包含淀粉结合部位的重组蛋白质及其用途的制作方法

专利名称：包含淀粉结合部位的重组蛋白质及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及根霉属真菌(Rhizopus spp.)的葡萄糖淀粉酶的淀粉结合部位(SBD)的功能。包含SBD的重组蛋白质的生产及纯化可通过使用SBD作为标签。本发明尤其涉及一种纯化该重组蛋白质的新颖方法和试剂盒以及SBD和该重组蛋白质的新颖应用。本发明提供一种包含淀粉结合部位的纤维。本发明亦提供一种鉴别候选淀粉分解酶的淀粉结合部位的配体结合位点的方法。
背景技术：
通过在微生物系统内表现来生产蛋白质已成为高价、医药上的重要蛋白质的重要来源。重组蛋白质的纯化和回收是发酵工艺设计上的重要考虑。传统的蛋白质纯化方法可用以纯化产物，而改良的方法，包括使用重组蛋白质，重组蛋白质可通过亲和性管柱层析法加以纯化，所欲纯化的重组蛋白质的组分可通过其与亲和性基质上结合的多肽形成共价性 连结而被纯化。某些系统通过亲和性管柱层析的原理来分离蛋白质。美国专利第5643758号说明一种包含麦芽糖结合蛋白质(MBP)的系统。将一种经选殖的基因嵌入编码MBP的malE基因下游的pMAL载体内。将此载体转形至宿主细胞，然后该重组蛋白质可于宿主细胞内表达。将细胞溶离物或培养基分层载入含有亲和性基质-直链淀粉的管柱中并洗涤数次，再使用大量的麦芽糖溶离重组蛋白质。美国专利第5202247号说明一种包含纤维素_结合部位的系统。使用纤维素管柱纯化含有纤维素-结合部位的重组蛋白质。将细胞溶离物或培养基分层载入该管柱并加以洗涤。纤维素-结合部位和纤维素间的交互作用可通过中性PH下的疏水性交互作用加以驱动。一般溶离方法使用低极性溶液，例如乙二醇，之后以透析和过滤移除低级性溶剂。几丁质-结合部位和可诱导的接合连接子区可融合于标的蛋白质的C端或N端。将细胞溶离物或培养基分层载入该管柱并加以洗涤。将几丁质-结合部位结合于几丁质管柱以固定重组蛋白质。在硫醇(例如DTT或半胱胺酸)存在之下，该连接子区会进行特定的自我切割以自几丁质-结合性几丁质-结合部位释出标的蛋白质。上述这些现行的蛋白质纯化系统具有一些缺点。其纯化过程既不方便且又费力。使用于纯化的管柱昂贵。上述这些蛋白质纯化系统的限制包括不能在某些条件之下纯化重组蛋白质，例如含EDTA的样本及目前所使用的蛋白质标签与本发明所使用者相比之下，其比标的蛋白质相对较大。

发明内容
本发明提供一种具特征性解离常数(Kd)O. 5 2. 29 μ M的淀粉结合部位(starchbinding domain,SBD)。本发明亦提供一种重组蛋白质,其包含本发明的多肽和一淀粉结合部位。本发明亦提供一种表达载体,其包含一种编码本发明的淀粉结合部位的基因。本发明亦提供一种宿主细胞，其经一种用以复制及表现编码包含本发明的目标多肽及淀粉结合部位的DNA的载体转形或转染。本发明进一步提供一种自生物性液体纯化出包含本发明的多肽和淀粉结合部位的重组蛋白质的方法。本发明进一步提供一种试剂盒，其用以纯化包含用以表现重组蛋白质的表现载体的重组蛋白质。本发明进一步提供一种在含有各种碳水化合物分子的样本中分类含碳水化合物的分子的方法。本发明进一步提供一种包含淀粉结合部位的纤维，其中该纤维通过β面_β面交互作用及/或电荷-电荷交互作用所形成。本发明亦提供一种鉴别候选淀粉分解酶的淀粉结合部位的配体结合位点的方法。


图I说明使用淀粉进行SBD-6H纯化的结果。使经纯化的SBD-6H进行SDS/PAGE (15%胶体)且将该胶体以考马西蓝(Coomassie Brilliant Blue) R-250染色以进行蛋白质检测。第I道分子量标准品(分子量标于左侧)；第2道2毫克的在玉米淀粉上纯化的SBD-6H。图2说明pH对结合能力和稳定性的影响。如实验说明所述，在不同的pH下测定 SBD-6H的结合能力(·)和安定性(ο)。将在pH5中分析到的相对结合能力定为100%。 图3说明SBD-6H与不溶性淀粉的吸附速率。通过载入不同浓度的SBD_6H(15.6μΜ；Α,22.5μΜ；·,27.2μΜ)于玉米淀粉5小时来分析SBD结合速率。由起始和未结合蛋白质于不同时间点的浓度差计算出结合蛋白质，用以测定结合速率。图4说明SBD-淀粉交互作用的Kd和Bmax测定。以颗粒状玉米淀粉在不同蛋白质浓度下进行淀粉结合分析。通过适配于单一结合位点饱和结合的结合等温线的非线性回归来测定Kd和Bmax。图5显不经SBD标定的融合蛋白质的构建eGFP ;编码绿色突光蛋白质的基因；SBD :淀粉结合部位；Knf :卡那霉素(kanamycin)抗性基因。图6说明使用淀粉进行SBD标定的融合蛋白质的纯化结果。将经纯化的融合蛋白质进行SDS/PAGE(15%胶体)且将该胶体以考马西蓝R-250染色以进行蛋白质检测。第I道分子量标准品(分子量标于左侧)；第2道可溶性区分和第3道溶离物。箭头I :SBD-eGFP，箭头 II :eGFP 和箭头 III SBD.图7说明CBM20和CBM21的以结构为基础的多重序列比对的比较。(A)与毛霉(R. oryzae)(RoGACBM21)、卷枝毛霉(M. circinelloides)(McGACBM21)，A. adeninivorans(AnGACBM21)、Lipomyces kononenkoae-淀粉酶(LkACBM21)、人类蛋白质磷酸酶(HsPPCBM21)和黑曲菌(A. niger)(AnGACBM20)的SBD的以结构为基础的多重序列比对。白色、黑色和灰色片段分别代表预测的二级结构组件环、股和α-螺旋。黑色的Y、W和F分别表示环区内的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸；白色的Y、W和F代表β -股内的芳香性残基。(B)使用PSSC算法分别以标示于图上方和下方RoGACBM21和AnGACBM20的系统化序列所进行的以结构为基础的序列比对。β代表一 β股；Ν代表环区中无芳香性残基。AnGACBM20内的关键配体结合残基以双底线标明。(C)以已知结构和配体结合位点的黑曲菌(A. niger) (AnGACBM20)作为模板根据本发明的二级结构和拓朴学图谱分析法所模拟的毛霉(R. oryzae) (RoGACBM21)、卷枝毛霉(M. circinelloides) (McGACBM21)、A. adeninivorans (AnGACBM21)、Lipomyceskononenkoae -淀粉酶(Lk ACBM21)、人类蛋白质磷酸酶(HsPPCBM21)的三维结构和推定的配体结合位点。图8说明使用以结构为基础的序列比对的RoGACBM21分子模型。(A)RoGACBM21和AnGACBM20内的β -股位置，以不同深浅的灰色箭头代表，其分别标示在序列的上方和下方。AnGACBM20内的配体结合位点以底线标示(结合位点I 、结合位点II _)。RoGACBM21内的经预测涉及碳水化合物结合的芳香性残基以灰色标示。(B)RoGACBM21(左侧)的模型结构和AnGACBM20的模板结构(右侧，蛋白质数据库编号1AC0)以带状图显示。形成RoGACBM21的第一个β股中自Ala1至Ser13的多肽序列并未显示于模型中。AnGACBM20内的配体(PCD)和特征配体结合位点的侧链以及RoGACBM21的潜在结合位点亦绘于图中。(C)以对应于A和B中的不同深浅的灰色箭头显示RoGACBM21和AnGACBM20的二级结构方向性和组织的拓朴学。图9说明使用远UV⑶进行RoGACBM21 二级结构的测定。原态RoGACBM21 (实心 圆型)的CD光谱在25°C下于50mM醋酸钠(ρΗ5· 5)中进行。图10说明RoGACBM21衍生物的化学修饰和UV差异光谱。(A)无(实心方型)或有(空心方型)500μΜβ⑶的原态野生型RoGACBM21 ;无(实心圆型)或有(空心圆型)500 μ M β CD的变性野生型RoGACBM21 (实心三角型)和原态W47A以NBS加以滴定。将数据规度化以将各反应的原始吸光度调整成I. O。