专利名称：：一种纳米组合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明为一种新型给药系统载体材料小麦醇溶蛋白与水飞蓟宾制成的肝耙向纳米组合物。涉及生物材料，生物医学工程与新药研究领域。技术背景水飞蓟宾(Silybin，SN)是由菊科植物水飞蓟SilybumMarian咖L.果实中提取得到的水难溶性黄酮类化合物。药理实-验证明，水飞蓟宾对多种肝脏毒物引起的肝脏损伤有明显的保护作用。其靶器官为肝脏，进入体内后主要与血浆蛋白结合，以结合型水飞蓟宾的形式存在于血浆、胆汁及尿液中(史向国，钟大放，张逸凡，等.反相高效液相色谱法测定大鼠血浆中水飞蓟宾的浓度[J].沈阳药科大学学报，2001,18(2):113)。对急慢性肝炎、肝硬化和代谢中毒性肝损伤具有较好的疗效(宋立人，洪恂，丁绪亮，等.现代中药学大辞典.北京人民卫生出版社，2001,496-498)。由于水飞蓟宾难溶于水及一般有机溶剂，口服吸收差，其生物利用度较低，从而影响了其临床疗效。目前，以水飞蓟宾为有效单体的治疗药物剂型有口服制剂水飞蓟素片、益肝灵片、水飞蓟宾卵磷脂复合物硬胶嚢等。商品名有利肝隆，利加隆，益肝灵等。注射剂主要是做成水飞蓟宾衍生物，如葡-N甲胺盐，二乙胺盐，N，二甲基甘氨酸盐，玻璃酸酶铀盐等或制成包合物再做成水溶性注射剂。在我国，生产水飞蓟宾制剂有几十年的历史，常见的剂型主要为片剂、胶嚢等，因此对于该有效单体的新剂型开发前景广阔。微粒制剂的研究已经成为当今药剂学研究的一个热点。而微粒制剂靶向给药系统的载体材料以天然的高分子材料，尤其是天然蛋白质类高分子材料更具研究价值。蛋白类高分子均易于代谢，但近年来，由于动物来源的蛋白高分子材料可能携带病毒，因此植物来源的高分子蛋白材料就显示出更大的优势，例如能够包埋多种活性物质、不会被病毒或朊病毒(prion)污染、具有药理惰性和无毒等特点，而且植物来源的多糖和蛋白质有望成为合成聚合物的优良替代品(徐晖，姬雅菊，王绍宁，等.聚合物纳米颗粒的制备及其应用(II)利用合成聚合物或天然大分子制备纳米颗粒.中国药剂学杂志，2004，2(4):91-99)。植物蛋白包括植物白蛋白、球蛋白、醇溶谷蛋白和谷蛋白4种，与动物蛋白相比，植物蛋白更易于分离纯化、价格也更低廉。醇溶蛋白是从谷类植物贮存蛋白中以适当浓度乙醇提取的分子量在10OkD~3OkD的一组蛋白质。具有较多的中性和亲脂性基团，除在极端pH值条件下醇溶蛋白在水中溶解度极低。其主要组成是约40%的谷氨酸和14%的脯氨酸，几乎没有带电荷的氨基酸。国内外对于醇溶蛋白的研究仅限于谷物育种、面包品质等农学与食品科学领域。国外药剂学方面对于醇溶蛋白作为药物载体的研究也较少。根据醇溶蛋白的性质决定其可以通过去溶剂化法制备成纳米粒，在整个制备过程中仅仅使用乙醇，而没有引入其他有机溶剂，大大降低生产成本，有效的解决了微粒制剂有机溶剂残留的问题，并为其工业化提供了保证。另外，醇溶蛋白来源丰富，容易分离提纯，并且有很好的生物相容性，经体外试验证明没有细胞毒性。