一种制备艾塞那肽的方法
【专利摘要】本发明涉及一种制备艾塞那肽的方法，解决了现有技术存在的成本高，收率低，杂质（des-Glu15,Glu16-艾塞那肽）含量较大，不适合规模化生产的问题。本发明的具体步骤为：A）以氨基树脂为起始树脂，通过Fmoc固相合成法，按照艾塞那肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中，肽序15-17的氨基酸偶联反应中，溶液DMF中添加其体积20%的2,2,2-三氟乙醇和1.5mol/L的尿素；B）肽树脂裂解后，第一次纯化采用反相填料，第二次纯化采用阴离子树脂，脱盐后可以使杂质des-Glu15,Glu16-艾塞那肽含量降低到0.1%以下，冻干，得到艾塞那肽。本发明提供了一种成本低、纯度高，适合规模化生产的艾塞那肽的制备工艺，此工艺既能有效控制des-Glu15,Glu16-艾塞那肽含量又不影响艾塞那肽的收率。
【专利说明】一种制备艾塞那肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种多肽类药物的制备方法，是一种合成的具有胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)受体激动剂的II型糖尿病的治疗特效药-艾塞那肽的制备方法。
【背景技术】
[0002]艾塞那肽,英文名:Exenatide,为一直链39肽,结构式如下:
【权利要求】
1.一种制备艾塞那肽的方法，提供了一种成本低、纯度高，适合规模化生产的艾塞那肽制备工艺，此工艺既能有效控制des-Glu15，GlU16-艾塞那肽含量又不影响艾塞那肽的收率问题，其特征在于，所述方法包括以下步骤: 步骤1，以氨基树脂为起始树脂，通过Fmoc固相合成法，按照艾塞那肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中，肽序15-17的氨基酸偶联反应中，溶液DMF中添加其体积20 %的2，2，2-三氟乙醇和1.5 mo I/L的尿素； 步骤2，肽树脂裂解后，第一次纯化采用反相填料，第二次纯化采用阴离子树脂，脱盐后可以使杂质des-Glu15，Glu16-艾塞那肽含量降低到0.1 %以下，冻干，得到艾塞那肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是: 其中，步骤I所述的固相合成方法，I)采用0.10-0.35 mmol/g的氨基树脂为起始树脂；2)采用由体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液脱除氨基树脂上的Fmoc保护基；3)在偶联剂系统的存在下,氨基树脂和Fmoc-Ser(tBu) -OH偶联得到Fmoc-Ser (tBu)-树脂；4)重复步骤2)、3)，按照艾塞那肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中，肽序15-17的氨基酸偶联反应中，溶液DMF中添加其体积20 %的2，2，2-三氟乙醇和1.5 mol/L的尿素，由于2，2，2-三氟乙醇可以破坏β结构稳定性，减轻肽链间聚集的倾向，可以提高肽链的溶剂化程度；而使用尿素分子对氢键的干扰作用破坏肽链的β_折叠，可以提高Fmoc-Glu (OtBu) -OH的缩合率。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是: 其中，步骤2所述的纯化方法，将粗肽用水溶解后，I)第一次用C18柱纯化，纯化条件:流动相为=A相:0.1 %TFA ；B相:乙腈；梯度程序为:15 % B，60 min内至60 % B ;检测波长220 nm ;收集目的峰馏分；2)第二次用阴离子交换柱(UniDEAE-1O);流动相:A为缓冲液I溶液(10 mmol/L醋酸铵水溶液用稀氨水调节其pH值为7.30±0.20):乙腈=90:10 ；B为缓冲液II溶液(10 mmol/L醋酸铵+100 mmol/L氯化钠水溶液用醋酸调节其pH值为4.50±0.20):乙腈=90:10 ;梯度程序为:100 % A，60 min内至100 % B ;检测波长为220 nm ;收集目的峰馏分；3)脱盐条件:流动相:A相:20 mmol/L乙酸铵的水溶液:乙腈=95:5 ；Bff1:水:乙腈=95:5 ；Cff1:0.03 %醋酸的水溶液:乙腈=95:5 ；Dff1:0.03 %醋酸的水溶液:乙腈=50:50 ;梯度程序为:以流动相A等梯度洗脱15分钟，转换成流动相B等梯度洗脱10分钟，转换成流动相C等梯度洗脱10分钟，转换成流动相D等梯度洗脱25分钟；检测波长220 nm ;收集目的峰馏分；可以使des-Glu15，Glu16-艾塞那肽含量降低到0.1%以下，旋蒸浓缩，冻干得到艾塞那肽。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征是:
所述氨基树脂选自Rink amide AM树脂、Rink amide MBHA树脂、Sieber树脂；所述偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂选自DIC/H0Bt、PyB0P/H0Bt/DIEA或HATU/HOBt/DIEA ;所述反应溶剂选自DMF、DCM、NMP, DMSO或他们之间的组合。
【文档编号】C07K1/06GK103992401SQ201410179385
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年4月30日 优先权日:2014年4月30日
【发明者】路杨, 杨东晖, 陈晓航, 周亮 申请人:杭州诺泰制药技术有限公司