一种13KDa大米醇溶蛋白的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种大米醇溶蛋白的提取方法。
【背景技术】
[0002]大米蛋白具有低过敏性特点，易于被人体消化吸收。并且大米蛋白具有降血脂、降胆固醇、抗氧化、防肥胖功能，特别是最新研究表明大米蛋白具有预防糖尿病的功效，因而大米蛋白被认为是一种具有高开发价值的植物蛋白资源，受到了全世界研究者们的关注。
[0003]醇溶蛋白是大米蛋白的主要贮藏蛋白，分子量主要为10、13、161?&，其中，13^^蛋白是大米醇溶蛋白的主要蛋白体，具有重要的有益健康的生理调控功能。研究表明，大米醇溶蛋白具有较强吸附胆汁酸等功效，能够有效预防高血脂等疾病，并且，由于大米醇溶蛋白的低消化性特征，是糖尿病人群首选的优良植物性蛋白。但是截至目前为止，由于13KDa大米醇溶蛋白分离较难，纯度较难控制，因此，对高纯度13KDa大米醇溶蛋白的提取技术尚属缺乏。
[0004]已有的提取技术表明，提取醇溶蛋白的方法常采用乙醇、丙三醇、丁二醇等溶剂，具有提取率较低，杂带较多，纯度较低，浪费流失较多等弊端，难以推进功能性大米醇溶蛋白的大规模工业化生产。
【发明内容】
[0005]本发明是要解决现有醇溶蛋白的提取方法提取率较低，纯度较低，无法大规模工业化生产的问题，提供一种13KDa大米醇溶蛋白的提取方法。
[0006]本发明13KDa大米醇溶蛋白的提取方法，按以下步骤进行:
[0007]—、将大米用粉碎机研磨成米粉；
[0008]二、将米粉用正己烷脱脂3?5次，得脱脂米粉；
[0009]三、将脱脂米粉用洗脱液浸提3?5次，再将沉淀用纯水清洗3?5次；
[0010]四、将步骤三清洗后的沉淀用浓度为60% (v/v)的正丙醇溶液浸提，取上清；
[0011]五、将上清用浓度为10%?12% (w/v)的三氯乙酸溶液将蛋白沉淀；
[0012]六、将步骤五的沉淀真空冷冻干燥，即得到13KDa大米醇溶蛋白。
[0013]本发明的有益效果:
[0014]本发明采用正丙醇提取、三氯乙酸沉淀，其优点在于能够将大米醇溶蛋白的主体一13KDa大米醇溶蛋白充分提取出来，且无杂带、纯度较高、无污染、无危害，并且不需要调pH。
[0015]本发明的方法简单、快速、高效，能够提取高纯度13KDa大米醇溶蛋白，其提取的大米醇溶蛋白纯度可达90 %?94 %，大米醇溶蛋白提取率达95 %?97 %。适于大规模工业化提取大米醇溶蛋白。
【附图说明】
[0016]图1为实施例1中的蛋白电泳图。
【具体实施方式】
[0017]本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的任意组合。
[0018]【具体实施方式】一:本实施方式13KDa大米醇溶蛋白的提取方法，按以下步骤进行:
[0019]一、将大米用粉碎机研磨成米粉；
[0020]二、将米粉用正己烷脱脂3?5次，得脱脂米粉；
[0021]三、将脱脂米粉用洗脱液浸提3?5次，再将沉淀用纯水清洗3?5次；
[0022]四、将步骤三清洗后的沉淀用浓度为60% (v/v)的正丙醇溶液浸提，取上清；
[0023]五、将上清用浓度为10%?12% (w/v)的三氯乙酸溶液将蛋白沉淀；
[0024]六、将步骤五的沉淀真空冷冻干燥，即得到13KDa大米醇溶蛋白。
[0025]【具体实施方式】二:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:步骤一中所述米粉的粒径为70?90目。其它与【具体实施方式】一相同。
[0026]【具体实施方式】三:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:步骤二中将米粉用正己烷脱脂的具体方法为:
[0027]A、将米粉与正己烷按照lg:4?6mL的比例混合，室温搅拌1小时，静置1小时，然后于4000rpm离心20min后收集沉淀；
[0028]B、重复步骤A2?4次，将收集的沉淀于30°C晾干，得到脱脂米粉。其它与【具体实施方式】一相同。
[0029]【具体实施方式】四:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:步骤三中将脱脂米粉用洗脱液浸提的具体方法为:
[0030]A、将脱脂米粉与洗脱液按照lg: 10?12mL的比例混合，25°C 130rpm振荡30min，
离心后去掉上清留下沉淀；
[0031]B、重复步骤A2?4次，得沉淀。其它与【具体实施方式】一相同。
[0032]【具体实施方式】五:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:所述洗脱液为50mM且pH6.5的KH2P04-Na0H缓冲液，其中含有0.5MNaCl和lmMEDTA_2Na。其它与【具体实施方式】一相同。
[0033]【具体实施方式】六:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:步骤四中将步骤三清洗后的沉淀用体积分数为60%的正丙醇溶液浸提的具体方法为:
[0034]①将步骤三清洗后的沉淀与体积分数为60%正丙醇溶液按照lg: 10?12mL的比例混合，25°C 130rpm振荡8h，在4°C 10000g离心20min后，收集上清和沉淀；
[0035]②将步骤①中的沉淀与体积分数为60%正丙醇溶液按照lg: 10?12mL的比例混合，25°C 130rpm振荡8h，在4°C 10000g离心20min后，收集上清和沉淀；
[0036]③将步骤②中的沉淀与体积分数为60%正丙醇溶液按照lg: 10?12mL的比例混合，25°C 130rpm振荡4h，在4°C 10000g离心20min后收集上清。其它与【具体实施方式】一相同。
[0037]【具体实施方式】七:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:步骤五中将上清用质量浓度为10%的三氯乙酸溶液将蛋白沉淀的具体方法为:
[0038]将步骤四收集的上清加入浓度为10% (w/v)的三氯乙酸溶液，上清与三氯乙酸溶液的体积比3:10，震荡混匀后，避光条件下于0?4°C冰浴反应静置15?20min，然后在4°C 10000g条件下离心20min，弃上清留下沉淀。其它与【具体实施方式】一相同。
[0039]【具体实施方式】八:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:步骤六中空冷冻干燥的条件为:真空度< 15Pa，冷阱温度为-60?-50°C，样品温度-30?-20°C，冻干时间为20?24h。其它与【具体实施方式】一相同。
[0040]为验证本发明的效果，进行以下试验:
[0041]实施例1:
[0042]本实施例13KDa大米醇溶蛋白的提取方法，按以下步骤进行:
[0043]—、将大米用粉碎机研磨成米粉，米粉的粒径为80目。
[0044]二、将米粉用正己烷脱脂3次，得脱脂米粉，具体方法为:
[0045]A、将米粉与正己烷按照lg:5mL的比例混合，室温搅拌1小时，静置1小时，然后于4000rpm离心20min后收集沉淀；
[0046]B、将步骤A收集的沉淀与正己烷按照lg:5mL的比例混合，室温搅拌1小时，静置1小时，然后于4000rpm离心20min后收集沉淀；
[0047]C、将步骤B收集的沉淀与正己烷按照lg:5mL的比例混合，室温搅拌1小时，静置1小时，然后于4000rpm离心20min后收集沉淀；将收集的沉淀于30°C晾干，得到脱脂米粉。
[0048]将脱脂米粉用洗脱液浸提5次，具体方法为:
[0049]A、将脱脂米粉与洗脱液按照lg: llmL的比例混合，25°C 130rpm振荡30min，离心后去掉上