(B)使用以20% DMSO扰动的N-乙酰基色氨酸(50 μ Μ) (a)和N-乙酰基酪氨酸(100 μ Μ) (b)的差异光谱来比较。将以β⑶扰动的野生型重组RoGACBM21 (c)、Y32A(d)、W47A(e)、Y16A(f)和Y86A(g)的差异光谱规度化至相等的蛋白质浓度。(C)在25°C之下以超过蛋白质100倍的 Μ滴定野生型RoGACBM21(10yM，溶于 IOOmMTris-HCl，pH8. O)图11说明以SDS-PAGE分析的RoGACBM21衍生物对不溶性淀粉的定性结合。将经纯化的 RoGACBM21 的野生型和 Y16A、Y32A、W47A、Y58A、Y67A、Y83A、Y86A、Y93A 和 Y94A 突变体与不溶性淀粉共置，并离心以收集聚集物。S道代表未被结合于不溶性多糖类的蛋白质户道含有结合于不溶性多糖类的蛋白质。图12说明以耗尽等温线分析的RoGACBM21衍生物对不溶性淀粉的结合。在不同蛋白质浓度的下以不溶性玉米淀粉分析RoGACBM21衍生物的淀粉结合性。野生型的RoGACBM21 (实心方型)、Y32A(实心三角型)、W47A(实心圆型)和Y32A/W47A (空心方型)的结合等温线(左侧)和Scatchard分析(右侧)。图13说明在电子显微镜下由淀粉结合部位形成的纤维。
具体实施例方式本发明提供一种来自真菌根霉属,特别是根霉(Rhizopus oryzae)的酶葡萄糖淀粉酶的高亲和性及强结合力的淀粉结合部位(SBD)。葡萄糖淀粉酶(I，4-a -D-葡聚糖葡萄糖水解酶，EC 3.2. 1.3)是一种复单元的外作用型葡萄糖苷水解酶，其催化β-D-葡萄糖自淀粉和相关基质的非还原端释出。葡萄糖淀粉酶是一种组合蛋白质，其包含一个催化部位(⑶)和一个淀粉结合部位(SBD)，被归类为碳水化合物-结合性组件(CBMs)。这两个独立的部位以一 O-葡萄糖基连接子相连接(其详细数据可参见URLhttp ://afmb. cnrs-mrs. fr/CAZY/index, html ；Boraston 等人，Biochem. J. (2004)382 :769-781 ;Fang 等人，proteinEngineering(1998) 11 :119-126 ；Sauer 等人，Biochemistry (2001) 40 :9336-9346)。
CBMs通过将不溶性多糖类表面的催化部位浓缩来调节葡萄糖苷水解酶与基质的交互作用(Bolam等人，Biochem. J. (1998)331 :775-781)。酶对不溶性而非可溶性多糖类的活性显著降低可由葡萄糖苷水解酶的CBMs的蛋白质分解性截切和截断观察到(Charonck等人，Biochemistry(2000) 39 :5013-5021 ;Ali 等人，Biosci.Biotechnol. Biochem.(2001) 65 41-47)。与所有属于第20族CBMs的C-端SBDs不同，葡萄糖淀粉酶的N-端SBDs被分类为第21族CBM。目前已知，来自根霉(Rhizopus oryzae)、Arxula adeninivorans和卷枝毛霉(Mucor circinelloides)的萄萄糖淀粉酶具有位于N-端的第21族CBM淀粉结合部位(Houghton-Larsen 等人，Appl. Microbiol. Biotechnol. (2003)62 :210-217)。将来自上述这些菌种和黑曲菌(A.niger)SBD的氨基酸序列相比较显示毛霉(R. oryzae) SBD 和来自 A. adeninivorans、卷枝毛霉(M. circinelloides)和黑曲菌(Aspergillus niger)者的同源性分别为 35. 4%、67. 3%和 26. I %。CBM 20 和 CBM 21 族间的蛋白质序列差异暗示上述这些SBDs在生物及生化功能上有所区别。
根据本发明的SBD 的多肽可取得自 CBM20、CBM21、CBM25、CBM26、CBM34 和 CBM41，较佳为得自CBM20或CBM21，更佳为得自CBM21的葡萄糖淀粉酶的淀粉结合部位，再更佳为来自根霉属，且最佳为来自根霉(Rhizopus oryzae)。SBD的氨基酸序列可得自Simpson菌株、野生型菌株和美国专利第4863864号中的菌株，如显示于SEQ ID NO. 1、2和3者。根霉的SBD (Rhizopus oryzae)包括等位变体和衍生物，其与已知的SBD相较，具有与淀粉的高亲和性并表现极强的淀粉结合能力。在本发明中，通过PCR将编码SBD的DNA分子增幅。将PCR产物选殖至表达载体内并转形至宿主细胞内。诱导经转形的宿主细胞以表达SBD。收集细胞溶离物并将上清液直接施加至亲和性基质上，再加以洗涤并溶离。溶离缓冲液可为盐、糖及/或酸或碱。本发明的根霉属的SBD其首要特征为于广范围的pH内可维持稳定并于酸性或碱性环境的下与淀粉分离。在本发明中，首先确认根霉属内的SBD的解离常数(Kd)值较低于已知的菌种，例如黑曲菌(Aspergillus niger),且根霉属内的SBD的淀粉结合能力大幅高于已知的菌种，例如黑曲菌(Aspergillus niger)。较佳具体实施例中，根霉属内的SBD对颗粒状玉米淀粉的解离常数(Kd)值为O. 5 2. 29 μ M0更佳的具体实施例的解离常数(Kd)值为I. O
2.O μ M0进一步较佳的具体实施例的解离常数(Kd)值为I. 3 I. 6 μ Μ。最佳的具体实施例的解离常数(Kd)值为1.43μΜ。本发明的SBD在碳水化合物结合序列中的氨基酸残基32、47、67、83和93的芳香基团上具有活化位点，其中该氨基酸残基为酪氨酸或/及色氨酸。在较佳的具体实施例中，该活化位点为残基32酪氨酸、残基47色氨酸、残基83酪氨酸和残基93酪氨酸。在更佳的具体实施例中，该活化位点为残基47色氨酸和残基32酪氨酸。在本发明中，由芳香性残基所组成的活化位点系通过进行性二级结构关联性和拓朴绘图来加以确认。本发明亦提供一种重组蛋白质，其包含本发明的SBD和目标多肽。如前述般将编码目标多肽的基因选殖到SBD表现载体内。选殖位点邻近sbd基因，可在sbd基因的上游或下游。SBD连接于多肽的N端或C端。此融合基因表达载体可被转形或转染至宿主细胞内，包括细菌、酵母菌、真菌、哺乳类细胞或昆虫细胞。重组蛋白质可表达于经转形或经转染的细胞内。因此，上述这些根据本发明的重组蛋白质可通过使用淀粉作为亲和性基质，透过SBD和淀粉间的结合来加以纯化。
使用于重组蛋白质纯化的亲和性基质可为可被SBD辨识的组分。根据本发明的SBD可结合于葡萄糖-葡萄糖键结构造，α-1，4-和α-1，6_键结均可。根据此特征，亲和性基质可为含有下式的组分(X-X)nX指葡萄糖分子，葡萄糖和葡萄糖间的键结为α-I，4-键结或α-I，6-键结且η为I或大于I。在任何部分结构中(例如主链、侧链或经修饰的残基)，含有前述结构的组分均可选为亲和性基质。举例来说，淀粉、甘露糖、葡聚糖或肝糖均可为亲和性基质。本发明提供一种通过使用本发明的淀粉结合部位和一种亲和性基质的重组蛋白质纯化方法。该方法包含(a)将含有重组蛋白质的生物性液体直接加载亲和性基质；(b)以溶离缓冲液溶离重组蛋白质；和(C)将含有重组蛋白质的溶离液透析。本发明可用来提高重组蛋白质和多肽的产量、活性、安定性或溶解度。本发明具有广范围的最适PH，适于大规模的蛋白质纯化。经纯化重组蛋白质的产率高且有足够的纯度(95%以上)。本发明的优 点亦包括可选用各种溶离缓冲液和亲和性基质且可由市售取得，前者包括糖、盐或PH且后者包括淀粉、甘露糖、葡聚糖或肝糖。此外，SBD为较小于普遍使用的融合蛋白质标签，包括谷光甘肽S-转移酶(GST)、MBP、硫氧化还原蛋白(Trx)或Nus的卷标，且此系统适用以纯化特别的样品，包括含有EDTA、EGTA或DTT的样品。本发明提供一种用以纯化重组蛋白质的试剂盒以及其应用。该试剂盒包含一种可表现本发明的重组蛋白质的表达载体。该试剂盒进一步包含一种亲和性基质和一种溶离缓冲液。该亲和性基质可结合SBD以分离重组蛋白质。溶离缓冲液用以分开SBD和亲和性基质间的结合。