专利名称：一种重组艾塞那肽的生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于生物多肽的合成技术领域，具体涉及一种重组艾塞那肽的生产工艺。
背景技术：
糖尿病是继心脑血管疾病、肿瘤之后的另一个严重危害人类健康的慢性非传染性疾病，近年来，随着人们生活方式的改变，糖尿病患病率呈急剧上升趋势。目前我国糖尿病患者已逾7000万，并且糖尿病患者增长率是欧美国家的2倍。2型糖尿病(Type 2Diabetes, T2DM)是糖尿病的主体，占糖尿病患者的90%左右。T2DM是由遗传和多种环境因素相互作用而引起胰岛索分泌或作用缺陷。其患病率较高，尤以中老年人为多，并呈现年轻化趋势。胰岛口细胞数目减少或分泌功能障碍是导致T2DM发病的中心环节。治疗一般遵循生活方式干预(如饮食控制、运动治疗等)、口服降糖药和联合使用胰岛素等方式。传统治疗T2DM的药物的副作用都较大，长期使用会因胰岛素分泌过度导致胰岛口细胞功能衰竭。近年来胰高血糖素样肽I(GLPl)和enendin — 4成为糖尿病治疗研究的热点。因为它们具有在血糖浓度较高的情况下促进胰岛素分泌的特性，而在血糖正常的情况下不发挥作用，不仅可使初治的2型糖尿病患者血糖恢复正常，而且对磺脲类药物治疗失效者也有降血糖作用。Exendin-4是一条39个氨基酸组成的直链多肽，最初由南美巨蜥的唾液分离提取获得。它的氨基酸残基与哺乳动物GLP-I序列有53%的同源性，并且生物学效应也几乎完全一致其与GLP-I的最大不同之处在于N端第2位的甘氨酸(Gly)耐血液中二肽基肽酶(DPP-IV)jGLP-I的相同位置则为极易被DPP-IV切断的丙氨酸(Ala)，故Exendin-4被吸收入血后的半衰期较长(tl/2 E =9. 7h )。Exendin-4是一种强效GLP-I受体激动剂，能模拟GLP-I这种内源性多肽的糖调控作用，降低空腹和餐后血糖。艾塞那肽(Exenatide)的活性主要通过与人体胰脏GLP-I受体结合而介导，由环腺苷酸(cAMP)依赖和β细胞分化机制引发葡萄糖依赖的胰岛素合成和分泌。因为Exendin-4的氨基酸结构及生物活性与GLP-I均具有相关性，故通常也被视为肠促胰岛素的一种。由于Exendin-4的降糖作用时间较长，延缓胃排空和抑制摄食冲动对肥胖病人体重的有益作用又有别于传统的降糖药物，因此其作为2型糖尿病治疗药物开发的潜力巨大。目前对Exendin-4进行的药物研究主要为制备工艺，作用机制，内分泌代谢病临床，分子药理学和药剂学研究。已上市的Exendin-4药物(Exenatide)采用的是多肽合成法的制备工艺。化学合成成本高(对原料氨基酸及仪器设备要求极高)、产量少，而利用基因工程生产Exendin — 4，不仅可以实现工业化的大规模生产、有效地降低生产成本，而且对环境影响小，产品品质更安全。但用基因工程方法直接表达生产Exendin-4这样的39肽，表达水平低，且容易降解，可采用与载体蛋白(如硫氧还蛋白等)连结融合表达的方法。但这种方法也存在融合蛋白分子中的目的多肽分子所占比例很小，产量很低，且融合蛋白裂解后多肽种类很多，分离纯化困难的问题。行之有效的增加基因的表达产物的方法是构建基因串联体，根据目标基因的特点和表达产物的特性，运用适当的分子生物学操作技术将目的基因按一定的方式串联在一起，置于表达载体启动子控制之下进行表达，再将表达的串联体产物用特定的物质(酶或化学试剂)裂解，以获得目标肽单体。比如pET-31b ( + )是一个常用的生产多肽的质粒，但是它用来生产多肽，当初设计是为了避免多肽容易被大肠杆菌体内的蛋白水解酶水解，所以让目的多肽和KSI融合蛋白一起表达，形成了包涵体，这对生产Exendin-4来说是个很大的缺点，如果让Exendin-4先生成包涵体再复性会造成纯化成本的大大提高和活性的难以恢复，这已是重组艾塞那肽的产业化生产的瓶颈。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的上述技术问题，提供一种重组艾塞那肽的生产工艺。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下