研究表明，由于其内部的財建及S-S键而呈折叠状二级结构，醇溶蛋白所形成的肽泡状药物载体与肠上皮细胞，肝细胞以及皮肤角质细胞具有一定亲和性，可以作为转染试剂(载体)，能够将药物运输到细胞内，提高药物作用效果(Teglia，A.,Secchi，G..Newproteiningredientsforskindetergency:relativewheatproteinsurfactantcomplexes.Int.J.Cosmet.Sci.,1994，16:235-246)。另夕卜，由于其表面大量的活性基团可以偶联特异性抗体，识别抗原，达到胞内靶向给药的目的。国内外文献检索结果表明还未发现利用醇溶蛋白载体材料包裹水飞蓟宾制成纳米制剂的报道。
发明内容本发明要解决的技术问题之一是提供了一种具有肝靶向的纳米组合物，此纳米组合物是由小麦醇溶蛋白与水飞蓟宾共同制成，可提高药物的包封率和载药量，同时解决了水飞蓟宾水难溶性问题，具有肝脏靶向性，提高水飞蓟宾的临床疗效。本发明进一步提供了小麦醇溶蛋白与水飞蓟宾的纳米组合物的冻干粉针剂，并提供了相应的制备方法。本发明所述的纳米组合物是水飞蓟宾以单体形式包裹并吸附于小麦醇溶蛋白形成的，其中治疗性成分水飞蓟宾的质量百分含量为2%~20%，该纳米组合物的粒经大小为50~500mn。小麦醇溶蛋白来源于小麦面筋粉，所述纳米组合物中载体材料小麦醇溶蛋白的制备方法是一种快速简便的蛋白质提取纯化方法(I.Ezpeletaetal.Gliadinnanopariclesforthecontrolledreleaseofall-trans-retinoicacid,//7f/尸力ar/z/131(1996)191-200.)，用稀乙醇(40%~80°/。)对谷类作物进行提取，经过两次离心得到小麦醇溶蛋白粗提物，并采用水-酸水-水透析法纯化得到小麦醇溶蛋白。其分子量范围通过电泳测定，结果小麦醇溶蛋白是在200KD-30KD之间的一组蛋白质的组合物。本发明所述的纳米组合物，其特征在于该纳米组合物是通过去溶剂化法制备、并在乙醇环境下以固化剂(醛、酮类)固化得到的，具体步骤如下A.将水飞蓟宾与小麦醇溶蛋白溶解于70%乙醇中，形成相a;B.将无水乙醇迅速倒入搅拌状态下的a相中；C.滴加醛酮类固化剂固化，旋转蒸发除去乙醇，即得水飞蓟宾小麦醇溶蛋白纳米组合物胶体溶液。上述制备方法中还包括在水飞蓟宾小麦醇溶蛋白纳米组合物胶体溶液中加入2%~10%药学上可接受的冻干支架剂，经冷冻干燥制得水飞蓟宾小麦醇溶蛋白纳米组合物冻干粉针剂。上述制备方法中所述的冻干支架剂包括甘露醇，蔗糖，乳糖，葡萄糖，果糖，木糖醇，海藻糖中的一种或几种。上述制备方法中所述的醛、酮类固化剂包括曱醛、戊二醛或丁二酮，使用浓度为0.1%~1%。本发明所述的纳米组合物制备方法，还包括，在水飞蓟宾小麦醇溶蛋白纳米组合物胶体溶液中加入表面活性剂或稳定剂，其中表面活性剂或稳定剂包括卵磷脂、泊洛沙姆188(Poloxamer188)、大豆磷脂、吐温类、司盘类、十二烷基石克酸钠、蔗糖脂肪酸酯类的一种或几种。本发明所述的纳米组合物制备过程中采用的搅拌速度为500~1000rpm,充分去溶剂化10~30min，使载体材料包裹药物形成纳米粒子。固化剂固化4h8h即可将纳米粒固化，随着固化时间的延长，药物的释i文程度降低，释放速度减慢。本发明所述的纳米组合物以注射途径给药时被内皮网状系统摄取而到达肝脏，从而提高肝脏内部药物浓度，降低给药剂量，提高治疗肝炎的治疗效果。