如前述的目标多肽可为抗体、抗原、治疗性化合物、酶或蛋白质。通过本发明所提供的试剂盒，上述这些产物可被快速大量生产及快速纯化。上述这些产物的应用说明于下。目标多肽可为抗体或治疗性化合物，其可锁定并可损害/破坏或检测病原体。本发明通过使用淀粉而使抗体或治疗性化合物被简易纯化并可通过切割SBD区而进一步将其分离。经纯化的产物可用以治疗或检测病原体。目标多肽可为一种可诱发免疫反应的抗原或抗原性化合物。此种融合蛋白质可结合于亲和性基质，例如淀粉。被融合蛋白质结合的淀粉可作为食物的来源。食用该被融合蛋白质结合的淀粉时，使用者可获得接种疫苗的效果。被融合蛋白质结合的淀粉可为一种口服疫苗。本发明进一步提供一种与口腔护理组合物有关的应用。该口腔护理组合物包含本发明的SBD，其中该组合物选自由下列所组成的群组牙膏、牙科用乳膏、胶体或牙粉、牙齿、口腔刷洗前-或后-的调配物、口香糖、糖锭和糖果。该口腔护理组合物进一步包含一或多个SBD和选自由下列所组成的酶间的融合产物氧化酶、过氧化酶、蛋白酶、脂酶、葡萄糖苷酶、脂酶、酯酶、脱氨酶、尿素酶和多糖水解酶。此等口腔护理产品可消化口腔的多糖并预防龋齿的形成。本发明进一步提供一种通过使用不同碳水化合物结合部位的Kd值来挑选含碳水化合物的分子的方法。该含碳水化合物的分子可为各种糖蛋白的混合物且该碳水化合物可为单糖、双糖或多糖。举例来说，使用者可通过使用淀粉结合部位(SBDs)作为一套分离器；其可能为一管柱；以不同的Kd值来产生一系列有梯度性配体结合能力的基质来挑选糖蛋白。SBDs可得自根据本发明的根霉属，包括野生型和突变株。SBDs可得自已知可生产SBD的物种，例如CBM 21族和CBM 20族。这些已知的菌种包括Arxula属、油脂酵母属(Lipomyces)、曲霉属(Aspergillus)、杆菌属(Bacillus)、克氏梭杆菌属(Clostridium)、隐球菌属(Cryptococcus)、镰孢霉属(Fusarium)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)Jj^lS霉属(Neurospora)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、梭孢壳属(Thielavia)和嗜热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)。将样品加载分离器组合内，与SBD-结合的分子会被保留于管柱中且未结合的分子会被排出。因此，样品可被分成与SBD结合和未结合的群组。将未结合的分子收集在一容器内，并将与SBD结合的分子溶离于另一容器中，二者均可进一步加以分类。进一步分类的方法可根据化学、物理或生物特性，包括液相管柱层析分析、质谱分析、凝集素免疫感应·器技术、二维凝胶电泳、酶性技术和化学衍生法。本发明进一步提供一种包含淀粉结合部位的纤维，其单体彼此间的作用为β -面和β -面交互作用，其中该淀粉结合部位选自由下列所组成的群组根霉属(Rhizopus)、(Arxula)、油脂酵母属(Lipomyces)、曲霉属(Aspergillus)、杆菌属(Bacillus)、克氏梭杆菌属(Clostridium)、隐球菌属(Cryptococcus)、镰孢霉属(Fusarium)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、链孢霉属(Neurospora)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、梭抱壳属(Thielavia)和嗜热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)。在较佳的具体实施例中，淀粉结合部位来自根霉(Rhizopus oryzae)。在纤维的具体实施例中，该纤维为管状结构所形成。该纤维被应用于碳水化合物的分离和药物传送系统中。本发明亦提供一种确认候选淀粉分解酶的淀粉结合部位其配体结合位点的方法，其中包含(a)进行候选酶和包括已知配体结合位点的已知淀粉分解酶二者的以结构为基础的多重序列比对及芳香性残基，(b)根据进行性二级结构关联性(PSSC)算法比较已知酶和候选酶间序列比对的拓朴学，以及(C)取得已知酶的已知配体结合位点与候选酶的对应位置处其残基的关联性。要确认候选酶的所得残基的功能，本发明的方法进一步包含定点突变、化学修饰、UV差异光谱或定性及定量结合分析的测定。本文中所使用的术语「配体」选自但不限于由下列所组成的群组淀粉、环状糊精、麦芽七糖、麦芽六糖和麦芽五糖。候选酶选自由下列所组成的群组CBM20、CBM21、CBM25、CBM26、CBM34和CBM41。较佳的酶选自CBM20和CBM21。更佳的酶得自根霉属真菌。最佳的酶得自根霉(Rhizopusoryze)。候选酶不限于葡萄糖淀粉酶、α-淀粉酶、β -淀粉酶、acarviose转移酶、葡萄糖基转移酶、葡聚糖转移酶、环状糊精葡萄糖基转移酶、麦芽五糖水解酶、麦芽四糖水解酶、产麦芽糖α-淀粉酶、淀粉普鲁南糖酶、α-聚葡糖水二激酶、genethonin-l、拉服林(Iaforin)、degreenig增强蛋白质或蛋白质磷酸酶。用以预测候选酶的配体结合位点的已知酶选自CBM20、CBM25、CBM26或CBM34。已知酶的较佳具体实施例选自CBM20或CBM34。已知酶的更佳具体实施例选自黑曲菌(Aspergillus niger)。在本发明的方法中，进行性二级结构关联性(PSSC)算法包含三个步骤(I)使用已存在的预测系统取得多重二级结构以指定α-螺旋和β-股的位置和边界，(2)通过将α -螺旋和β -股以符号表示并将选定的预先规定为受限定残基的芳香性残基Y、W和F加以标示而将各个经预测的二级结构转形成一新序列图样，和(3)以解析出的三维结构作为模板，对一蛋白质序列实施进行性相关操作。特定的，将各个经预测的二级结构和已知的模板结构间的所有可能排列组合的分数加以计算。有最高值者代表其为最佳的候选排列，其中对应于彼等模板结构内的关键残基可加以确认。进行关联性操作以提供关于二级结构和被限定的芳香性残基的位置的最佳定位。在本发明的方法中，拓朴学为类免疫球蛋白拓朴学(CATH code2. 60. 40)。下列实例供作说明且不做为限制之用。实例I
(A) SBD-6H 的构建通过聚合酶链锁反应(PCR)，使用上游引物5 ’ -CATATGGCAAGTATTCCTAGCAGT-3 ’和下游引物5’ -CTCGAGTGTAGATACTTGGT-3’ (限制位点，以粗体表示，被并入两个引物内)将编码葡萄糖淀粉酶SBD残基26-131的基因增幅。将PCR产物选殖入pGEM-T Easy选殖载体(Promaga)并通过DNA定序加以确认。随后于NdeI和XhoI位点处将sbd基因片段接合至pET23a(+)表达载体(Novagen)内以产生ρΕΤ-SBD。由ρΕΤ-SBD编码的SBD-6H含有一C-端HiS6标签。将该构建载体转形至恰当的大肠杆菌(Escherichia coli) BL21_Gold (DE3)(Novagen)内以表达蛋白质。(B) SBD-6H的表达和纯化于37°C之下使经ρΕΤ-SBD转形的BL21_Gold (DE3)细胞在含有100 μ g/ml安比西林(ampicillin)的LB培养基中生长至0D_达O. 6。再将温度降至20°C，并加入异丙基β -D-硫化半乳糖苷(IPTG)至终浓度为400 μ M以诱导重组蛋白质表达。进一步培养16小时之后，在4°C之下以3，700g离心15分钟以收集细胞，将所得的聚集物再悬浮于20ml的结合缓冲液(50mM醋酸钠，pH5. 5)中并再加以均质化(EmulsiFlex_C5均质机)。在4°C之下以16，OOOg离心15分钟去除细胞碎片。将上清液直接施加于颗粒状玉米淀粉(以结合缓冲液预洗)上并再于缓和振荡之下在25°C下培养30分钟。以10倍管柱体积的结合缓冲液洗该淀粉两次并再以两倍管柱体积的溶离缓冲液(50mM甘胺酸/NaOH，pHIO)加以溶离。使用装有PM-10膜(IOkDa截切)的Amicon搅拌槽浓缩器(Millipore)使该溶液经结合缓冲液透析。以15% SDS-PAGE分析各个区分并再以考马西蓝(Coomassie Brilliant Blue)加以染色。以二辛可宁酸(BCA)试剂试剂盒(Pierce)分析蛋白质浓度。在适当的条件下，使经融合的SBD-6H表现于E.coli BL21_Gold(DE3)中。诱导期之后，通过颗粒状玉米淀粉的步骤将可溶性区分纯化。因为观察到使用先前报告的方法以麦芽糖作为溶离液的低SBD溶离效率(Paldi等人，Biochem. J. (2003)372 :905-910)，故在此选用以甘氨酸/NaOH(pHIO)作为SBD溶离的替代性步骤。以15% SDS-PAGE分析经纯化的SBD-6H并以考马西蓝加以染色，如图I所示。自该特别步骤纯化而得的SBD-6H为均一性的。上述这些经改良的方法可快速且有效自细菌溶离物中纯化SBD，其具高纯度(>98%)及产率(> 90% )。实例2
