专利名称：一种γ-醇溶蛋白基因的核酸序列及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种Y-醇溶蛋白基因的核酸序列及其用途，提供了分析不同SDS沉降值水平的分子标记方法，属于分子遗传育种领域，专用于小麦优质专用品种的选育和种植资源的评价利用
背景技术：
小麦成熟籽粒蛋白质主要由醇溶蛋白和麦谷蛋白组成，两者能形成一种具有弹性和韧性的复合物，称作面筋。麦谷蛋白主要决定面筋的弹性，醇溶蛋白则赋予面筋延展性。醇溶蛋白在酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)中分为α (最快)、β、Y、ω (最慢)4个区。大多数Y-醇溶蛋白和ω-醇溶蛋白分别由I号染色体短臂上的Gli-I和Gli-3位点编码，与LMW-GS编码位点Glu-3紧密连锁；α -醇溶蛋白一般由6号染色体短臂上的Gli_2位点编码。一般认为3个贮藏蛋白位点与小麦加工品质关系重要性依次为Glu-l > Gli-I> Gli-2。目前已鉴定出一些与小麦品质相关的醇溶蛋白带或等位基因。多肽一级结构决定蛋白质的性质。Y-醇溶蛋白的一级结构重复区中高密度的谷氨酰胺区意味着有两两可形成氢键的-0H，很大程度上决定蛋白质的弹性。但醇溶蛋白组分复杂不易纯化，不同类型的醇溶蛋白具体影响面粉品质哪些方面还存在争议，对其一级结构功能区的研究还不够透彻。因此很有必要在分子水平上进一步研究醇溶蛋白的分子机理。SDS沉降值与面筋质量密切相关。是衡量小麦面筋数量和质量以及面团流变学特性的综合间接指标，同时SDS沉降值基因型间遗传差异显著，具有较高遗传力，国内外许多育种者倾向于利用SDS沉降值作为小麦加工品质的综合评价指标。采用SDS沉降值评价小麦加工品质的局限是必须等到种子收获后才能进行选择和筛选，在育种过程中易造成资源的浪费。因此在小麦育种过程开发针对SDS沉降值水平的分子标记有非常重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以鉴定普通小麦SDS-沉降值水平高低的分子标记。通过对目标带型的分析，发现Y-醇溶蛋白谷氨酰胺富集区对小麦SDS-沉降值水平有正向作用，可用于评价和利用种植资源，加快品质育种的进度。为达到本发明的目的，本发明采用的技术方案如下本发明以普通低面筋小麦总DNA为模板，根据文献报道的Y-醇溶蛋白基因引物(P3 :5’ TATTAGTTAACGCAAATCCACTATG3’，P4 :5’ GATGAATCAGCTAAGCAACGATG3’)，利用 PCR 和分子克隆技术分离Y-醇溶蛋白基因，将获得的基因序列与NCBI数据库中的Y-醇溶蛋白基因序列进行多重比对并分析其在一级结构上的异同，结果表明我们克隆得到一个新型Y-醇溶蛋白基因，其编码的Y-醇溶蛋白缺失了大片段的IV谷氨酰胺富集区，其核酸序列如下
I TATTAGTTAA CGCAAATCCA CTATGAAGAC CTTCCTCATC41 CTAACGATCC TTGCGATGGC AACTACCATC GCCACCGCCA81 ATATGCAGGT CGGCTCCAGC GGCCAAGTAC AATGGCCACA121 ACATCAACAG CTCCCCCAGC CCCAACAACC ACTCTACCAT161 CAACCACAAC AAATATTTCC CCAACCCCGA CAAACATTCC201 CCCATCTACC ACAACAAACA TTTCCCCAAC CCCAACAAAC241 AATCCCCCAT CAACCACAAC AACAATTTCC CCAGACCCAA281 CAACCACTAC AACCATTTCC TCAGCCCCAA CAAACATTCC321 