本发明的重组艾塞那肽的生产工艺，包括工程菌的构建、工程菌的发酵表达和目的蛋白的纯化，所述的工程菌的构建是按下述步骤进行的
(1)重组Exendin— 4多肽基因序列的人工合成根据大肠杆菌密码子偏爱性，设计编码Exendin — 4的核苷酸序列，改造为如SEQ ID No. I所示的目的基因；
(2)MAG2010质粒取pET31b(+)质粒，切割掉SEQID No. 2所示KSI融合基因片段，更换为SEQ ID No. 3所示的基因，删除限制性内切酶AlwnI酶切位点和蛋氨酸和后继序列，取代以肠激酶酶切位点和目的蛋白的基因，切割掉组氨酸标记序列，在GBl蛋白的前面添加组氨酸标记，在目的蛋白的羧基末端添加双终止子；构建的质粒顺序为蛋氨酸编码序列+6XHis_tag编码序列+ GB-I编码序列+肠激酶酶切位点编码序列+和目的蛋白的基因+甘氨酸编码+双终止子；
(3)工程菌的构建按照启动子-6X组氨酸-GBl-tag-肠激酶的裂解位点-exedin-4-双终止密码子的顺序得到的基因片段，利用CloneEZ试剂盒连接到已经切割好的MAG2010质粒中，得到重组质粒pET-31 (b+) -Exendin-4,将重组质粒pET-31 (b+) -Exendin-4 以 CaCl2 法转化受菌体 BL21 (DE3) plays,在 37 °C 下在 LB 培养基中进行培养，收集菌体，筛选阳性克隆，作为重组Exendin-4融合表达的工程菌pET-31 (b+)-Exendin-4/ BL21 (DE3) plays。要使生物合成Exendin-4能进行扩大规模的生产应用，关键之一是对发酵过程优化，最大可能的利用菌株Exendin-4高产能力，以最经济的方式进行生产。一般来说，生产可溶性蛋白时不能采用高密度发酵的方法，因为这样容易形成包涵体，目前国内外利用的培养基大多为2XYT培养基或者LB培养基来进行培养，利用的大多是实验室内研究型的摇瓶法培养。本发明的工程菌的发酵表达包括下述步骤
(1)挑单菌落到装有30mL目标培养基中，3rc，200rpm活化过夜；
(2)将30mL菌液接到200mL 2XYT培养基中，32°C，200rpm培养约2. 6 hr ；
(3)以10%的接种量，接到5L MMBL培养基中，32°C，240rpm培养约3 hr ；
(4)接到60L发酵培养基中；
(5)控制生长期pH为6.8 ;用搅拌速度及通气量使DO ^ 10% ;待培养基中葡萄糖的浓度降至O. 2g/L时开始补料；当OD55tl达到10左右时加入13 mL IM IPTG诱导，终浓度为
0.2mM,把pH缓慢调至7. 00,继续培养10小时后结束。所述的目的蛋白的纯化步骤采用离子交换层析-柱层析-三明治型的亲和层析进行分离和纯化；该工程菌经过发酵、纯化得到的重组艾塞那肽的产量达到500毫克/升的产率。所述的三明治型的亲和层析包括亲和层析一、酶裂解和亲和层析二，具体步骤如下
(1)亲和层析一采用GE公司的IgG-sepharose-fast flow column,首先用3个柱体积的50 mM Tris, pH 7.5,150 mM NaCI的缓冲液平衡柱子，然后用将用相同缓冲液透析过的蛋白质上柱，用I倍体积上述缓冲液洗然后用5mM乙酸钠，pH5. O的缓冲液洗去未结合的杂质，接着用500mM乙酸钠，pH5. O的缓冲液将目的蛋白洗脱下来，收集、浓缩，用足量的20mM Tris-HCl，IOOmM NaCl，ρΗ7· 6 透析 12 小时；
(2)肠激酶处理1μ I的重组牛肠激酶轻链亚基在20°C，20mM Tris-HCl，IOOmM NaCl,pH7. 6的条件下8h可以完全切割融合蛋白；