pH对结合能力和稳定性的影响。为了要测定结合能力，将SBD-6H和颗粒状玉米淀粉于各种pH值的缓冲液中置放I小时，如在淀粉结合分析中的说明。安定性的测定通过在25°C之下，将SBD-6H于不同的缓冲液，包括甘氨酸 /HCl (pH3)、醋酸钠 / 醋酸(pH4-5)、Na2HP04/NaH2P04(pH6-7)、Tris/HCl (pH8)和甘氨酸/Na0H(pH9-10)中保持30分钟。于25°C之下，在醋酸钠缓冲液(50mM，pH5. 5)中测定剩余的结合能力I小时。以在pH5之下分析到的相对结合能力为100%。在pH3至10的范围下分析SBD-6H的安定性且其指出SBD-6H在广pH范围内安定，甚至在极端酸性及碱性条件之下亦如是(图2)。结合分析用以确认SBD-6H对不溶性淀粉的吸附的最适pH范围。如图2所示，SBD-6H有最大结合的pH范围为5至6，然而在pH4和PH8处的相对结合能力仅分别为60. 6%和55. I %。如图2所示，SBD-6H在广pH范围之下安定，甚至于极端酸性及碱性条件之下亦如是。其亦指出SBD对淀粉的结合能力为pH依赖性。结合的最适pH为约5至6，类似于先前使用麦芽糖自淀粉释出SBD的研究，虽然麦芽糖并非最适合的溶离剂。在此，发明人根据 PH依赖性结合能力的特性克服此问题。使用碱性缓冲液作为溶离剂可使溶离效率提高(>90% )。实例3SBD-6H对不溶性淀粉的结合速率将经纯化的SBD-6H以15. 6至27. 2M的浓度范围加至lmg/ml的经预洗颗粒状玉米淀粉中并于25°C在缓和搅拌之下培养5小时。通过将淀粉在不同时间间隔下沉降以终止其结合。在4°C之下以16，OOOg离心10分之后，通过BCA分析测定上清液(未被结合蛋白质)的蛋白质浓度并从起始和未被结合蛋白质浓度的差计算出被结合蛋白质的量。在经分析的蛋白质浓度范围内，平衡时的被结合蛋白质，以每克淀粉所含的蛋白质微摩尔为单位表示，为游离(未被结合)蛋白质的线性函数。在不同的蛋白质浓度下分析SBD-6H对颗粒状玉米淀粉的吸附动力学，如图3所示。在起先的10分钟期间，约有50%的SBD-6H结合至不溶性淀粉(相对于平衡状态下的被结合蛋白质量)。在初始期间(至40分钟)，该吸附显现出线性期。被结合蛋白质的量正比于培养时间。由不同SBD-6H浓度下的结合曲线的初始斜率亦观察到类似的结合速率(O. 18±0. I μ mol/min · g)。在线性期之后(40分钟之后)，被结合蛋白质在延长的培养时间内缓步增加。在120分钟时，达到95%以上的相对结合。达到平衡所需的时间近似于黑霉菌属 SBDs (Paldi 等人，Biochem. J. (2003)372 :905-910)。实例4淀粉结合分析以饱和结合分析法来分析淀粉结合等温线将SBD-6H与lmg/ml经预洗的颗粒状玉米淀粉混合并于25°C缓和搅拌培养16小时。在4°C之下以16，OOOg离心10分钟之后，计算被结合蛋白质的量。将有蛋白质但无淀粉的对照组加以培养以确认在分析期间无沉淀产生。通过与结合等温线的非线性回归进行适配化以测得解离常数(Kd)和被结合蛋白质的最大量(Bmax),并将方程式⑴使用于单一结合位点饱和结合。
_] B = BfflaxF/(Kd+F)(I)其中Β(μπιο )代表被结合蛋白质；Β_(μπιο1)为被结合蛋白质的最大量；F(umol)为系统中的游离蛋白质且Kd(Umol)为平衡解离常数。将计算得到的Bmax和Kd值的单位分别转换成μπιο /g和μΜ。SBD-结合亲和性和能力使用如图4所示的淀粉结合等温线以研究经纯化SBD-6H的结合亲和性和能力。使用方程式(I)计算平衡等温线的非线性回归曲线并测定结合参数(Bmax和Kd)。由用于单一结合位点饱和结合的两参数模型测得的结合参数Kd和Bmax分别为1.43±0. 14μΜ和
41.14±1.05μπιΟ1/^。此外，经设计并以蛋白质分解产生的黑霉菌属SBDs的解离常数(分别为 3. 2 ±O. 9 μ M 和 12. 7 ±O. 5 μ Μ)约为 SBD-6H 的 2-10 倍高(Paldi 等人，Biochem.J. (2003)372 :905-910 ;Belshaw 等人，FEBS Lett. (1990)269 :350-353)。这些观测指出SBD-6H对不溶性淀粉的亲和性较黑霉菌属SBD为佳。另一方面，经设计并以蛋白质分解产生的黑霉菌属SBDs的Bmax值(分别为O. 56μπι01/^和I. 08±0· 02 μ mol/g)显著不同于SBD-6H。SBD-6H的Kd约为黑霉菌属SBDs的二分之一，然而SBD-6H的Bmax确显著为黑霉菌 属SBDs的70倍高。这些结果指出SBD-6H的淀粉结合亲和性和能力均大于黑霉菌属SBDs。实例5(A) SBD-eGFP 的构建将eGFP基因片段在NcoI和XhoI位点处接合至ρΕΤ-SBD内以产生pSBD_eGFP。该质体构建体系如图5所示。由pSBD-eGFP编码的SBD-eGFP包含N-端SBD-6H和C-端eGFP。将该构建载体转形至适当的大肠杆菌BL21-Gold(DE3) (Novagen)内以表达蛋白质。(B) SBD-eGFP的表达和纯化在37°C之下使经ρΕΤ-SBD转形的BL21_Gold (DE3)细胞在含有100 μ g/ml氨苄青霉素(ampicillin)的LB培养基中生长至0D_达O. 6。再将温度降至20°C，并加入异丙基β -D-硫化半乳糖苷(IPTG)至终浓度为400 μ M以诱导重组蛋白质表达。进一步培养16小时之后，在4°C之下以3，700g离心15分钟以收集细胞，将所得的聚集物再悬浮于20ml的结合缓冲液(50mM醋酸钠，pH5. 5)中并再加以均质(EmulsiFlex_C5均质机)。在4°C之下以16，OOOg离心15分钟去除细胞碎片。将上清液直接施加于颗粒状玉米淀粉(以结合缓冲液预洗)上并再在缓和振荡之下在25°C培养30分钟。以10倍管柱体积的结合缓冲液洗该淀粉两次并再以两倍管柱体积的溶离缓冲液(50mM甘氨酸/Na0H，pH10)加以溶离。使用装有PM-10 (IOkDa截切)膜的Amicon搅拌槽浓缩器(Millipore)使该溶液经结合缓冲液透析。以15% SDS-PAGE分析各个区分并再以考马西蓝(Coomassie Brilliant Blue)加以染色。以二辛可宁酸(BCA)试剂试剂盒(Pierce)分析蛋白质浓度。经纯化的SBD-eGFP以15% SDS-PAGE加以分析并以考马西蓝加以染色，如图6所
