专利名称：从连翘提取物中纯化连翘酯苷a的方法
技术领域：
本发明涉及一种中药连翘提取物的纯化方法，属于医药技术领域。
背景技术：
连翘(Fructus Forsythiae)为木犀科连翘属植物。在我国传统古方中，常用连翘的果实入药，与其它清热解毒类药物共同使用，起到清热解毒、散结消肿的作用，为2000年版《中国药典》收载的常用中药。国内外学者对连翘化学成分及药理研究较多，已经认识到连翘的抗菌抗病毒活性非常显著。其主要的抗菌抗病毒活性成分是连翘酯苷，而连翘酯苷中几乎全部是连翘酯苷A在起作用，它对金黄色葡萄球菌等十一种致病菌均有极强的抑制作用，还具有很强的抗真菌、抗病毒的作用。以前是以连翘苷作为考察连翘提取工艺的指标，近年来随着连翘的有效成分研究深入发现连翘苷无抗菌活性。从而已逐渐将连翘酯苷A作为连翘药材质量评价的标准，在中成药中用作控制产品质量的指标。连翘酯苷A的结构式如下 文献中也记载了一些连翘酯苷A的制备方法。如采用聚酰胺加压柱色谱法进行初步分离，再用葡聚糖凝胶柱纯化，用甲醇及水系统洗脱，或者用水、不同浓度的甲醇、乙醇溶液为溶剂，进行超声提取等方法。但是文献中反复提到了一个问题就是连翘的抗菌活性成分极不稳定，其中的连翘酯苷A为咖啡酸的衍生物，分子结构中具有酯键和糖苷键，在酸、碱和高温条件下容易分解，而分解后产生的咖啡酸、D-葡萄糖、L-鼠李糖和一次级苷的抗菌活性大大减弱。由于以前未能注意到此问题，所以银翘解毒丸、银翘解毒片等成药只检出咖啡酸，而连翘酯苷A可能在加工过程中已发生了水解。因此现有技术为避免连翘酯苷A的水解，均要控制温度，避免接触强酸强碱，这在很大程度上，局限了连翘酯苷A的提取工艺，降低了提取效率。
发明人经过反复研究，总结了一种能够保持连翘提取物抗菌活性的高温提取方法，并申请了专利，申请号为200510030815.5。该专利所提的提取物，是一种连翘的总酚类物质，而此类物质的抗菌抗病毒活性比连翘酯苷A逊色，但是可以通过对连翘总酚类提取物进行纯化分离，进而得到大量的连翘酯苷A。
发明内容
本发明的目的就是提供一种从连翘提取物，主要是连翘总酚类物质中进一步分离纯化得到连翘酯苷A的方法。
本发明是从连翘总酚类物质中纯化出连翘酯苷A的方法。连翘总酚类物质的获得可以有很多方法，比如热提法用水提取连翘原材料，滤过，减压浓缩，加入硅藻土搅拌；再用70-80％乙醇超声提取晾干后的硅藻土，合并醇提液，或用70-80％乙醇及水洗脱；上大孔树脂，水洗脱、乙醇解吸附，收集乙醇溶液，减压浓缩，得连翘提取物。
冷提法用8倍50％甲醇冷浸连翘原材料，过夜，超声提取20min，收集醇溶液，减压干燥，即得连翘提取物。
所说的连翘原材料是包括连翘的果实、叶子、种子等连翘植物的一部分或全部。
实现本发明的技术方案为将连翘提取物上粗硅胶柱，用乙酸乙酯-丙酮-水或乙酸乙酯-C1-C5低级醇-水或氯仿-C1-C5低级醇-水为流动相进行洗脱，比例为9-1∶0.5-5∶5-0.5，收集流份，减压浓缩至干，残渣经薄层硅胶柱层析，以乙酸乙酯-丙酮-水或乙酸乙酯-C1-C5低级醇-水或氯仿-C1-C5低级醇-水为流动相洗脱，比例为9-1∶0.5-5∶5-0.5，收集流份，减压浓缩至干，残渣再经反相硅胶柱纯化，甲醇-水洗脱，比例为1-4∶6-9，收集流份，减压浓缩至干，真空干燥即得。
优选地，本发明的技术方案为将连翘提取物上粗硅胶柱，用流动相乙酸乙酯-丙酮-水为流动相进行洗脱，比例为8∶2∶0.5，收集流份，减压浓缩至干，残渣经薄层硅胶柱层析，以流动相乙酸乙酯-丙酮-水为流动相进行洗脱，比例为8∶2∶0.5，收集流份，减压浓缩至干，残渣再经反相硅胶柱纯化，甲醇-水洗脱，比例为3∶7，收集流份，减压浓缩至干，真空干燥即得。
发明的优点1.提取的效率大大提高，能，够更好地节约利用原材料，得到高纯度的连翘酯苷A；2.进行连翘原材料的复方提取；3.不用受到现有技术所说的必需“控制温度”的限制。
连翘酯苷A纯度检测高效液相色谱图具体实施方式
实施例1取连翘提取物，拌样后上100目硅胶柱，以乙酸乙酯-丙酮-水(8∶2∶0.5)为流动相洗脱，每个流份收集100ml，合并13-21流份，减压浓缩至干，残渣经薄层硅胶柱层析，以乙酸乙酯-丙酮-水(8∶2∶0.5)为流动相洗脱，每个流份收集10ml，合并5-15流份，减压浓缩至干，残渣经RP-18硅胶柱纯化，甲醇-水(3∶7)洗脱，每个流份收集10ml，合并47-49流份，减压浓缩至干，真空干燥，即得连翘酯苷A。
实施例2取连翘提取物，拌样后上200目硅胶柱，以乙酸乙酯-甲醇-水(7∶2∶1)为流动相洗脱，每个流份收集100ml，合并12-21流份，减压浓缩至干，残渣经薄层硅胶柱层析，以乙酸乙酯-甲醇-水(7∶2∶1)为流动相洗脱，每个流份收集10ml，合并6-15流份，减压浓缩至干，残渣经RP-18硅胶柱纯化，甲醇-水(2∶8)洗脱，每个流份收集10ml，合并47-49流份，减压浓缩至干，真空干燥，即得连翘酯苷A。
