专利名称：一种从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法
技术领域：
本发明涉及属于中药制备技术领域，尤其涉及一种中药有效成分的提取纯化方法，特别是涉及一种熊总胆酸的提取纯化方法，具体涉及一种从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法。
背景技术：
熊胆是一种贵重中药材。熊胆粉为熊科动物黑熊(Selenarctos Thibetanus Cuvier)经胆囊手术引流胆汁得到的干燥品，采用天然熊胆汁或人工引流熊胆汁经干燥制备而成。为了保护动物资源，现在大多用熊胆粉作为熊胆的替代品。熊胆粉具有清热、利胆、平肝、强心、镇惊、明目杀虫功效。
熊胆粉含有胆汁酸类、胆色素类、氨基酸类等多种成分，其中胆汁酸类为其主要有效成分，有清热解毒、止咳化痰、利胆作用，多以牛磺酸或甘氨酸的结合物形式存在，水解后可得到多种游离胆汁酸，如熊去氧胆酸(UDCA)、鹅去氧胆酸(CDCA)、胆酸、去氧胆酸等，其中熊去氧胆酸含量最高，鹅去氧胆酸次之。此外，熊胆粉还含有水溶性蛋白质、氨基酸、无机盐等成分，这些成分无生理活性，仅起营养作用，也是产生吸潮的主要原因。另外，熊胆粉还含有脂溶性胆汁素，包括胆红素、胆黄素、胆固醇、脂肪、甾体类物质等成分，是腥味和黑色的来源，其生理活性也不强。因此，熊胆粉中的有效成分主要为以熊去氧胆酸为主的总胆酸，后两类成分因具有腥味，服后易产生恶心反胃的副作用而希望被除去。
参见图1，目前现有技术中，从熊胆粉中制备以熊去氧胆酸为主的熊总胆酸多采用直接水解法，其步骤包括加水溶解、加碱水解、加酸酸化、沉淀、醋酸乙酯提取得提取液，提取液再经过无水硫酸钠脱水，浓缩、冷藏、结晶、干燥等步骤得到熊总胆酸。由于水解前未经过除杂，导致在水解后进一步纯化中由于杂质较多(如色素类、脂肪类、杂蛋白、氨其酸等)使纯化效果不理想，最终结晶物收率低(8％左右)，总胆酸的纯度低(85％左右)。
综上所述，由于上述技术中存在的缺点，致使熊胆粉尚有待开发，其药效暂时未能得到充分发挥，且其副作用无法除去而使其应用受到限制。因此，有必要探索一种新的提取纯化方法，使这一珍贵药材充分发挥其作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法，以解决提取物得率和纯度低的问题。
为了解决上述技术问题，本发明可以通过以下技术方案来实现本发明提供一种从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法，该方法的反应式如下 其具体包括碱水解步骤、酸化步骤、提取步骤、浓缩步骤、结晶步骤；其特征在于，在碱水解步骤前增加一净化步骤，以除去蛋白质、脂肪、氨基酸、糖类、部分色素、无机盐等杂质；其净化步骤是取熊胆粉，加水并加热水解，水解液冷却至常温后过滤，过滤液通过大孔树脂柱，并水洗至流出液无色，弃去水洗液，再用醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，回收醇溶液至无醇味得熊胆粉稠膏。
本发明方法的特点为，熊胆粉的水溶液先通过大孔树脂柱吸附富集，水洗除去蛋白质、脂肪、氨基酸、糖类、部分色素、无机盐等杂质，再用醇洗下结合态的胆汁酸，所得到结合态的胆汁酸纯度很高，再用碱水解时，易水解完全、彻底，结晶时杂质干扰小，易于结晶析出，提高收率和含量，经验证其收率13％以上，总胆酸含量达95％以上。
图1为现有技术熊总胆酸制备工艺流程图。
图2为本发明高含量熊总胆酸制备工艺流程图。
具体实施例方式
一种从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法，该方法的反应式如下
参见图2，该方法具体步骤如下1、净化步骤取熊胆粉，加水并加热水解，水解液冷却至常温后过滤，过滤液通过大孔树脂柱，并水洗至流出液无色，弃去水洗液，再用醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，回收醇溶液至无醇味得熊胆粉稠膏。
3、碱水解步骤取熊胆粉稠膏加水稀释，稀释液加入药液量10wt％-20wt％的固体碱，搅拌溶解，并在加热水解后冷却至常温得水解液；4、酸化步骤所述水解液用酸调节PH值至酸性，得酸化液，过滤酸化液，得沉淀物；将沉淀物水洗至中性，低温干燥得干燥物；5、提取步骤干燥物置提取器中，加入醋酸乙酯，加热回流提取，过滤提取液，其不溶物再加入醋酸乙酯提取，合并两次醋酸乙酯提取液；6、浓缩步骤所得醋酸乙酯提取液，加入无水硫酸钠，搅拌均匀，放置脱水，滤过，滤液回收醋酸乙酯冷却至常温得浓缩物；7、结晶步骤将浓缩物至0-10℃环境下冷藏至结晶完全析出，所得结晶物在80℃以下干燥，即得熊总胆酸。