本发明所述的纳米组合物的有益效果(1)载药后纳米组合物电子显微镜下观察呈微嚢状结构，体外释放结果表明，载药纳米组合物在适当释放介质中的体外释放行为与空白药物相比呈现明显的緩释效果，释放曲线符合weibull模型。(2)本发明所述的纳米组合物在小鼠体内组织分布实验中具有肝脏靶向性。取昆明种小鼠50只，体重(20±2)g，雌雄各半，随机分为10组，每组5只。其中5组尾静脉注射给予纳米组合物冻干粉针剂(临用前用水复溶，制成每ml含水飞蓟宾(SN)0.56mg，按5.6mg/kg进行给药)作为实验组，另外5组尾静脉注射给予对照药水飞蓟宾(SN)溶液(用70%乙醇溶解，滴加0.2M氢氧化钠配制成每ml含SN0.56mg的溶液)作为对照组；于给药后2min、5min、15min、30min、60min眼眶取血处死，全血置肝素化塑料离心管中。迅速解剖处死小鼠取出心、肝、脾、肺、肾、脑等器官，滤纸吸干，称重后，立即冷藏备用。全血于10，OOOrpm离心lOmin，分离血浆，备用。所有样品均置-20。C水箱中冷冻保存。按脏器的重量，加入2倍(或4倍)体积的生理盐水，匀浆处理。匀浆液i文入冰箱-2(TC冷冻保存，供样品配制时使用。以乙腈和0.4%乙酸(32.5:67.5)溶液为流动相，生物样品经甲醇沉蛋白处理后利用ds柱进行分离，采用内标法测定。测定结果显示水飞蓟宾小麦醇溶蛋白纳米组合物与对照药物相比，延长了水飞蓟宾在肝中的滞留时间，并增加了药物的肝脏分布，对照药物(水飞蓟宾)与水飞蓟宾小麦醇溶蛋白纳米组合物的体内平均滞留时间(MRT)分别为为4.90min和12.97min(P<0.05)。其中对照药物的肝脏分布为10%，而制备成纳米组合物后的肝脏分布提高为28.6%，具有一定肝靶向性。(3)本发明所述的纳米组合物对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的影响试验结果说明，水飞蓟宾小麦醇溶蛋白纳米组合物冻干粉针剂对四氯化碳致小鼠急性肝损伤有明显的防治作用。供试品按照实施例1方法制备的水飞蓟宾小麦醇溶蛋白纳米组合物冻干粉针剂(SN-GNP)方法取昆明种小鼠72只，雌雄各半，随机分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组(甘利欣50mg/kg)、SN-GNP小(5mg/kg)、中(10mg/kg)、大(20mg/kg)剂量组，共6组，每组12只。阳性对照组及SN-GNP各组均按0.lml/10g尾静脉注射给药，空白对照组与模型对照组给予等体积的生理盐水，每日1次，共8日，并于第7日给药1.5小时后除空白对照组外，其余各组均按0.lml/10g体积腹腔注射0.12%四氯化碳花生油溶液进行造模。造模后禁食不禁水16h，摘眼球取血测血清ALT、AST，同时取肝称重，计算肝脏系数。结果SN-GNP小、中、大剂量组与模型对照组比较，ALT值明显降低，差异有显著性(P<0.05~P<0.001);SN-GNP中、大剂量组与模型对照组比较，AST值明显降低，差异有显著性(P<0.05、P<0.01);SN-GNP各剂量组肝脏系数有降低趋势。