得高表达工程细胞。摇瓶试验表明，诱导3小时后，目的蛋白占总蛋白35％以上，表达水平150mg/L以上。
在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程。在本发明中，工程菌表达重组人白细胞介素-4的发酵条件没有特别限制。可以采用本领域常规的发酵条件。例如，合适的培养基包括(但不限于)以下组成(vi)氮源含有机氮源和无机氮源，其中有机氮源如蛋白胨、酵母提取粉，或二者的混合物，总浓度0.5-1％；无机氮源如氨水或(NH4)2SO4等铵盐，浓度0.35-25％。
(vii)无机盐包括磷酸盐、Ca2+盐、Mg2+盐等。较佳地，磷酸盐缓冲体系浓度20-200mM，pH5-8；Mg2+盐0-5mM。
(viii)在培养基中添加维生素B1作为补充维生素，浓度1～1000PPM。
(ix)根据M9培养基中的微量元素配方，微量元素可加0.1-2ml/L培液。
(x)碳源为葡萄糖，是单一碳源。较佳地，葡萄糖浓度为1.0％，补料中葡萄糖浓度为11.25％。
为大规模获得重组人白细胞介素-4，需要在发酵罐中进行表达培养。本发明研究了中试发酵工艺，优化后的表达水平达到500mg/L。
在发酵表达后，对表达的重组人白细胞介素-4蛋白进行分离。通常，发酵样品先离心获得发酵液后沉淀即菌体。然后匀浆破菌经洗涤获得包涵体，包涵体变性后经凝胶过滤层析、Q Sepharose F.F.层析、SP-sepharose F.F.层析、透析复性、浓缩等。
经不同层析过程比较，优化的纯化方法包括1.对发酵样品进行离心获得发酵后沉淀；2.通过包涵体变性后经凝胶过滤层析、Q Sepharose F.F.层析、SP-sepharose F.F.层析、透析复性、浓缩，纯品纯度98％以上，得率约120mg/L发酵液。
纯品的活性按细胞病变抑制法进行测定，结晶紫染色，用酶标仪测定OD570值，最后以国际标淮品校正活性单位。生物活性检测目的蛋白比活性达2.5×106U/mg。
纯化后重组人白细胞介素-4可用常规技术制成各种剂型。
在本发明的一个实例中，构建了生产重组人白细胞介素-4的大肠杆菌表达工程细胞，IPTG诱导，高水平包涵体表达。
在本发明的另一个实例中，经过发酵工艺的优化，进一步提高了重组人白细胞介素-4的表达量。
在本发明的另一个实例中，由于蛋白包涵体表达，菌体经匀浆、洗涤获得包涵体，再经一系列纯化步骤后可得到纯品120mg/L。
纯化后原液加入适当辅料，制成重组人白细胞介素-4的注射用粉针剂。初步稳定性试验表明，该粉针剂稳定。
中试研究表明，产品制造工艺稳定，操作简单，周期短，成本低，每升发酵液可获得重组人白细胞介素-4纯品120mg，适合产业化生产。
本发明的优点在于(1)选用的是大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞，通过施加抗生素筛选出多拷贝转化细胞，进而筛选出高表达工程细胞。
(2)优化后的重组人白细胞介素-4蛋白基因非常适合在大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞中表达，具有高表达、高稳定的特点。
(3)通过控制关键的发酵工艺条件，使表达水平达到500mg/L。
(4)由于蛋白是以包涵体形式表达，确定了较佳的工艺路线，使变性蛋白的复性率大大提高，纯化工艺流程简单，能得到高纯度的IL-4蛋白，每升发酵罐培养液可获得120毫克以上、纯度大于98％重组人白细胞介素-4。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1表达质粒的构建和高表达工程菌株的获得根据人白细胞介素-4天然氨基酸序列，按密码子偏爱性，在不改变氨基酸序列的条件下，全基因合成重组人白细胞介素-4蛋白的目的基因序列(SEQ ID NO1)，该优化的IL-4基因序列与天然的IL-4基因序列同源性为93％(见图1)。将该基因克隆到pET-30a(+)中并测序验证。
表达载体构建方法见图2。通过PCR扩增得到目的人白细胞介素-4基因，用Nde I和EcoRI双酶切分别处理基因IL-4的PCR回收产物和质粒pET30a(+)，酶切后回收相应的片段用T4 DNA连接酶在16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5 α，在含有卡那霉素的LB平板上挑选抗性阳性的克隆，抽提质粒DNA，并进行质粒酶切鉴定。得到在pET30a(+)中插入了IL-4基因的重组质粒pET30a(+)/IL-4。
将构建好的表达质粒pET30a(+)/IL-4转化进入已制备好的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布含30μg/mL卡那霉素的LB平板，然后在转化平板上挑取单克隆，用碱裂解法抽提并检测质粒。将确证含有表达质粒pET30a(+)/IL-4的单克隆在含30μg/mL卡那霉素的LB平板上保存。