/Jn ο实例6(A)以结构为基础的多重序列比对在Jpred 服务器上进行二级结构预测(URL, http://www. compbio. dundee.ac. uk/ www-jpred/Cuff, J. A.，Clamp, M. E.，Siddiqui，A. S.，Finlay, M.和 Barton，G. J. (1998) JPred :—个一致性二级结构预测服务器，Bioinformatics 14,892-893)和Network 蛋白质序列分析(NPSA)服务器(URL, http://npsa-pbil. ibcp. fr/Combet, C.，Blanchet，C.，Geourjon, C.和 Deleage，G. (2000)NPS@ network protein sequenceanalysis。Trends Biochem. Sci. 25，147-150)。将二级结构预测的结果以 ClustalX 程序(Thompson, J. D.，Gibson, T. J.，Plewniak, F.，Jeanmougin, F.和 Higgins, D. G. (1997)The CLUSTAL_X windows interface flexible strategies for multiple sequencealignment aided by quality analysis tools.Nucleic Acids Res. 25,4876-4882)针对二级结构廓型比对的观点进行来自根霉(R. oryzae)、A. adeninivorans、卷枝毛霉(M. circinelloides)和黑曲菌(A. niger)的四种GA的淀粉结合部位的多重序列比对。(B)进行性二级结构关联性算法在此研究中，发明人研究了一种PSSC算法，其依据预测的二级结构和来自相关的蛋白质家族序列的重要功能性残基的结合数据。PSSC包含三个主要步骤(I)使用现有的预测系统分配α-螺旋和β-股的位置及边界来取得多重二级结构，(2)将各个经预测的 二级结构转形至新序列图像中，以符号表示α -螺旋和β -股并将经选定的芳香性残基Y、W和F加以标示，预先定义其为经限定的残基，以及(3)以经解析的三维结构作为模板对蛋白质序列实施进行性相关操作。在所有预测出的二级结构间，分数最高者代表最佳的候选物，对应于那些模板结构以鉴别其中的关键残基。各个经批注的α-螺旋和β-股分别简化成符号「α」和「β」，且环结构经特定的限定残基取代，或当无芳香性残基可分配时，则以符号「N」取代。在最后的步骤中，实施关联操作以提供有关该二级结构和受限定芳香性残基的位置的最佳比对。可给予不同权重的吻合分数以提高二级结构的相关性。对任何吻合的符号「α」和「β」给予2分，而一个吻合的「Y」、「W」、「F」和「N」则给I分，且一个误配则给-I分。选用有最高分数的预测二级结构通过进一步的关联性比对来鉴别关键残基(C)模型建构RoGACBM21的分子模型系通过蛋白质建模服务器Swiss Model (Schwede,Τ. , Kopp, J. , Guex, N.和 Peitsch, Μ. C. (2003)SWISS-MODEL Αη automated proteinhomology-modeling server. Nucleic Acids Res. 31, 3381-3385)使用 AnGACBM20 的 NMR结构(PDB code 1AC0 (Sorimachi,K.,等人，(1996) Solution structure of the granularstarch binding domain of glucoamylase from Aspergillus niger by nuclearmagnetic resonance spectroscopy. J. Mol. Biol. 259,970-987))作为模板而产生。根据经改良的序列比对，将残基1-13自RoGACBM21模型结构删除，因在AnGACBM20内并无相对应的残基。以De印View的GR0M0S96进行该模型的能量最小化。使用WebLab ViewerLite完成分子图像。(D)圆形偏极光光谱将圆形偏极光(⑶)光谱记录于配备450-W氙电弧灯的Aviv圆二色谱光谱仪(model 202)上。在25和96°C之下，在路径长度为0. I公分的矩型石英测光管中，以4nmsec—1的扫描速度和0. 5nm的带宽完成200至260nm的远UV光谱。各个光谱均为三次连续扫描的平均且通过扣除缓冲液光谱来加以校正。(E)RoGACBM2I 模型的构建有六个CBM 家族CBM20、CBM21、CBM25、CBM26、CBM34 和 CBM41 含有 SBDs，但现今仅有CBM20、CBM25、CBM26和CBM34被阐明。因为上述这些三维结构共享类免疫球蛋白拓朴学(CATH code2. 60. 40) (Pearl, F.等人，(2005)The CATH Domain structure Databaseand related resources Gene3D and DHS provide comprehensive Domain familyinformation for genome analysis. Nucleic Acids Res. 33, D247-251),故提出所有GA 的SBDs均具有类似三维结构的假设，虽然其不具有高度的序列同一性。因CBM21序列与先前解析出的CBM20结构并无高同一性，因此使用一种新颖的以结构为基础的多重序列比对策略以比较具有类似拓朴学但序列不相似的蛋白质。使用于本研究的CBM21 SBD的二级结构先以合适的二级结构预测服务器-Jpred和NPSA加以预测。上述这些服务器使用一些二级结构预测方法构建一致性的结果。除了 AaGACBM21以外的所有CBM21 SBDs的二级结构均具有出8条β -股，与CBM20的结构性特征一致，然而AaGACBM21中的第七条β -股被一个α -螺旋取代。图7Α呈现CBM家族20和21的以结构为基础的多重序列比对的结果。虽然保留于CBM21成员中的芳香性残基Tyr16、Tyr33, Trp47和Tyr86位于AnGACBM20的关键配体-结合残基Tyr527、Trp543、Tyr556和Trp59°的邻近处,但大部分的芳香性残基和二级结构性组件并未见有相对应关系。在尝试鉴别RoGACBM21内其它可能的配体-结合残基时，使用PSSC算法进行以结构为基础的多重序列比对。可假定上述这些强烈的相关结果不仅可得自相关的α-螺旋和β-股结构，亦可得自在环区上参与配体结合以维持与模板类似的功能性的关键残基。如图7Β所示，以相对位置和长度来看二级结构 性组件相当吻合，且RoGACBM21中的八个芳香性残基与AnGACBM20中的相对应残基均被保
&3甶O进一步通过以结构为基础的序列比对将可能涉及配体结合的芳香性残基加以调查(图8A)，其结果由PSSC和ClustalX结合而产生。结果显示RoGACBM21内的数个可能的配体结合残基(Tyr32、Trp47、Tyr58、Tyr67、Tyr83、Tyr93 和 Tyr94)。RoGACBM21 (图 8B 左侧)的分子模型系于与AnGACBM20比对时，从残基段14-106所产生。该重叠骨架原子(356个原子)的标准差为1.38 A，表示该模型与模板结构极为适配。由具有两个配体结合位点的AnGACBM20结构(图8B右侧)判断，发明人假设RoGACBM21内的配体结合残基亦可分类为两种位点，称之为第I位点(Tyr32、Tyr58和Tyr67)和第II位点(Trp47、Tyr83、Tyr93和Tyr94)，且Tyr58和Tyr94位于面向RoGACBM21结构内部的侧链上并且不涉及配体结合。RoGACBM21模型包括一个三股β _面和一个五股β _面(图8C左侧)。这两个面由反向平行的股所组成，其拓朴学组织为(I丨2丨5丨)和(4 t 3丨6丨7丨8丨)。RoGACBM21的β -股2-8可被重叠于AnGACBM20的β -股1-7上(图8C右侧)，且RoGACBM21的第一股可被重叠在AnGACBM20的第八股上，虽然其为反方向。(F)仅含β -股的二级结构原态RoGACBM21的⑶光谱(图9)在215nm处有一波谷，其为仅含β -股的蛋白质的特征，意味RoGACBM21不含螺旋结构且β _股和随机的圈状结构显著影响整体的构象。此观察结果与二级结构预测结果及常见仅含β_股结构的淀粉结合CBMs相一致。