表lSN-GNP对四氯化碳致小鼠急性肝损伤血清ALT、AS.T的影响(；±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>0.05.结论水飞蓟宾小麦醇溶蛋白纳米组合物冻干粉针剂对四氯化碳致小鼠急性肝损伤有明显的防治作用。讨论四氯化碳致小鼠急性肝损伤是目前保肝降酶药物筛选的最经典模型之一。四氯化石灰进入体内后，经肝脏细胞色素P450激活，生成三氯曱基自由基，通过氧吸附而攻击内质网膜上的磷脂分子，引起膜的脂质过氧化，三氯曱基自由基继而与膜脂质和蛋白质大分子进行共价维合，引起膜结构和功能完整性的破坏，三氯曱基自由基还抑制细胞膜和微粒体膜上钙泵活性，使Ca"离子内流增加，从而引起细胞中毒死亡。胞浆内的ALT、AST转氨酶大量释放到血液中，引起血清中ALT、AST转氨酶活性显著升高，并使肝脏肿大。本实验以四氯化碳为造模剂，以联苯双酯为阳性对照，以血清ALT、AST含量及肝脏系数为观察指标，来研究水飞蓟宾小麦醇溶蛋白纳米组合物冻干粉针剂是否具有保肝活性。结果表明，造模成功，阳性药有效，说明方法可行，水飞蓟宾小麦醇溶蛋白纳米组合物冻干粉针剂小、中、大剂量组与模型对照组比较，ALT值明显降低，差异有显著性；水飞蓟宾小麦醇溶蛋白纳米组合物冻干粉针剂中、大剂量组与模型对照组比较，血清AST值明显降低，差异有显著性；水飞蓟宾小麦醇溶蛋白纳米组合物冻干粉针剂各剂量组肝脏系数有降低趋势。说明水飞蓟宾小麦醇溶蛋白纳米组合物冻干粉针剂对四氯化碳致小鼠急性肝损伤有明显的防治作用。本发明的主要优点如下1、载体材料小麦醇溶蛋白适合于包裹水难溶性药物，有利于提高药物的包封率和载药量，本发明中所述的水飞蓟宾小麦醇溶蛋白纳米组合物的包封率为70~80%。2、该载体材料小麦醇溶蛋白的制备方法简单，适合产业化，应用于纳米给药载体具有一定的新颖性。3、本发明所述的水飞蓟宾小麦醇溶蛋白纳米组合物，提高了肝内药物浓度，对于治疗肝脏疾病具有一定意义。4、水飞蓟宾的临床疗效确切，但其难溶于水等物理性质限制了临床应用，此方法很好的解决了该问题，使得水飞蓟宾药物的研究开发具有广阔的空间与良好的发展前景。具体实施例实施例1小麦醇溶蛋白lOOmg与15mgPoloxa匿188以12ml70%乙醇溶液溶解，再加入18.8mg水飞蓟宾(SN)，1500rpm速度磁力搅拌使溶解，迅速加入1%Poloxamer188溶液28ml,继续搅拌30min，S走转蒸发除去部分乙醇，即得纳米组合物胶体溶液。向此溶液中加入葡萄糖400mg，甘露醇200mg，充分溶解，冻干即得纳米组合物冻干粉针剂。加去离子水复溶后测定粒径为203nm，多分散指数(PDI)0.217。实施例2小麦醇、溶蛋白200mg与30mgPoloxamer188以15ml70y。乙醇、溶液溶解，再加入10mg水飞蓟宾(SN)，2500rpm速度^f兹力搅拌使溶解，迅速加入无水乙醇36ml，继续搅拌20min，滴加1%戊二醛溶液1.2ml，继续搅拌固化8-12h，旋转蒸发除去部分乙醇，即得纳米组合物胶体溶液。向此溶液中加入葡萄糖200mg,甘露醇200mg，充分溶解，冻干即得纳米组合物冻干粉针剂。加去离子水复溶后测定粒径为280nm，多分散指数(PDI)0.112。