在本发明的方法中，其净化步骤主要是除去蛋白质、脂肪、氨基酸、糖类、部分色素、无机盐等杂质。在净化步骤中，一般都是采用纯化水、蒸馏水或注射用水来溶解熊胆粉，这主要是为了符合临床用药安全的需要。溶解时的用水量，主要是从滤液通过大孔树脂柱的速度来考虑，一般来说加水量为熊胆粉8wt-15wt倍量，其具体的用水量的选择，对于本领域技术人员来说，是比较容易进行选择的。为了提高溶解的速度，一般来说，在溶解的过程中，要加热，加热的温度为60～90℃，这样也可以提高溶解的速度。
在净化步骤中，过滤液通过大孔树脂柱时，一般是先用水洗脱，再用醇溶液洗脱，用水洗脱主要是洗去杂质，用醇溶液洗脱主要是回收熊胆粉。在用水洗脱时，用水量为柱床体积的2wt-5wt倍量，当然也可以减少或增加用水量，只要一直洗至流出液无色即可。选用的大孔树脂柱可以为多种型号，大孔树脂柱型号不同对收率和总胆酸含量有所影响。如选用D101型大孔树脂柱(5.5×30cm)，其收率14％，总胆酸含量97.3％。选用AB-8型大孔树脂，其收率13.2％，总胆酸含量为95.5％。选用HPD100型大孔树脂，其收率14.6％，总胆酸含量为98.0％。
在净化步骤中，醇溶液一般选用低碳醇溶液，如乙醇、丙醇、丁醇等，只要醇溶液不影响到熊胆粉且能完全溶解熊胆粉即可。但最好用乙醇，因为这样最经济。采用乙醇洗脱时用量一般为柱床体积的2wt-5wt倍量，乙醇溶液的浓度为50％-80％，当然也可以使用比较高浓度的乙醇溶液，如80％以上的乙醇溶液。而采用醇溶液主要是得到结合态的胆汁酸纯度很高。
在本发明的方法中，其碱水解步骤主要是使熊胆粉稠膏能水解完全和彻底。在碱水解步骤中，先用纯化水、蒸馏水或注射用水来溶解熊胆粉，将熊胆粉稠膏溶解稀释。溶解稀释后，再加入固体碱进行水解。固体碱一般选用固体氢氧化钠，当然也可以选用别的固体碱，只要选用碱能够对熊胆粉起到水解作用并符合制药要求且不对熊总胆酸有伤害即可。选用的固体氢氧化钠用量一般为药液量10wt％-20wt％。碱加入后，应该搅拌溶解充分。然后在加热状态下进行水解，水解过程中加热温度为100-125℃，水解时间为10-20小时，加热温度和水解时间的优化方案为100-110℃，16-20小时。至于具体的加热温度和水解时间的选择对于本领域技术人员来说是比较容易选择的。
水解完全后，冷却至常温后，进入到酸化步骤。在酸化步骤中，一般是采用盐酸来调节水解液的PH值至酸性，当然也可以用别的酸来调节，只要选用酸符合制药要求且不对熊总胆酸有伤害即可。在调节时，PH值一般在1-2之间。
在酸化步骤中，低温干燥的方法为本领域的常规技术，在此不作详细描述。
在提取步骤中，为了能吸附干燥物中的杂质和脱色，要在提取器加入吸附剂，一般来说，吸附剂选用活性炭比较合适。当然也可以选用别的吸附剂。活性炭的用量为干燥物的5wt％-15wt％。
提取时，一般要经过两次提取，第一次提取的醋酸乙酯用量为干燥物的4wt-6wt倍量。第二次提取的醋酸乙酯用量为不溶物的3wt-5wt倍量。第一次提取的加热温度为60-90℃，提取时间为1-2小时。第二次提取的时间为0.5-1小时。其中两次提取时的醋酸乙酯用量和提取时间的具体值的选择，对于本领域技术人员来说是非常容易就能选择的。
在浓缩步骤中，无水硫酸钠的用量醋酸乙酯提取液的1wt％-5wt％。脱水时间一般在12小时以上，滤液回收醋酸乙酯时，至干燥物的2wt-4wt倍量即可，以便获得比较好的效益。
以下通过实施例进一步说明本发明，但应理解，这些实施例只是示例性的，本发明并不局限此。
实施例1称取熊胆粉500g，加12倍量纯化水，稍加热，搅拌使溶解，放凉，滤过，滤液通过D101型大孔树脂柱(5.5×30cm)，用柱床体积4倍量的水约3000ml洗至流出液近无色，弃去水洗液，再用柱床体积4倍量70％乙醇3000ml洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇至无醇味，稠膏加水至熊胆粉8倍量4000ml，加入药液量15％的固体氢氧化钠600g，搅拌溶解，于110℃加热回流水解16小时，放凉，水解液用盐酸调节pH值1.5，滤过，取沉淀物，用水洗至中性，60℃干燥，得200g。将干燥物加入20g活性炭，再加5倍量的醋酸乙酯1000ml，加热回流提取1.5小时，滤取药液，不溶物再加4倍量醋酸乙酯提取40min，滤取药液，弃药渣；合并两次提取液，得1500ml，加入30g无水硫酸钠，充分搅拌，放置48小时脱水，滤过，滤液回收醋酸乙酯至600ml，放凉，冷藏(5℃)3天至结晶析出完全，60℃减压干燥，得70g，收率14％，总胆酸含量97.3％。