CCCAACAACC ACAACAACCA TTACCCCAAC CTCAACAACC361 CCAACAACCA TTTCCCCAGT CACAACAACC ACAACAACCA401 CAACAACCAT TTCCTCAGCC CCAACAACAA TTCCCGCAGC441 CCCAACAACC CCAACAATCA ATCCCCCAGC AACAACAACC481 ATTGATTCGG TCATCTCTAC AACAACAGAT GAACCCATGC521 AAGAATTTTC TCTTGCAGCA ATGCAACCCT GTGTCGTTGG561 TGTCATCCCT TGTGTCATTG ATCTTTCCTC GAAGTGATTG601 CCAGGTGATG CAGCTACAAT GTTGCCAACA ACTAGCACAG641 ATTCCACAGC AGCTGCAGTG TGCAGCCATC CATAGCGTCG681 TGCATTCCAT CATGATGCAG CAAGAACAAC AACAACCTCA721 ACAACTAGCT CACTTAGAGG TGATTAGGTC ATTGGTGTTG761 AAAACTCTTC AAACCATGTG CAATGTGTAT GTTCGACCTG801 ACTGCTCCAA CATCAGGACA CCATTTGCCA GCACAGTCGC841 CGGCATTGGC GGCCAATGAA AAAAGTTGGT GTTATGCTAA881 TAGGTAGATG GATCA以上序列为本发明人克隆得到的新型Y-醇溶蛋白的编码基因，根据通用密码子信息，得到其推导的氨基酸序列如下I MKTFLILTIL AMATTIATAN MQVGSSGQVQ WPQHQQLPQP41 QQPLYHQPQQ IFPQPRQTFP HLPQQTFPQP QQTIPHQPQQ81 QFPQTQQPLQ PFPQPQQTFP QQPQQPLPQP QQPQQPFPQS121 QQPQQPQQPF PQPQQQFPQP QQPQQSIPQQ QQPLIRSSLQ161 QQMNPCKNFL LQQCNPVSLV SSLVSLIFPR SDCQVMQLQC201 CQQLAQIPQQ LQCAAIHSVV HSIMMQQEQQ QPQQLAHLEV 241 IRSLVLKTLQ TMCNVYVRPD CSNIRTPFAS TVAGIGGQ该蛋白序列与已公布的具有潜在功能的Y-醇溶蛋白序列多从比对发现，缺失大片段的谷氨酰胺富集区(图I)。本发明的特异引物正是依据缺失区域前后保守序列设计的编码框内引物P1、P2，目的是通过扩增片段的大小，判断小麦籽粒中Y-醇溶蛋白是否缺失谷氨酰胺富集区。本发明还提供一种扩增Y-醇溶蛋白谷氨酰胺富集区在内的编码框内引物标记小麦SDS-沉降值水平的方法，包括基因组DNA提取、引物设计(该引物为Pl 5’ TCGTTGGTGTCATCCCTT3’，P2 :5’ GATGGTGGAGCAGTCAGG3’)、基因扩增、特异片段的验证，其特征在于，以上述新型Y-醇溶蛋白基因的核酸序列进行引物设计，开发特异分子标记。所述引物是上述Y-醇溶蛋白基因的核酸序列为模板，扩增的目标片段为261bp，而且以该引物Pl，P2扩增SDS沉降值水平不同的小麦基因组DNA，通过目标带型分析判断小麦粉SDS沉降值高低水平。在以低筋小麦材料(川麦32) DNA为模板的扩增条件下，引物P1、P2能扩增出不同长度的片段(图2)，且以260bp为主要带型。PCR 反应组成DNA100-150 ngdNTPs100 μ M
引物 Pl5 pmol
