专利名称：一种重组鸡β－防御素的生产方法及工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物类药物的生产制造技术领域，确切的说是一种重组鸡β-防御素的生产方法及工艺
背景技术：
抗生素类药物作为抗微生物治疗药物和饲料添加剂广为长期使用，带来严重的安全性问题，一是细菌对抗生素产生严重抗药性，致使许多药物越来越不敏感；二是抗生素在动物性食品中产生严重药物残留，严重影响人类的身体健康，因此，抗生素在动物类药物中的限用和禁用已成为必然趋势。
防御素是由昆虫、动物、植物及人所产生的一大类具有抑制或杀伤外来微生物的小分子肽。与抗生素相比，其具有更广的抗菌谱，对革兰氏阴性、革兰氏阳性细菌、真菌、病毒、甚至寄生虫都有杀伤作用，同时其参与机体的免疫调节，这是抗生素所不能比拟的，是理想的抗生素替代产品。但是，到目前为止，大规模化生产防御素比较困难。目前报导的防御素一般是从生物组织中提纯出来，这些方法成本高、获得率低，难以工业化生产。
发明内容
本发明的目的，便是提供一种重组鸡β-防御素的生产方法及工艺。依此方法及工艺获得的重组鸡β-防御素成本低、获得率高，可大规模工业化生产，且具有更广的抗菌性。
为达到上述技术目的，本发明采取了以下技术方案方案一大肠杆菌重组鸡β-防御素融合蛋白用RT-PCR技术从鸡上皮粘膜组织(舌头)总RNA中扩增鸡β-防御素gaIIinacin-3的编码基因，并在基因的两端引入适当的核酸内切酶识别位点，把鸡β-防御素编码基因插入到大肠杆菌表达载体PGEX-6P-1的多克隆位点，使该基因置于谷胱甘肽S-转移酶(GST)编码基因的下游，并形成正确的阅读框架；于30-40°环境下，在培养基中加入0.1-2mMoI/L IPTG，振荡培养2-10小时，诱导融合蛋白基因表达，在SDS-PAGE电泳中可出现分子量约为34kDa的一种蛋白质离心收集诱导后的重组大肠杆菌，用超声细胞破碎仪把细菌破碎。高速离心收集包涵体，并用Triton缓冲液清洗；用含尿素的裂解缓冲液溶解包含体，然后用复性缓冲液稀释包涵体裂解液，使包涵体复性。
技术方案二酵母分泌性表达重组鸡β-防御素将两端引入适当的核酸内切酶识别点的鸡β-防御素gaIIinacin-3的编码基因插入到酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点，使该基因置于a因子的下游，并形成正确的阅读框架；用电转化法或化学转化法，把重点质粒转化到酵母菌中。在含Geneticin的YPD培养平板上培养24-96小时，筛选阳性转化酵母菌株。选取经PCR法鉴定其染色体DNA上携带鸡β-防御素基因的重组酵母菌；把重组酵母菌在MGY培养基中，于发酵罐中28-38℃培养到OD600值达2-6时，离心收集酵母菌体。用BMMY培养基重悬重组酵母菌，定期补充甲醇并使培养液中甲醇终浓度保持在0.1-1.0％，继续培养24-96小时后，离心收集上清液；浓缩培养上清液，把浓缩液经SephacryaI S-200 HR层析柱纯化即可获得重组鸡β-防御素。
技术方案三重组鸡β-防御素乳酸菌结构性表达将两端引入适当的核酸内切酶识别位点的鸡β-防御素gaIIinacin-3的编码基因插入到表达载体pMG36的多克隆位点，使该基因置于乳酸杆菌cremoris亚种Mg2蛋白编码基因的下游，并形成正确的阅读框架；用电转化法把重组质粒转化到乳酸乳球菌中，在含抗生素的M17琼脂培养平板上培养、筛选阳性转化菌；把转化菌株在含抗生素M17-葡萄糖液体培养基中静止培养12-28小时；离心收集重组乳酸菌，从重组乳酸菌中制备重组质粒；用PCR法鉴定重组乳酸菌由质粒携带的鸡β-防御素基因；把阳性重组乳酸菌在M17中培养24小时，离心收集重组菌体。超声破碎重组菌体，并在6000转/分钟速度离心30分钟，分离上清液；把上清液经SephacryaIs-200 HR层析柱纯化即可获得重组鸡β-防御素融合蛋白。