该光谱亦含有一个接近230nm的波峰，一个已在一些碳水化合物-结合部位内被观察到的不寻常特性，该部位内的双硫键和苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的芳香性侧链可能使光谱的波峰有正捕圆率(Roberge, M. , Lewis, R. N. , Shareck, F. , Morosoli, R. , Kluepfel, D.,Dupont, C.和 McElhaney, R. N. (2003)Differential scanning calorimetric, circulardichroism， and Fourier transform infrared spectroscopic characterization ofthe thermal unfolding of xylanase A from Streptomyces lividans. Proteins 50，341-354)。RoGACBM21含有十八个芳香性残基且无半胱胺酸(图8A)，意味着接近230nm处波峰的正椭圆率可能为芳香性残基造成的结果。实例7(A)定点突变RoGACBM21的所有突变体使用以PCR为基础的QuikChange定点突变法(Stratagene)以pET_RoGACBM21作为模板、两种含有所欲突变的互补性引子和Pfu TurboDNA聚合酶(Stratagene)加以生成。确认各个突变体质体的序列以确定并无产生其它任何PCR诱发性突变。将所有构建载体转形入适当的E. coli BL21-Gold(DE3)以表现蛋白质。(B)野生型和突变RoGACBM21的UV差异光谱所有光谱使用带宽为O. 5nm的UV/可见光分光光度计(Hitachi U-3310)于270
至300nm处取得。在25°C，有或无500 μ M β -环状糊精(β⑶)(Sigma)之下，在50mM醋酸钠，pH5. 5中记录30 μ M野生型或突变RoGACBM21的光谱。将通过从蛋白质-配体光谱减去仅有蛋白质的光谱而计算得到的各个差异光谱与以20% DMSO扰动的模型化合物N-乙酰基色氨酸(50 μ Μ) (Sigma)和N-乙酰基酪氨酸(100 μ Μ) (Sigma)相比较。(C)使用N-溴化琥珀酰亚胺(NBS)进行色氨酸残基的化学修饰色氨酸残基氧化的实施通过在25°C之下，原态野生型于500 μ M β⑶或变性剂(8Μ尿素)存在之下，在路径长度为I公分的矩形石英测光管中以NBS(lmM，freshlyprepared) (Sigma)滴定原态野生型和W47A RoGACBM21蛋白质(30 μ M，溶于50mM醋酸钠，PH5. 5)。在各个滴定点，将混合物置放3分钟并使用UV/可见光分光光度计记录280nm处的吸光度。持续滴定步骤至280nm吸光度的下降趋势停滞或开始上升为止。使用吸光度法计算被 NBS 氧化的色氨酸残基数目(Spande, T. F.和 Witkop, B. (1967) Determination ofthe tryptophan content of proteins with N-bromosuccinimide. Methods EnzymoI. 11,498-506)。(D)使用四硝基甲烷(TNM)将酪氨酸残基进行化学修饰酪氨酸残基硝化的实施使用TNM,如Sokolovsky等人(Tetranitromethane. Areagent for the nitration of tyrosyl residues in proteins. 1966,Biochemistry 5,3582-3589)的说明。在 25°C之下将 RoGACBM21 (10 μ M，溶于 lOOmMTris-HCl，ρΗ8· 0)加入TW(lmM，溶于95%乙醇)中180分钟，使用UV/可见光分光光度计监测428nm处的吸光值。使用3-硝基酪氨酸的分子消光数值为4，IOOM-1CnT1计算被 Μ氧化的酪氨酸残基数目。(E)两个色氨酸残基在RoGACBM21中的不同角色使用NBS进一步评估暴露于RoGACBM21表面的色氨酸残基数目，以NBS对RoGACBM21的色氨酸残基进行的修饰通过记录280nm处吸光度的下降来加以监测(图10A)。原态RoGACBM21的A28tl在NBS :蛋白质比值为2. 5时开始上升。上述这些NBS-诱发性的280nm处吸光度上升为酪氨酸残基氧化之后可观察到的典型现象(Bray, M. R. , Carriere,A.D.和 Clarke, A. J. (1994)Quantitation of tryptophan and tyrosine residues inproteins by fourth-derivative spectroscopy.Anal. Biochem. 221,278-284)。然而，并未观察到变性RoGACBM21的A28tl升高，因为在尿素溶液中并无酪氨酸残基可被NBS修饰(Sokolovsky等人，(1966))。如图10A所示，在原态和变性RoGACBM21内的色氨酸残基数目经计算分别为I. 6和2. O。RoGACBM21内仅有的两个色氨酸残基可在原态和变性条件之下被修饰，此指Trp47和Trp7° 二者可能暴露于蛋白质的表面。要测定两个Trp残基是否位于配体结合位点内，故在配体β⑶存在之下进行NBS氧化。原态RoGACBM21与β⑶的预共置能明显避免一个Trp残基进行氧化(图10Α)，此提示仅有一个色氨酸残基涉及β CD结合。为了进一步探知哪一个色氨酸残基位于配体结合位点内，将Trp47和Trp 个别突变成丙氨酸。可自E. coli表现W47A突变体并加以纯化；然而，W70A突变体在所有测试的表现条件之下的溶解度均极低，此提示Trp 对于RoGACBM21的正确折迭极为重要。使原态W47A突变体接受NBS处理，其结果与在β⑶存在下测试的野生型RoGACBM21 —致(图IOA)，此强烈表示Trp47乃为一个配体结合关键残基。此结果亦经野生型和突变RoGACBM21的UV差异光谱加以确认(图10Β)，其以500 μ M β⑶扰动并再与以20 % DMSO扰动的模型化合物N-乙酰基色氨酸和N-乙酰基酪氨酸比较。野生型RoGACBM21的光谱(图IOB c列)有三个接近277、285和293nm的波峰，类似色氨酸和酪氨酸扰动光谱(图IOB a和b列)，此代表RoGACBM21中被扰动的色氨酸和酪氨酸残基存在于配体结合位点内。将W47A差异光谱(图IOB e列)减弱并使之实际相同于扫描基线，显示Trp47残基系涉及可溶性配体结合。上述这些数据提示Trp47在结合至可溶性配体上扮演重要的角色且Trp 为维持结构所·必需者。(F)配体结合的关键酪氨酸残基的鉴别以 !将RoGACBM21中的酪氨酸残基加以硝化并以经硝化酪氨酸(3_硝基酪氨酸)的分子消光系数计算暴露于表面的酪氨酸残基数目(图10C)。总共十二个酪氨酸残基中有六个以上被 M硝化，此意味至少有50 %的酪氨酸暴露于表面并因此可能产生潜在的配体结合位点。要进一步调查位于RoGACBM21内的重要酪氨酸残基，故以丙氨酸个别将的取代。进行定性结合分析以探测野生型RoGACBM21、色氨酸突变体(W47A)和酪氨酸突变体(Y32A、Y58A、Y67A、Y83A、Y93A和Y94A)中的潜在配体结合残基的数目。如图11所示，于Tyr32、Trp47, Tyr67, Tyr83和Tyr93处以丙氨酸取代会显著降低对不溶性淀粉的结合；如预期者，突变体Y58A和Y94A并未观察到变化。上述结果证实发明人简单根据RoGACBM21的三维模型的假设。不过，Y67A、Y83A和Y93A的溶解度远低于其它突变体，此表示Tyr67、Tyr83和Tyr93亦对安定RoGACBM21的结构有重要性。据此并未获得涉及上述这些残基的可溶性双突变体蛋白质。因此随后的研究着重于Tyr32和Trp47。突变体Y32A(图IOB d列)和野生型RoGACBM21的UV差异光谱并无显著不同，此表示结合位点I并未涉及PCD结合。应注意从直接序列比对加以推断，推定的结合残基Tyr16和Tyr86并未涉及可溶性(图IOB f和g列)或不溶性配体(图11)的结合。实例8(A)对不溶性淀粉结合的定性测定将溶于50mM醋酸钠，pH5. 5的野生型和突变RoGACBM21 (16 μ M，100 μ I)各与O. Img的不溶性淀粉(Sigma)混合，并将该混合物在25°C之下缓和搅拌放置5小时，之后在4°C之下以13，OOOg离心2分钟将不溶性淀粉聚集。通过SDS-PAGE使用15%胶体分析聚集物(被结合区分)和上清液(未被结合区分)。要确认分析期间并无沉淀发生，故以无不溶性淀粉的蛋白质作为对照组。