引物 P25 pmolTaq 聚合酶0.7 U10*PCR 缓冲液2.5 μ LMg2+1.5 mMDdH20加至终体积25 μ L(I ) 94 °C5 min(2)94°C45 s(3 ) 56°C25 sPCR反应程序
(4)72°C25 s 重复(2)——(4) 32次
(5)72 °C8 minPCR扩增产物在2.0%琼脂糖凝胶上分离，100V恒压电泳60分钟。由于经典的Y-醇溶蛋白含有谷氨酰胺富集区，而本发明从普通小麦中克隆的新型Y-醇溶蛋白编码序列缺失该区域。根据此特征，设计特异性引物，扩增SDS沉降值水平差异较大的材料，其扩增带型存在明显差异(图3)。在高沉降值材料中，以约400bp的带型为主(图4);而在低沉降值的材料中，目标条带(约260bp)清晰(图5)。从而根据带型特征，能很好地判断供试材料SDS沉降值的水平。推断此类Y-醇溶蛋白在普通小麦中存在的规律，说明Y-醇溶蛋白谷氨酰胺富集区对小麦品质有重要影响。本发明的有益效果
本发明是首次从分子水平检测小麦籽粒SDS沉降值高低水平，种子用量少，并且有利于在育种中快速有目的地选择优质专用种植资源，缩短育种年限。效果快捷明显，有良好的应用前景。
图I是本发明Y-醇溶蛋白序列与已知Y-醇溶蛋白序列多重比较结果，缺失大片段的IV谷氨酰胺富集区富集区；
图2是引物对P1、P2在低筋小麦川麦32中的扩增片段，其中M为Marker DM500 ；图3是引物对P1、P2在不同SDS沉降值水平不同的两个材料中扩增结果。其中I、2为低沉降值小麦，3、4为高沉降值小麦，其中M为Marker DM500 ；图4是引物对P1、P2在高SDS沉降值小麦材料中的扩增结果。约400bp的扩增带为亮带，其中M为Marker DM500 ；图5是引物对P1、P2在低SDS沉降值小麦材料中的扩增结果。260bp条带为亮带，其中 M 为 Marker DM500。
具体实施例方式以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。实施例I :I、基因组DNA的提取采取CTAB法提取低筋小麦川麦32的基因组DNA，提取步骤如下(I)取I克新鲜又嫩叶片，液氮研磨成粉后加2*CTAB提取液Iml混匀；(2) 65 °C水浴30-60分钟，期间轻摇混匀。室温加入等体积的氯仿异戊醇(24 I)，轻摇混匀10分钟，IOOOOrpm离心10分钟； (3)取上清液，加入等体积的异丙醇,冰浴30分钟，沉淀DNA ；(4) IOOOOrpm离心10分钟，弃上清，70%乙醇离心洗涤沉淀2次，室温风干DNA沉淀，溶于适量灭菌蒸馏水中；(5) 120V恒压，I %琼脂糖凝胶电泳20分钟，检测DNA浓度及质量。2、根据已报道的引物序列(P3 :TATTAGTTAACGCAAATCCACTATG，P4 :GATGAATCAGCTAAGCAACGATG)进行PCR扩增，扩增体系如下DNA100-150 ng
dNTPs100 μ M
引物 Ρ35 pmol
引物 Ρ45 pmolPCR反应组成
Taq聚合酶0.7 U
10*PCR缓冲液2.5 μL
Mg2+1.5 mM
DdH20加至终体积25 μ L(I ) 94 °C5 min
(2)94°C45 sPCR反应程序
(3 ) 57°CI min (4 ) 72 °CI min
重复(2) - (4) 35次