由于采取上述技术方案一种重组鸡β-防御素的生产方法及工艺，能达到防御素生产成本低，获取率高，可规模化生产且成品更具广谱抗菌性。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进一步说明一、根据本发明技术方案一，一种重组鸡β-防御素的生产方法及工艺是用RT-PCR技术从鸡上皮粘膜组织(舌头)总RNA中扩增鸡β-防御素gaIIinacin-3编码基因，并在基因的两端引入适当的核酸内切酶识别位点；把鸡β-防御素编码基因插入到大肠杆菌表达载体PGEX-6P-1的多克隆位点，使该基因置于谷胱甘肽S-转移酶(GST)编码基因的下游，并形成正确的阅读框架；于生产用发酵罐中37℃环境下，在培养基中加入1mMoI/L IPTG，振荡培养5小时，诱导融合蛋白基因表达，在SDS-PAGE电泳中可出现分子量约为34kDa的一种蛋白质；离心(2000转/分，30分钟)收集诱导后的重组大肠杆菌，用超声细胞破碎仪把细菌破碎。高速离心(20000转/分，30分钟)收集包涵体，并用Triton缓冲液清洗3次；用含尿素的裂解缓冲液溶解包含体，然后用复性缓冲液稀释包涵体裂解液，使包涵体复性即可得到重组鸡β-防御素融合蛋白。
二、根据本发明技术方案二2、酵母分泌性表达重组鸡β-防御素将两端引入适当的核酸内切酶识别点的鸡β-防御素gaIIinacin-3的编码基因插入到酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点，使该基因置于a因子的下游，并形成正确的阅读框架；用电转化法或化学转化法，把重点质粒转化到酵母菌中。在含Geneticin的YPD培养平板上培养24-96小时，筛选阳性转化酵母菌株。选取经PCR法鉴定其染色体DNA上携带鸡β-防御素基因的重组酵母菌；把重组酵母菌在MGY培养基中，于发酵罐中28-38℃培养到OD600值达2-6时，离心收集酵母菌体。用BMMY培养基重悬重组酵母菌，定期补充甲醇并使培养液中甲醇终浓度保持在0.20％，继续培养96小时后，离心收集上清液；浓缩培养上清液，把浓缩液经SephacryI S24-96小时后，离心收集上清液；浓缩培养上清液，把浓缩液经SephacryaI S-200 HR层析柱纯化即可获得重组鸡β-防御素。
三、根据本发明技术方案一种重组鸡β-防御素的生产方法及工艺是将两端引入适当的核酸内切酶识别位点的鸡β-防御素gaIIinacin-3的编码基因插入到表达载体pMG36的多克隆位点，使该基因置于乳酸乳杆菌cremoris亚种Mg2蛋白编码基因的下游，并形成正确的阅读框架；用电转化法把重组质粒转化到乳酸乳球菌中，在含抗生素的M17琼脂培养平板上培养24小时、筛选阳性转化菌；把转化菌株在含抗生素的M17-葡萄糖液体培养基中静止培养24小时；离心收集重组乳酸菌，从重组乳酸菌中制备重组质粒；用PCR法鉴定重组乳酸菌由质粒携带的鸡β-防御素基因；把阳性重组乳酸菌在M17中培养24小时，离心收集重组菌体。超声破碎重组菌体，并在6000转/分钟速度离心30分钟，分离上清液；将上清液经SephacryI S-200 HR层析柱纯化即可获得重组鸡β-防御素融合蛋白。