(3)亲和层析二将上述处理过的重组Exendin-4结合在镍柱上,先用起始缓冲液冲洗脱磷酸盐缓冲液，保留洗脱组分，浓缩，冷冻干燥，得到重组的艾塞那肽。由于艾塞那肽是一个分子量比较小的多肽，并不适合用大分子蛋白的体系进行表达，所以我们采用专门用来改造后的生产多肽表达体系pET-31b ( + )质粒和E. Coli(DE3) PlyS进行生产，采用这个体系有以下优点pET_31b ( + )是一个生产多肽的质粒，目的多肽和KSI融合蛋白一起表达，形成了包涵体，可以避免生产的多肽被大肠杆菌体内的蛋白水解酶水解，但是这对生产Exendin-4来说是个很大的缺点，如果让Exendin-4首先生成包涵体的形式然后再复性会造成纯化成本的大大提高和活性的难以恢复，所以我们对pET-3Ib ( + )进行了改造，将pET-31b ( + )中的KSI融合蛋白序列完全删除，同时删除蛋氨酸裂解位点(ALWN切割位点)和C末端(多肽羧基端的)组氨酸标记(His6-tag)以及终止子，在删除的位置，取代以蛋氨酸+ His6-tag+GBl突变序列+肠激酶裂解序列，我们将改造的pET-3Ib ( + )形成的新质粒重新命名为Mag2010,有了这个质粒,我们首先取得Exendin-4的原始序列，然后按照大肠杆菌对于遗传密码子的偏好进行了改造，采用适合大肠杆菌表达的遗传序列，人工合成改造的Exendin-4的全序列,然后克隆岛HJC57质粒中进行大规模扩增，将扩增后的Exendin-4序列切割并纯化，然后克隆到改造好的Mag2010质粒中，并在C末端添加双重终止子，这么做的好处是利用了 pET-31b(+)本身的可以大规模，高产量的生产多肽的优点，保留了它的功能强大的启动子，克服了该质粒容易形成包涵体的缺点，利用了肠激酶的切割特性在目的蛋白的N末端进行切割，切割后的蛋白质完全是具有天然序列的Exendin-4。利用大肠杆菌E. Coli BL21 (DE3)PlyS表达体系的原因在于Exendin-4没有需要糖基化修饰等翻译后修饰，DNA转录时也不需要转录后修饰，所以特别适合用大肠杆菌体系进行生产，再加上我们克服了形成包涵体的问题，而E. Coli BL21(DE3)PlyS的优点在于可以大量表达外源蛋白，而且耐外源蛋白等毒素的干扰。本发明通过连接GBl标记融合蛋白将艾塞那肽有90%的形成包涵体的可能性变成了 90%的形成可溶性蛋白。实验证明，绝大部分重组产生的艾塞那肽都处于可溶蛋白中。在国内外进行的艾塞那肽表达的体系中，很多人采用了 His6-Thioredoxin A(TrxA)融合蛋白和Exendin-4进行融合表达，融合蛋白分子量为14. 7+4. 2=18. 9kd,exendin在融合蛋白中的比率为4. 2/18. 9=22. 2%.我们采用了自身分子量较小的GBl和Exendin-4进行融合表达,融合蛋白分子量为14. 7+4. 2=18. 9kd, exendin在融合蛋白中的比率为4. 2/11. 9=35. 3%。也就是说，Exendin-4在融合蛋白中的比重大大增加了，在类似的体系下，假如表达的融合蛋白总量相等，那么exendin-4在我们的体系中产量是其他体系的I. 59倍。本发明采用GBl和His-tag双标记的体系使得在纯化过程中既可以采用镍柱亲和 层析，又可以采用GBl亲和层析，相对于其他的纯化方法，可以有更多的纯化选择方式。在现有的文献报道中，产量很低，最多的也就是28毫克/升的产量，利用本发明的发酵体系，我们可以达到500毫克/升的产率，这个产量为目前发酵工艺的20倍左右，所以规模化生产后可以大大降低成本。对于艾塞那肽类的药物成本价格降低和药物的普及有着难以估量的意义，就像重组人胰岛素开发成功后对于胰岛素的普及那样有着重要的社会价值和经济价值。本发明的生产工艺相对于目前的工艺有着显著的特点产量可以达到500mg/升以上，比目前最先进的工艺产量提高了 20倍，且均为可溶性蛋白，在生产过程中，我们采用了本公司独特具有自主知识产权的的发酵工艺，产量大大提高，我们采用的双重亲和纯化工艺，配合传统的纯化方法，纯化效率有了极大的提高，前期粗提取的纯化，减轻了后继纯化的压力，降低了纯化的成本。