(5)72 °C8 min3、PCR产物回收和纯化使用Biomiga的胶回收试剂盒，操作均按照说明书进行。4、连接和转化使用Takara的连接试剂盒将回收产物连接到PMD-19T载体，操作按说明书进行；将连接产物加入200 μ I感受态细胞DH5 α (购于天根生化科技有限公司)，充分混匀置于冰上30分钟，42°C热击90秒，37°C振荡(200rpm)培养45分钟，IOOOOrpm离心3分钟收集菌体，均匀涂于含氨苄青霉素(100μ g/ml)的LB固体培养基平板上，37°C静止培养16小时；5、阳性克隆的筛选(I)挑取培养板上生长良好的白色单菌落，在含氨苄青霉素(100μ g/ml)的LB固体培养基平板上划线，扩大培养(37°C培养12小时)；(2)挑取扩大培养后的菌进行PCR扩增，同步将扩大培养后的菌接种于Iml含氨节青霉素(100 μ g/ml)的LB液体培养基中，37°C培养6小时；(3)扩增产物在I %琼脂糖凝胶上分离，100V恒压30分钟，检测有无目的片段。6、序列测定与比对分析随机选取阳性克隆进行测序，序列测定由华大基因完成。测序结果在NCBI数据库中进行比对，采用DNAMAN和MEGA软件进行序列分析。 7、根据Y-醇溶蛋白谷氨酰胺富集区编码序列前后保守区域，使用primerpremierf软件设计特异引 物对P1、P2，以新克隆的Y -醇溶蛋白基因为模板，其目标片段为260bp左右。8、材料选择及DNA的提取选择本实验室保存的材料100份，三年内测定的微量SDS沉降值数据稳定；材料包含不同SDS沉降值水平。采用CTAB提取所选材料的DNA。9、以引物对Pl，P2扩增所选材料100份，扩增带型与材料的SDS沉降值水平完全相符(图4、图5)。因此推断低沉降值小麦中Y-醇溶蛋白谷氨酰胺富集区缺失的类型较多，而高沉降值小麦中Y-醇溶蛋白的类型很少或几乎不存在谷氨酰胺富集区的缺失。该分子标记能有效用于小麦材料SDS沉降值水平的筛选。
权利要求
1.一种Y-醇溶蛋白基因的核酸序列，其特征在于所述基因序列为序列表中SEQ IDNo. I所示的核酸序列。
2.根据权利要求I所述的Y-醇溶蛋白基因的核酸序列，其特征在于该基因编码产物缺失大片段的IV谷氨酰胺富集区。
3.—种Y-醇溶蛋白基因的氨基酸序列，其特征在于所述基因序列为序列表中SEQ IDNo. 2所示的氨基酸序列。
4.一种扩增Y-醇溶蛋白谷氨酰胺富集区在内的编码框内引物标记小麦SDS-沉降值水平的方法，包括基因组DNA提取、引物设计、基因扩增、特异片段的验证，其特征在于以权利要求I所述的Y-醇溶蛋白基因的核酸序列进行引物设计，开发特异分子标记。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的引物为Pl :5’ TCGTTGGTGTCATCCCTT3’，P2 :5， GATGGTGGAGCAGTCAGG3，。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于所述引物是根据权利要求I所述的Y-醇溶蛋白基因的核酸序列为模板，扩增的目标片段为261bp。
7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于以引物Pl，P2扩增SDS沉降值水平不同的小麦基因组DNA，通过目标带型分析判断小麦粉SDS沉降值高低水平。
全文摘要
本发明公开了一种γ-醇溶蛋白基因的核酸序列，其基因序列为序列表中SEQ ID No.1所示的核酸序列，该醇溶蛋白缺失大片段的谷氨酰胺富集区。本发明还公开了扩增γ-醇溶蛋白谷氨酰胺富集区在内的编码框内引物标记小麦SDS-沉降值水平的方法，包括基因组DNA提取、引物设计、基因扩增、特异片段的验证。该方法中设计了特征引物P1，P2，此特征引物可作为供试材料SDS沉降值水平高低的标记，便于优质种植资源的筛选，加快品质育种的进程，提高育种效率。
文档编号C07K14/415GK102618555SQ20121009087
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月30日 优先权日2012年3月30日
发明者吴瑜, 张静, 李竹林, 李莉蓉, 李韵芳, 林旭群, 鲁璐 申请人:中国科学院成都生物研究所