权利要求
1.一种重组鸡β-防御素的生产方法及工艺，主要用大肠杆菌重组鸡β-防御素融合蛋白，其特征在于用RT-PCR技术从鸡上皮粘膜组织(舌头)总RNA中扩增鸡β-防御素gaIIinacin-3的编码基因，并在基因的两端引入适当的核酸内切酶识别位点，把鸡β-防御素编码基因插入到大肠杆菌表达载体PGX-6P-1的多克隆位点，使该基因置于谷胱甘肽S-转移酶(GST)编码基因的下游，并形成正确的阅读框架；于30-40°环境下，在培养基中加入0.1-2mMoI/L IPTG，振荡培养2-10小时，诱导融合蛋白基因表达，在SDS-PAGE电泳中可出现分子量约为34Kda的一种蛋白质离心收集诱导后的重大肠杆菌，用超声细胞破碎仪把细菌破碎，高速离心收集包涵体，并用Triton缓冲液清洗；用含尿素的裂解缓冲液溶解包含体，然后用复性缓冲液稀释包涵体裂解液，使包涵体复性。
2.一种重组鸡β-防御素的生产方法及工艺，主要以酵母分泌性表达重组鸡β-防御素，其特征在于将两端引入适当的核酸内切酶识别点的鸡β-防御素gaIIinacin-3的编码基因插入到酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点，使该基因置于a因子的下游，并形成正确的阅读框架；用电转化法或化学转化法，把重点质粒转化到酵母菌中。在含Geneticin的YPD培养平板上培养24-96小时，筛选阳性转化酵母菌株。选取经PCR法鉴定其染色体DNA上携带鸡β-防御素基因的重组酵母菌；把重组酵母菌在MGY培养基中，于发酵罐中28-38℃培养到OD600值达2-6时，离心收集酵母菌体，用BMMY培养基重悬重组酵母菌，定期补充甲醇并使培养液中甲醇终浓度保持在0.1-1.0％，继续培养24-96小时后，离心收集上清液；浓缩培养上清液，把浓缩液经SephacryaI S-200 HR层析柱纯化即可获得重组鸡β-防御素。
3.一种重组鸡β-防御素的生产方法及工艺，主要以乳酸菌结构性表达，其特征在于将两端引入适当的核酸内切酶识别位点的鸡β-防御素gaIIinacin-3的编码基因插入到表达载体pMG36的多克隆位点，使该基因置于乳酸杆菌cremoris亚种Mg2蛋白编码基因的下游，并形成正确的阅读框架；用电转化法把重组质粒转化到乳酸乳球菌中，在含抗生素的M17琼脂培养平板上培养、筛选阳性转化菌；把转化菌株在含抗生素M17-葡萄糖液体培养基中静止培养12-28小时；离心收集重组乳酸菌，从重组乳酸菌中制备重组质粒；用PCR法鉴定重组乳酸菌由质粒携带的鸡β-防御素基因；把阳性重组乳酸菌在M17中培养24小时，离心收集重组菌体，超声破碎重组菌体，并在6000转/分钟速度离心30分钟，分离上清液；把上清液经SephacryaI s-200 HR层析柱纯化即可获得重组鸡β-防御素融合蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种重组鸡β－防御素的生产方法及工艺其主要目的是通过本发明获得低成本，高药效的抗菌药防御素，用来降低和减少目前广为应用的抗生素类药在动物肌体中形成的抗体和药物残留，从而保障人类的身体健康。本发明方法简便，工艺科学，所获得的防御素抗菌效果明显优于抗生素，可广泛应用于规模化生产和临床。
文档编号C07K19/00GK1651576SQ20041002356
公开日2005年8月10日 申请日期2004年2月7日 优先权日2004年2月7日
发明者赵建增, 乔彦良, 李朝阳, 韩树盛 申请人:山东信得药业有限公司