实施例2同实施例1，只是将D101型大孔树脂换成AB-8型大孔树脂，得66g，收率13.2％，总胆酸含量为95.5％。
实施例3同实施例1，只是将AB-8型大孔树脂换成HPD100型大孔树脂，得73g，收率14.6％，总胆酸含量为98.0％。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
权利要求
1.一种从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法，包括碱水解步骤、酸化步骤、提取步骤、浓缩步骤、结晶步骤；其特征在于，在碱水解步骤前增加一净化步骤。
2.根据权利要求1所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，所述净化步骤是取熊胆粉，加水并加热水解，水解液冷却至常温后过滤，过滤液通过大孔树脂柱，并水洗至流出液无色，弃去水洗液，再用醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，回收醇溶液至无醇味得熊胆粉稠膏。
3.根据权利要求2所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，所采用的水为纯化水、蒸馏水或注射用水。
4.根据权利要求2所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，溶解时的用水量为熊胆粉8wt-15wt倍量。
5.根据权利要求2所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，溶解时加热的温度为60～90℃。
6.根据权利要求2所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，在用水洗脱时，用水量为柱床体积的2wt-5wt倍量。
7.根据权利要求2所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，所述醇溶液为乙醇溶液。
8.根据权利要求7所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，所述乙醇洗脱时用量为柱床体积的2wt-5wt倍量。
9.根据权利要求8所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，所述乙醇溶液的浓度为50％-80％。
10.根据权利要求2所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，所述大孔树脂柱为D101型大孔树脂柱。
11.根据权利要求2所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，所述大孔树脂柱为AB-8型大孔树脂。
12.根据权利要求2所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，所述大孔树脂柱为HPD100型大孔树脂。
13.根据权利要求1所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，所述碱水解步骤是取熊胆粉稠膏加水稀释，稀释液加入药液量10wt％-20wt％的固体碱，搅拌溶解，并在加热水解后冷却至常温得水解液。
14.根据权利要求13所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，所用水为纯化水、蒸馏水或注射用水。
15.根据权利要求13所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，所述固体碱为固体氢氧化钠。
16.根据权利要求15所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，选用的固体氢氧化钠用量一般为药液量10wt％-20wt％。
17.根据权利要求13所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，所述加热温度为100-125℃，水解时间为10-20小时。
18.根据权利要求13所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，所述加热温度为加热温度为100-110℃，水解时间为16-20小时。