图I发酵过程中细菌生长曲线图。图2是发酵过程参数监测结果图。图3是质粒的稳定性分析结果图。图4是质粒的细胞内含量图。图5是活性细胞的检测结果图。图6是聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明作详细说明。一、工程菌的构建
(I)重组Exendin — 4多肽基因序列的人工合成根据大肠杆菌密码子偏爱性，设计编码Exendin — 4的核苷酸序列，改造为如SEQ ID No. I所示的目的基因；合成后的基因克隆进质粒HJC57中，转化进大肠杆菌DH5 a中进行扩增,然后用EZ Bioresearch公司的质粒提取试剂盒进行纯化，切割后的目的基因出纯化备用。(2)MAG2010 质粒MAG2010 质粒取 pET31b(+)质粒，切割掉 SEQ ID No. 2 所示KSI融合基因片段，更换为SEQ ID No. 3所示的基因，删除限制性内切酶AlwnI酶切位点和蛋氨酸和后继序列，取代以肠激酶酶切位点和目的蛋白的基因，切割掉组氨酸标记序列，在GBl蛋白的前面添加组氨酸标记，在目的蛋白的羧基末端添加双终止子；构建的质粒顺序为蛋氨酸编码序列+6XHis_tag编码序列+ GB-I编码序列+肠激酶酶切位点编码序列+和目的蛋白的基因+甘氨酸编码+双终止子。
(3)工程菌的构建按照启动子-6X组氨酸-GBl-tag-肠激酶的裂解位点-exedin-4-双终止密码子的顺序得到的基因片段，利用CloneEZ试剂盒连接到已经切割好的MAG2010质粒中，得到重组质粒pET-31 (b+) -Exendin-4,将重组质粒pET-31 (b+) -Exendin-4 以 CaCl2 法转化受菌体 BL21 (DE3) plays,在 37 °C 下在 LB 培养基中进行培养，收集菌体，筛选阳性克隆，作为重组Exendin-4融合表达的工程菌pET-31 (b+)-Exendin-4/ BL21 (DE3) plays。亚克隆所用的质粒购自美国Novagen公司，大肠杆菌DH5 a和BL21 (DE3)PlyS分别购自北京索莱宝生物科技有限公司公司和红叶生物科技有限公司，所用的限制性内切酶购自大连宝生物(Takara)，肠激酶购自美国西格玛公司(Sigma),质粒提取试剂盒采用本公司销售的美国EZ Bioresearch小量质粒提取试剂盒。二、工程菌的发酵表达
I、种子活化
(I)种子活化取冻存的工程菌划线在含lOOul/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37°C培养16小时。挑选生长良好的单菌落，接种于20ml LB培养液中(含AmplOOul/ml )，37°C培养过夜。(2)种子液制备取活化种子，按5%接种量接种于200ml 2XYT培养液中(含Ampl00ul/ml)，37°C培养 6 小时。(3) 5L发酵罐发酵将种子液按5%接种量接种于装有MMBL培养基的发酵罐中，370C，控制pH在7. O左右，通过通气及转速控制溶氧在30%。0D600为20左右时，加入IPTG至终浓度为O. 2mM，诱导10小时后下罐。离心，收集菌体。2、培养基配方
(1)LB液体培养基(一级摇瓶)
权利要求
1.一种重组艾塞那肽的生产工艺，包括工程菌的构建、工程菌的发酵表达和目的蛋白的纯化，其特征在于所述的工程菌的构建是按下述步骤进行的 (1)重组Exendin— 4多肽基因序列的人工合成根据大肠杆菌密码子偏爱性，设计编码Exendin — 4的核苷酸序列，改造为如SEQ ID No. I所示的目的基因； (2)MAG2010质粒取pET31b(+)质粒，切割掉SEQID No. 2所示KSI融合基因片段，更换为SEQ ID No. 3所示的基因，删除限制性内切酶AlwnI酶切位点和蛋氨酸和后继序列，取代以肠激酶酶切位点和目的蛋白的基因，切割掉组氨酸标记序列，在GBl蛋白的前面添加组氨酸标记，在目的蛋白的羧基末端添加双终止子； (3)工程菌的构建按照启动子-6X组氨酸-GBl-tag-肠激酶的裂解位点-exedin-4-双终止密码子的顺序得到的基因片段，利用CloneEZ试剂盒连接到已经切割好的MAG2010质粒中，得到重组质粒pET-31 (b+) -Exendin-4,将重组质粒pET-31 (b+) -Exendin-4 以 CaCl2 法转化受菌体 BL21 (DE3) plays,在 37 °C 下在 LB 培 养基中进行培养，收集菌体，筛选阳性克隆，作为重组Exendin-4融合表达的工程菌pET-31 (b+)-Exendin-4/ BL21 (DE3) plays。
2.根据权利要求I所述的重组艾塞那肽的生产工艺，其特征在于所述的工程菌的发酵表达包括下述步骤 (1)挑单菌落到装有30mL目标培养基中，3rC，200rpm活化过夜； (2)将30mL菌液接到200mL 2XYT培养基中，32°C，200rpm培养约2. 6 hr ； (3)以10%的接种量，接到5L MMBL培养基中，32°C，240rpm培养约3 hr ； (4)接到60L发酵培养基中； (5)控制生长期pH为6.8 ;用搅拌速度及通气量使DO ^ 10% ;待培养基中葡萄糖的浓度降至O. 2g/L时开始补料；当OD55tl达到10左右时加入13 mL IM IPTG诱导，终浓度为O. 2mM,把pH缓慢调至7. 00,继续培养10小时后结束。
3.根据权利要求I或2所述的重组艾塞那肽的生产工艺，其特征在于所述的目的蛋白的纯化步骤采用离子交换层析-柱层析-三明治型的亲和层析进行分离和纯化；该工程菌经过发酵、纯化得到的重组艾塞那肽的产量达到500毫克/升的产率。
4.根据权利要求3所述的重组艾塞那肽的生产工艺，其特征在于所述的三明治型的亲和层析包括亲和层析一、酶裂解和亲和层析二，具体步骤如下 (1)亲和层析一采用GE公司的IgG-sepharose-fast flow column,首先用3个柱体积的50 mM Tris, pH 7. 5,150 mM NaCI的缓冲液平衡柱子，然后用将用相同缓冲液透析过的蛋白质上柱，用I倍体积上述缓冲液洗然后用5mM乙酸钠，pH5. O的缓冲液洗去未结合的杂质，接着用500mM乙酸钠，pH5. O的缓冲液将目的蛋白洗脱下来，收集、浓缩，用足量的20mM Tris-HCl，IOOmM NaCl，ρΗ7· 6 透析 12 小时； (2)肠激酶处理1μ I的重组牛肠激酶轻链亚基在20°C，20mM Tris-HCl，IOOmM NaCl,pH7. 6的条件下8h可以完全切割融合蛋白； (3)亲和层析二将上述处理过的重组Exendin-4结合在镍柱上,先用起始缓冲液冲洗脱磷酸盐缓冲液，保留洗脱组分，浓缩，冷冻干燥，得到重组的艾塞那肽。
全文摘要
一种重组艾塞那肽的生产工艺，通过对pET-31b(+)进行了改造，将pET-31b(+)中的KSI融合蛋白序列完全删除，同时删除蛋氨酸裂解位点(ALWN切割位点)和C末端(多肽羧基端的)组氨酸标记(His6-tag)以及终止子,在删除的位置，取代以蛋氨酸+His6-tag+GB1突变序列+肠激酶裂解序列，然后构建工程菌pET-31(b+)-Exendin-4/BL21(DE3)plays。利用了pET-31b(+)本身的可以大规模，高产量的生产多肽的优点，保留了它的功能强大的启动子，克服了目前其他生产工艺中该蛋白产物容易形成包涵体的缺点，利用了肠激酶的切割特性在目的蛋白的N末端进行切割，切割后的蛋白质完全是具有天然序列的Exendin-4。经过工程菌的发酵表达和目的蛋白的纯化后得到重组艾塞那肽。产量可以达到500mg/升以上，比目前最先进的工艺产量提高了20倍，且均为可溶性蛋白。
文档编号C07K1/16GK102618552SQ20121009455
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月1日 优先权日2012年4月1日
发明者孟建军, 张严冬, 李相鲁 申请人:东莞市麦亘生物科技有限公司