实施例2重组人白细胞介素-4的表达及表达形式的确定挑选一株确证好的表达工程菌BL21(DE3)/pET30a(+)/IL-4，用LB培养基进行培养及用IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳检测是否有目的条带的出现，并分析其表达量。取一部分发酵后的菌液离心，重悬于pH 8.0，20 mM Tris缓冲液，在冰浴下超声破菌，离心收集超声上清和超声沉淀，SDS-PAGE电泳检测，确定其表达形式。分析其超声上清和超声沉淀，目的蛋白绝大部分在沉淀中，表明目的蛋白是以包涵体形式表达(见图3)。
实施例3重组人白细胞介素-4的规模化发酵取鉴定为阳性克隆的表达工程菌BL21(DE3)/pET30a(+)/rhIL-4，在含有30ug/ml卡那霉素LB培养14～16小时；再按3％接种量接种于LB中长至OD600为1～3，作为二级种子液。配制改良M9发酵培养基2.96L(Glucose 1％，Yeast extract 0.5％，K2HPO10.5％，KH2PO40.35％，(NH4)2HPO40.35％，MgSO40.025％，CaCL20.1％)，倒入清洁过的发酵罐内，连罐高压灭菌后，冷却至30～40℃，将培养好的二级种子液按1.5％接种量接入发酵罐，37℃培养，并根据溶氧值不断调整通气流量和搅拌转速，控制溶氧40％以上。每小时取样测OD600值。培养至OD600达到5.0左右开始诱导，在发酵罐中加入IPTG至终浓度1mM进行诱导，诱导3.5小时收罐，发酵液于4200rpm，20分钟离心，收集沉淀称重。表达产物占菌体总蛋白的35％。见图4。
实施例4重组人白细胞介素-4纯化将发酵后的菌体重悬于20 mM Tris，pH 8.0，缓冲液，在冰浴下高压匀浆破菌，离心收集沉淀，再用Tris缓冲液洗涤沉淀，得到包涵体，按1∶10的比例，将包涵体在6M盐酸胍溶液内变性溶解，变性后的蛋白溶液离心取上清；对含1mM还原型谷胱甘肽和0.1mM氧化型谷胱甘肽的5％蔗糖缓冲液透析，使目的蛋白复性；复性后的上清过SP-Seharose fast flow离子交换层析柱，用0-1M NaCl缓冲液梯度洗脱，分管收集洗脱蛋白峰；SP洗脱峰透析后，过Q-Sepharose fast flow离子交换层析柱，进行浓缩。15％SDS-PAGE电泳检测纯化过程目的蛋白的纯度及含量(见图5)。
经过以上纯化工艺，最后可得蛋白纯品120mg/L。
实施例5重组人白细胞介素-4活性测定用人红细胞白血病细胞(TF-1)按参考文献9方法检测人IL-4，此法检测IL-4促进T细胞增殖的活性(Wang Junzhi(王军志).Research Exploitation and QualityControl of Biotechnic Medicament，2002，Science Press)。纯化的重组人白介素-4的活性达2.5×106U/mg。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海新生源生物医药研究有限公司<120>重组人白细胞介素-4的生产方法<160>2<210>1<211>498<212>DNA<213>人工序列<221>misc_feature<222>(1).(498)<223>优化的重组人白细胞介素-4基因<400>1atgagttaca acttgcttgg attcctacaa agaagcagca attttcagtg tcagaagctc 60ctgtggcaat tgaatgggag gcttgaatac tgcctcaagg acaggatgaa ctttgacatc 120cctgaggaga ttaagcagct gcagcagttc cagaaggagg acgccgcatt gaccatctat 180gagatgctcc agaacatctt tgctattttc agacaagatt catctagcac tggctggaat 240gagactattg ttgagaacct cctggctaat gtctatcatc agattaacca tctgaagaca 300gtcctggaag aaaaactgga gaaagaagat ttcaccaggg gaaaactcat gagcagtctg 360cacctgaaaa gatattatgg gaggattctg cattacctga aggccaagga gtacagtcac 420tgtgcctgga ccattgtcag agtggaaatc ctaaggaact tttacttcat taacagactt 480acaggttacc tcagaaac 498<210>2<211>166<212>PRT<213>智人<400>2Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe15 10 15Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr20 25 30Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys35 40 45Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr50 55 60
Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser65 70 75Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn80 85 90Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys95 100 105Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu110 115 120His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala125 130 135Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile140 145 150Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg155 160 165Asn16权利要求
1.一种编码重组人白细胞介素-4的DNA序列，其特征在于，其DNA序列与SEQID NO1所示的序列有区别，但编码如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA序列。较佳地，所述的表达载体是pET30a(+)/IL-4。
3.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求2所述的表达载体或权利要求1所述的编码重组人白细胞介素-4的DNA序列。
4.一种生产重组人白细胞介素-4的方法，其特征在于，它包括步骤a)在适合的表达条件下，培养如权利要求4所述的宿主细胞，从而表达出人白细胞介素-4蛋白；较佳地，所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞BL21(DE3)。b)分离纯化出表达的人白细胞介素-4蛋白。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞是大肠杆菌。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中进行高密度悬浮培养。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步骤(b)包括步骤(i) 对发酵样品通过离心和/或过滤方式去除上清，获得发酵后菌体；(ii) 对发酵沉淀进行匀浆破菌、洗涤获得包涵体；(iii) 对包涵体进行变性溶解(iv) 层析纯化，所述的层析选自凝胶过滤层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析及其组合。(v) 采用透析复性的方法，复性上清再进行阳离子交换层析进行浓缩。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的培养条件是培养温度为30-40℃，更佳地34-38℃；pH在6～8之间，更佳地在6.5～7.5之间；葡萄糖或甘油浓度为0.1～5％，更佳地在1.0％；添加维生素B1作为补充维生素；微量元素可加0.1-2ml/L培液；诱导剂为IPTG浓度在0.1-1mg/L之间，诱导前OD600在0.5～20之间，更佳地在1～10之间；诱导时间0.5～10小时，更佳地1～5小时。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的纯化条件是对发酵样品进行离心获得发酵后沉淀；沉淀变性后经凝胶过滤层析、Q Sepharose F.F.层析、SP-Sepharose F.F.层析、透析复性、浓缩，获得纯度98％以上的纯品。
10.重组人白细胞介素-4，包括用权利要求2所述的表达载体转化的寄主细胞，培养转化体，从培养物获得重组人白细胞介素-4的步骤的方法制备。
全文摘要
本发明提供了一种重组人白细胞介素－4的编码序列、生产该重组人白细胞介素－4的方法，以及用于该方法的表达载体和宿主细胞，首次采用了pET系统表达IL－4，获得了高水平的表达菌株；通过控制发酵条件，达到了较高蛋白表达率，在此基础上对包涵体表达的重组人白细胞介素－4的纯化进行了大量的摸索和研究后，得到了一套IL－4纯化方法。用本法，可得到高得率、高纯度的重组人白细胞介素－4蛋白，并能满足临床需要。本发明可高效、简便、低成本地获得重组人白细胞介素－4纯品。
文档编号C07K1/14GK101089181SQ20061002765
公开日2007年12月19日 申请日期2006年6月13日 优先权日2006年6月13日
发明者黄阳滨, 孙九如, 张翊, 任军, 陈子珺, 徐晓燕, 刘勇, 张甘良 申请人:上海新生源医药研究有限公司, 上海新生源生物医药有限公司