(B)对不溶性淀粉的结合的定量测定以饱和结合法来分析淀粉结合等温线。将野生型和突变型RoGACBM21 (100 μ 1，溶于50mM醋酸钠，pH5. 5)各与O. Img的经预洗不溶性淀粉混合并在25°C下缓和搅拌共置16小时。在4°C之下以16，OOOg离心10分钟之后，使用BCA分析测定上清液(未被结合蛋白质)的蛋白质浓度，并从起始和未被结合蛋白质浓度间的差计算被结合蛋白质的量。使用标准的单点结合模型通过与结合等温线的非线性回归适配来测定解离常数(Kd)和被结合蛋白质的最大量(Bmax)。(C)对可溶性多糖类的结合的定量测定通过测定蛋白质内部荧光强度的改变记录野生型和突变RoGACBM21结合于多糖类(Sigma)的荧光光谱。在25°C之下，使用Perkin-Elmer LS-55分光光度计在50mM醋酸钠、pH5. 5中进行实验。将环状和直链状碳水化合物(2-20mM)滴定至RoGACBM21 (10 μ Μ, 2ml)中，并以在280nm处的固定激光监测350nm处的荧光放射光谱。将荧光强度的相对变化对配体浓度作图，并使用适用于单一结合位点的方程式将数据适配于仿真曲线。(D)数据分析使用GraphPad Pr ism (GraphPad软件)进行动力学和亲和性参数的数据分析。(E)具有不同配体专一性的两个结合位点将经纯化RoGACBM21的平衡淀粉结合等温线适配于非线性回归曲线(图12)。以单一位点饱和结合的两参数模型测得的RoGACBM21的结合参数Kd和Bmax分别为I. 43±0· 14 μ M和 41. 14±1· 05 μ Mol g-1 (表 I)。然而，经工程的 AnGACBM20 (3· 2±0· 9μΜ)和经蛋白质分解所产生的AnGACBM20(12. 7±0. 5μΜ) (Paldi，Τ.，等人，(2003)Glucoamylase starch-binding domain of Aspergillus niger BI molecular cloningand functional characterization. Biochem. J. 372,905-910 and Belshaw, N. J 等人，(1990)Production and purification of a granular-starch-binding domain ofglucoamylase I from Aspergillus niger. FEBS Lett. 269,350-353)的解离常数分别约为2及10倍高。此外，经工程的AnGACBM20(0. 56μΜο1/^)和经蛋白质分解所产生的AnGACBM20(l. 08±0. 02μΜο1 g_1)的 Bniax 值分别较 RoGACBM21 低 70 和 40 倍。然而仍应注意配体结合容量可受不同的支链淀粉和直链淀粉比例、淀粉颗粒的大小和形状或淀粉在缓冲液内停留多久所造成的膨胀度所影响。表I.通过耗尽等温线测得的RoGACBM21衍生物对不溶性淀粉的亲和性
I
_蛋白质_&(μΜ)_gmax$mol/g)
WT 1·4±0·1 41·1±1·1Υ32Α 0.8±0.1 23.4±0.7W47A 4·4±0·6 23.0±1.3Y32A/W47A_25.0+2.9_5.1+0.3
定量性结合等温线和Scatchard分析(图12和表I)显示两种突变体对不溶性淀粉的结合容量相对于野生型均降低约50%。Y32A和W47A突变体的结合亲和性与野生型类似，且Y32A/W47A双突变体对不溶性淀粉的结合几乎完全丧失。对可溶性配体的定量性结合的数据呈现于表II。就环状碳水化合物而言，野生型RoGACBM21对β⑶的亲和性(Kd=5. I ±0.7 μ Μ)稍强于对YCD(Kd = 8. 3±1. 5μΜ)，而对α CD的结合则相对较低(Kd >300 μ Μ)。就直链状碳水化合物而言，野生型ROGACBM21的Kd值随着配体长度的增加而降低。上述这些结果表示结合位点内的芳香性侧链间的距离和方位为配体结合于RoGACBM21的主要决定因素。因此，对环状碳水化合物的结合取决于配体表面的弧度，而对直链状碳水化合物的结合则取决于配体长度。对于具有α-1，6-葡萄糖苷键的配体，RoGACBM21对异麦芽三糖的亲和性(Kd = 3.8±0.7yM)较强于具有α-1，4-葡萄糖苷键的可溶性配体，此表示RoGACBM21较易结合于淀粉的支链。W47A突变体对使用于此研究中的可溶性碳水化合物的亲和性均太低以致于无法以荧光滴定光谱测定或实质上受到丙氨酸取代的影响。此结果指出Trp47确实为涉及可溶性及不溶性配体结合的主要残基。Υ32Α突变体和野生型RoGACBM21对各种环状糊精显现 类似的亲和性，此确认Tyr32并未涉及与环状糊精的结合。此外，直链状寡糖类的长度对与Υ32Α的结合的影响与野生型RoGACBM21相较之下较不明显，此表示结合位点I可促进RoGACBM21对较长的直链状寡糖类的结合。表II.通过荧光滴定光谱测定RoGACBM21衍生物对可溶性寡糖类的亲和性
权利要求
1.一种淀粉结合部位，其特征在于包含O. 5 2. 29 μ M的解离常数的特性。
2.根据权利要求I所述的淀粉结合部位，其特征在于该解离常数为1.43μΜ。
3.根据权利要求I所述的淀粉结合部位，其特征在于该解离常数由与颗粒状玉米淀粉的结合所得。
4.根据权利要求I所述的淀粉结合部位，其特征在于具有显示于SEQIDNO. 1_3的氨基酸序列，SEQ ID NO. I ASIPSSASVQ LDSYNYDGST FSGKIYVKNIAYSKKVTVVY ADGSDNffNNNGNIIAASFSG PlSGSNYEYffTFSASVKGIK EFYIKYEVSG KTYYDNNNSA NYQVSTS ；SEQ ID NO. 2 ASIPSSASVQ LDSYNYDGST FSGKIYVKNIAYSKKVTVIY ADGSDNffNNNGNTIAASYSA PlSGSNYEYffTFSASINGIK EFYIKYEVSG KTYYDNNNSA NYQVSTS ;或SEQ ID NO. 3 ASIPSSASVQ LDSYNYDGST FSGKIYVKNIAYSKKVTVIY ANGSDNffNNNGNTIAASYSA PlSGSNYEYffTFSASINGIK EFYIKYEVSG KTYYDNNNSA NYQVSTS ； SEQ ID NO. 1、2或3的等位变体和衍生物，其具有淀粉结合能力者，亦包含于此权利要求中。
5.根据权利要求I所述的淀粉结合部位，其特征在于其可取自CBM20、CBM21、CBM25、CBM26、CBM34 和 CBM41。
6.根据权利要求5所述的淀粉结合部位，其特征在于其可取自CBM20或CBM21。
7.根据权利要求6所述的淀粉结合部位，其特征在于其可取自CBM21葡萄糖淀粉酶的淀粉结合部位取得。
8.根据权利要求7所述的淀粉结合部位，其特征在于其可取自根霉属。
9.根据权利要求6所述的淀粉结合部位，其特征在于其在氨基酸序列的残基32、47、67,83和93的芳香性基团上有用于碳水化合物结合的活性位点。
10.根据权利要求9所述的淀粉结合部位，其特征在于该氨基酸残基为酪氨酸或/及色氨酸。
11.根据权利要求9所述的淀粉结合部位，其特征在于该活性位点为残基32酪氨酸、残基47色氨酸、残基83酪氨酸和残基93酪氨酸。
12.根据权利要求11所述的淀粉结合部位，其特征在于该活性位点为残基47色氨酸和残基32酪氨酸。