实施例3取连翘提取物，拌样后上200目硅胶柱，以氯仿-甲醇-水(5∶2.5∶2.5)为流动相洗脱，每个流份收集100ml，合并12-21流份，减压浓缩至干，残渣经薄层硅胶柱层析，以氯仿-甲醇-水(5∶2.5∶2.5)为流动相洗脱，每个流份收集10ml，合并6-15流份，减压浓缩至干，残渣经RP-18硅胶柱纯化，甲醇-水(2∶8)洗脱，每个流份收集10ml，合并47-49流份，减压浓缩至干，真空干燥，即得连翘酯苷A。
连翘酯苷A的鉴别精密称取按实施例方法制得的连翘酯苷A适量，加甲醇制成每1ml含连翘酯苷A0.62mg的溶液；精确吸取上述溶液40μl，点于硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-水(8∶2∶0.5)为展开剂，展开，展距8cm，取出，晾干；喷以10％的硫酸乙醇溶液，晾干，在105℃加热至斑点显色清晰，Rf值为0.40；所用薄层板上无其它斑点显出连翘酯苷A纯度检查照高效液相色谱法(《中华人民共和国药典)》2005版一部附录VID)测定色谱条件与系统适用性试验十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-水-冰醋酸(33∶67∶0.2)为流动相；检测波长290nm；流速1.0ml/min；柱温25℃。理论塔板数按连翘酯苷A峰计算不少于8000。
对照品溶液的制备取连翘酯苷A对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含连翘酯苷A0.03943mg的溶液，摇匀，即得。
测定法精密吸取对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定结果见表13-1。
表13-1连翘酯苷A对照品纯度检查数据
附液相图谱对照品的波谱数据及解析1UVmax(MeOH/H2O1∶1)220，292，336nm。
2IR(KBr)vmax3400(OH)，1697(共轭羰基)，1605(碳碳双键)，1522，1283，1159，1059，980，812cm-1。
3ESIMS623[M-H]-41H-NMR(CD3OD，400MHz)δ7.59(1H，d，J＝16.0Hz，H-7’)，7.0(1H，d，J＝2.0Hz，H-2’)，6.96(1H，dd，J＝8.2，2.0Hz，H-6’)，6.78(1H，d，J＝8.2Hz，H-5’)，6.68(1H，d，J＝8.2Hz，H-3)，6.57(1H，dd，J＝8.2，2.0Hz，H-2)，6.29(1H，d，J＝16.0Hz，H-8’)，4.63(1H，d，J＝1.6Hz，H-1)，4.36(1H，d，J＝7.8Hz，H-1”)，3.26-4.01(11H，m)，2.80(2H，m，H2-7)，1.19(3H，d，J＝6.3Hz，Me-6)。
513C-NMR(CD3OD，100MHz)δ168.8(C-9)，150.2(C-4’)，148.1(C-3’)，147.3(C-7’)，146.6(C-3)，145.2(C-4)，131.9(C-1)，128.2(C-1’)，123.6(C-6’)，121.8(C-6)，117.6(C-5)，117.0(C-5’)，116.8(C-2)，115.7(C-2’)，115.2(C-4)，105.0(C-1”)，102.8(C-1)，76.3(C-3”)，75.7(C-2”)，75.3(C-4”)，74.4(C-5)，72.9(C-8)，72.8(C-4)，72.8(C-3)，72.5(C-2)，70.4(C-5)，68.2(C-6”)，37.2(C-7)，18.5(C-6)。
权利要求
1.从连翘提取物中纯化连翘酯苷A的方法，其特征在于将连翘提取物上粗硅胶柱，用乙酸乙酯-丙酮-水或乙酸乙酯-C1-C5低级醇-水或氯仿-C1-C5低级醇-水为流动相进行洗脱，比例为9-1∶0.5-5∶5-0.5，收集流份，减压浓缩至干，残渣经薄层硅胶柱层析，以乙酸乙酯-丙酮-水或乙酸乙酯-C1-C5低级醇-水或氯仿-C1-C5低级醇-水为流动相洗脱，比例为9-1∶0.5-5∶5-0.5，收集流份，减压浓缩至干，残渣再经反相硅胶柱纯化，甲醇-水洗脱，比例为1-4∶6-9，收集流份，减压浓缩至干，真空干燥即得。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于将连翘提取物上粗硅胶柱，用流动相乙酸乙酯-丙酮-水为流动相进行洗脱，比例为8∶2∶0.5，收集流份，减压浓缩至干，残渣经薄层硅胶柱层析，以流动相乙酸乙酯-丙酮-水为流动相进行洗脱，比例为8∶2∶0.5，收集流份，减压浓缩至干，残渣再经反相硅胶柱纯化，甲醇-水洗脱，比例为3∶7，收集流份，减压浓缩至干，真空干燥即得。
全文摘要
本发明涉及一种从连翘提取物中纯化得到连翘酯苷A的方法。具体的说是从连翘总酚类物质中进一步的纯化，使得提取的效率大大提高，能够更好地节约利用原材料，得到高纯度的连翘酯苷A。
文档编号C07H1/08GK101081855SQ20061002702
公开日2007年12月5日 申请日期2006年5月29日 优先权日2006年5月29日
发明者玄振玉, 王勇, 黄孝春, 于莉, 林君 申请人:上海玉森新药开发有限公司