19.根据权利要求1所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，所述酸化步骤是将水解液用酸调节PH值至酸性，得酸化液，过滤酸化液，得沉淀物；将沉淀物水洗至中性，低温干燥得干燥物。
20.根据权利要求19所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，所述酸采用盐酸。
21.根据权利要求19所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，所述PH值在1-2之间。
22.根据权利要求1所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，所述提取步骤是将干燥物置提取器中，加入醋酸乙酯，加热回流提取，过滤提取液，其不溶物再加入醋酸乙酯提取，合并两次醋酸乙酯提取液。
23.根据权利要求22所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，在所述提取器加入吸附剂。
24.根据权利要求23所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，所述吸附剂选用活性炭。
25.根据权利要求24所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，所述活性炭的用量为干燥物的5wt％-15wt％。
26.根据权利要求22所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，第一次提取的醋酸乙酯用量为干燥物的4wt-6wt倍量。
27.根据权利要求22所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，第二次提取的醋酸乙酯用量为不溶物的3wt-5wt倍量。
28.根据权利要求22所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，第一次提取的加热温度为60-90℃，提取时间为1-2小时。
29.根据权利要求22所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，第二次提取的时间为0.5-1小时。
30.根据权利要求1所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，所述浓缩步骤是将所得醋酸乙酯提取液，加入无水硫酸钠，搅拌均匀，放置脱水，滤过，滤液回收醋酸乙酯冷却至常温得浓缩物。
31.根据权利要求30所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，所述无水硫酸钠的用量醋酸乙酯提取液的1wt％5wt％。
32.根据权利要求30所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，所述脱水时间一般在12小时以上。
33.根据权利要求30所述的从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法；其特征在于，所述滤液回收醋酸乙酯至干燥物的2wt-4wt倍量。
全文摘要
一种从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法，包括碱水解、酸化、提取、浓缩、结晶等步骤；其特征在于，在碱水解步骤前增加一净化步骤，其净化步骤是取熊胆粉，加水并加热水解，水解液冷却至常温后过滤，过滤液通过大孔树脂柱，并水洗至流出液无色，弃去水洗液，再用醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，回收醇溶液至无醇味得熊胆粉稠膏。本发明的特点为将熊胆粉的水溶液先通过大孔树脂柱吸附富集，水洗除去蛋白质、脂肪、氨基酸、糖类、部分色素、无机盐等杂质，再用醇洗下结合态的胆汁酸，所得到结合态的胆汁酸纯度很高，再用碱水解时，易水解完全、彻底，结晶时杂质干扰小，易于结晶析出，提高收率和含量，经验证其收率13％以上，总胆酸含量达95％以上。
文档编号C07J75/00GK101085801SQ200610027330
公开日2007年12月12日 申请日期2006年6月6日 优先权日2006年6月6日
发明者薛东升 申请人:上海凯宝药业有限公司