13.根据权利要求9所述的淀粉结合部位，其特征在于该由芳香性残基所组成的活性位点通过进行性二级结构相关性分析和拓朴学图谱分析加以确认。
14.一种包含权利要求I所述的多肽和淀粉结合部位的重组蛋白质。
15.根据权利要求14所述的重组蛋白质，其特征在于该淀粉结合部位连接于多肽的N端或C端。
16.—种表达载体,其特征在于包含一个编码权利要求6所述的淀粉结合部位的基因。
17.根据权利要求16所述的表达载体，其特征在于进一步包含一个编码多肽的基因。
18.根据权利要求16所述的表达载体，其特征在于该淀粉结合部位和多肽来自权利要求14所述的重组蛋白质。
19.一种宿主细胞，其经权利要求16所述的表达载体所转形或转染。
20.根据权利要求19所述的宿主细胞，其特征在于该宿主细胞为细菌、酵母菌、真菌、哺乳类细胞或昆虫细胞。
21.一种用以纯化权利要求14所述的重组蛋白质的方法，其特征在于包含 (a)将含有重组蛋白质的生物液体直接施加于亲和性基质； (b)以溶离缓冲液溶离重组蛋白质；和 (C)将含有重组蛋白质的溶离液透析。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于该亲和性基质在其任意部分结构，包含主链、侧链或经修饰残基的内包含下式(X-X)n X指葡萄糖分子，葡萄糖和葡萄糖间的键结为α-1，4_键结或α-I，6-键结且η为I或大于I。
23.一种用以纯化重组蛋白质的试剂盒，其包含权利要求16所述的表达载体。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，其特征在于进一步包含亲和性基质以结合至淀粉结合部位。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其特征在于进一步包含一种用以分离重组蛋白质和亲和性基质的溶离缓冲液。
26.根据权利要求23所述的试剂盒，其特征在于该重组蛋白质为一种抗体、抗原、治疗性化合物或酶。
27.根据权利要求24所述的试剂盒，其特征在于该亲和性基质选自由下列所组成的群组甘露糖、淀粉、葡聚糖、聚葡萄糖和含葡萄糖-葡萄糖键结结构之的分子。
28.根据权利要求25所述的试剂盒，其特征在于该溶离缓冲液选自由酸、碱、盐和糖所组成的群组。
29.根据权利要求26所述的试剂盒，其特征在于该重组蛋白质用作病原体的破坏/检测、疫苗或口腔护理组合物。
30.根据权利要求29所述的试剂盒，其特征在于该口腔照护组合物选自由下列所组成的群组牙膏、牙科用乳膏、胶体或牙粉、牙齿、口腔刷洗前-或后-的调配物、口香糖、糖锭和糖果。
31.根据权利要求30所述的试剂盒，其特征在于该口腔护理组合物进一步包含一或多个淀粉结合部位和选自由下列所组成的群组酶间的融合产物氧化酶、过氧化酶、蛋白酶、脂酶、葡萄糖苷酶、酯酶、脱氨酶、尿素酶和多糖水解酶。
32.—种在含有各种碳水化合物分子的样品中挑选含碳水化合物的分子的方法，其特征在于包含 (a)制备一套有不同解离常数值的碳水化合物结合部位的分离器； (b)将样品载至该套分离器上；以及 (c)根据不同的解离常数值将分子分类成被结合与未被结合组。
33.根据权利要求32所述的方法，其特征在于该碳水化合物选自由单糖、双糖和多糖所组成的群组。
34.根据权利要求33所述的方法，其特征在于该碳水化合物为糖蛋白。
35.根据权利要求32所述的方法，其特征在于该分离器为对淀粉具有梯度性解离常数值的管柱。
36.根据权利要求32所述的方法，其特征在于该挑选步骤包括将分子溶离并将未被结合和被结合的分子收集在不同的容器中。
37.根据权利要求36所述的方法，其特征在于被溶离的分子可根据物理或化学性质予以分离。
38.根据权利要求37所述的方法，其特征在于该特性选自由下列所组成的群组液相层析分析、质谱分析、凝集素免疫感应器技术、二维凝胶电泳、酶性技术和化学衍生法。
39.根据权利要求36所述的方法，其特征在于该分子包括目标分子。
40.根据权利要求39所述的方法，其特征在于该目标分子为糖蛋白。
41.根据权利要求32所述的方法，其特征在于该碳水化合物结合部位为淀粉结合部位。
42.根据权利要求41所述的方法，其特征在于该淀粉结合部位自下列所组成的群组取得根霉属、油脂酵母属、曲霉属、杆菌属、克氏梭杆菌属、隐球菌属、镰孢霉属、土芽孢杆菌属、链孢霉属、假单胞菌属、链霉菌属、梭孢壳属和嗜热厌氧杆菌属。
43.根据权利要求42所述的方法，其特征在于该根霉菌为根霉或其突变体。
44.一种包含淀粉结合部位的纤维，其特征在于该纤维由β面_β面交互作用及/或电荷-电荷交互作用所生成。
45.根据权利要求44所述的纤维，其特征在于该淀粉结合部位选自由下列所组成的群组根霉属、油脂酵母属、曲霉属、杆囷属、克氏梭杆囷属、隐球囷属、键抱霉属、土牙抱杆囷属、链孢霉属、假单胞菌属、链霉菌属、梭孢壳属和嗜热厌氧杆菌属。
46.根据权利要求45所述的纤维，其特征在于该淀粉结合部位来自根霉。
47.根据权利要求44所述的纤维，其特征在于呈管状结构。
48.根据权利要求44所述的纤维，其特征在于被应用于分离碳水化合物。
49.根据权利要求44所述的纤维，其特征在于被应用于药物传送系统。
50.一种鉴别候选淀粉分解酶的淀粉结合部位的配体结合位点的方法，其特征在于包含(a)制造以结构为基础的多重序列比对及候选酶和一包括已知配体结合位点的已知淀粉分解酶二者的芳香族氨基酸残基，(b)根据进行性二级结构关联性算法比较已知酶和候选酶间的序列比对的拓朴学，以及(C)取得已知酶的已知配体结合位点与候选酶的相对应位置处的残基的关联性。
51.根据权利要求50所述的方法，其特征在于进一步包含通过定点突变、化学修饰、UV差异光谱或定性及定量性结合分析的测定来鉴别残基。
52.根据权利要求50所述的方法，其特征在于该配体选自由下列所组成的群组淀粉、环状糊精、麦芽七糖、麦芽六糖和麦芽五糖。
53.根据权利要求50所述的方法，其特征在于该候选酶选自由下列所组成的群组CBM20、CBM21、CBM25、CBM26、CBM34 和 CBM41。
54.根据权利要求50所述的方法，其特征在于该候选酶取自根霉属真菌。
55.根据权利要求54所述的方法，其特征在于该候选酶为葡萄糖淀粉酶、α-淀粉酶、β -淀粉酶、acarviose转移酶、葡萄糖基转移酶、葡聚糖转移酶、环状糊精葡萄糖基转移酶、麦芽五糖水解酶、麦芽四糖水解酶、产麦芽糖α-淀粉酶、淀粉普鲁南糖酶、α-聚葡糖水二激酶、genethonin-Ι、拉服林、degreenig增强蛋白质或蛋白质磷酸酶。
56.根据权利要求50所述的方法，其特征在于该已知酶选自CBM20、CBM25、CBM26或CBM34。
57.根据权利要求56所述的方法，其特征在于该已知酶选自CBM20或CBM34。
58.根据权利要求50所述的方法，其特征在于该已知酶选自黑曲菌。
59.根据权利要求50所述的方法，其特征在于该进行性二级结构相关性算法包含三个步骤(1)使用已存在的预测系统取得多重二级结构以指定α-螺旋和β_股的位置和边界，(2)通过将α-螺旋和β_股以符号表示并将所选的预先被定义为保守性残基的芳香族残基Y、W和F加以标示而将各个经预测的二级结构转形成一新序列图样，和(3)以解析出的三维结构作为模板，对蛋白质序列实施进行性相关操作。
60.根据权利要求59所述的方法，其特征在于将其中各个经预测的二级结构加以计算且分数最高者为最佳的候选物，对应于那些模板结构鉴别其中的关键残基。
61.根据权利要求59所述的方法，其特征在于进行关联操作以提供关于二级结构位置和保守性芳香族残基的最佳比对。
62.根据权利要求50所述的方法,其特征在于该拓朴学为类免疫球蛋白拓朴学。
全文摘要
一种包含淀粉结合部位的重组蛋白质及其用途。本发明涉及一种新颖的淀粉结合部位(SBD)及其用途。本发明提供一种包含淀粉结合部位的纤维。本发明亦提供一种鉴别候选淀粉分解酶的淀粉结合部位的配体结合位点的方法。
文档编号C07K1/36GK102863520SQ201210091688
公开日2013年1月9日 申请日期2006年3月2日 优先权日2005年3月3日
发明者张大慈, 许嘉钦 申请人:善笙生物科技股份有限公司