实施例3小麦醇溶蛋白120mg与16mg卵磷脂以6ml70%乙醇溶液溶解，再加入2.4mg水飞蓟宾(SN),500rpm速度磁力搅拌使溶解，迅速加入无水乙醇24ml，继续搅拌30min，滴加2%甲醛溶液2.4ml，继续搅拌固化8-12h,旋转蒸发除去部分乙醇，即得纳米组合物胶体溶液。向此溶液中加入葡萄糖100mg,甘露醇100mg,充分溶解，冻干即得纳米组合物冻干粉针剂。加去离子水复溶后测定粒径为480nm，多分散指数(PDI)0.352。实施例4小麦醇溶蛋白120mg与8mg卵磷脂、8mgPoloxamer188以10m簡乙醇溶液溶解，再加入2.4mg水飞蓟宾(SN),500rpm速度/F兹力搅拌使溶解，迅速加入无水乙醇24ml,继续搅拌30min，滴加2%丁二酮溶液1.4ml，继续搅拌固化8-12h,旋转蒸发除去部分乙醇，即得纳米组合物胶体溶液。向此溶液中加入葡萄糖100mg，甘露醇100mg，充分溶解，冻干即得纳米组合物冻干粉针剂。加去离子水复溶后测定粒径为320nm，多分散指数(PDI)0.218。权利要求1、一种纳米组合物，其特征在于是由水飞蓟宾和载体材料小麦醇溶蛋白组成的，粒径为50～500纳米，其中水飞蓟宾的质量百分含量为2％～20％。2、如权利要求l所述的纳米组合物，其特征在于载体材料小麦醇溶蛋白是分子量范围在200KD30KD的一组蛋白质，来源于小麦面筋粉。3、如权利要求1或2所述的纳米组合物，其特征在于该纳米组合物是通过去溶剂化法制备、并在乙醇环境下以醛、酮类固化剂固化得到的，具体步骤如下A.将水飞蓟宾与小麦醇溶蛋白溶解于70%乙醇中，形成相a;B.将无水乙醇迅速倒入搅拌状态下的a相中；C.滴加醛酮类固化剂固化，旋转蒸发除去乙醇，即得水飞蓟宾小麦醇溶蛋白纳米组合物胶体溶液。4、如权利要求3所述的纳米组合物的制备方法，其特征在于还包括在水飞蓟宾小麦醇溶蛋白纳米组合物胶体溶液中加入2%~10°/。药学上可接受的冻干支架剂，经冷冻干燥制得水飞蓟宾小麦醇溶蛋白纳米组合物冻干粉针剂。5、如权利要求3所述的纳米组合物的制备方法，其特征在于，还包括，在水飞蓟宾小麦醇溶蛋白纳米组合物胶体溶液中加入表面活性剂或稳定剂。6、如权利要求5所述的纳米组合物的制备方法，其特征在于表面活性剂或稳定剂为卵磷脂、大豆磷脂、泊洛沙姆188(Poloxamer188)、吐温类、司盘类、十二烷基^fu酸钠、蔗糖脂肪酸酯类的一种或几种。7、如权利要求3所述的纳米组合物的制备方法，其特征在于使用的固化剂醛、酮类化合物包括曱醛、戊二醛或丁二酮，浓度为0.1°/。~1%。8、权利要求1~7任一权利要求所述的纳米组合物在制备治疗肝炎药物中的应用。全文摘要本发明涉及一种新型给药系统载体材料小麦醇溶蛋白与水飞蓟宾制成的肝靶向纳米组合物。并提供了该纳米组合物的制备方法，是通过去溶剂化法达到药物与材料在同一体系中共沉淀；通过该方法制备的纳米组合物胶体溶液还可以与药学上可接受的冻干支架剂混合后制成注射用冻干粉针剂。该纳米组合物能够提高药物在肝脏部位的血药浓度，从而更好的发挥治疗肝炎的药效作用。文档编号B82B3/00GK101317840SQ20071011050公开日2008年12月10日申请日期2007年6月6日优先权日2007年6月6日发明者周亚伟申请人:周亚伟