高纯度连翘酯苷在制备抑菌、抗病毒及其它药物中的应用的制作方法

专利名称：：高纯度连翘酯苷在制备抑菌、抗病毒及其它药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属中药制药领域，涉及高纯度连翘酯苷有效成分在制备解热、抗炎、提高免疫力、抑菌、抗病毒药物中的用途。
背景技术：
：连翘酯苷(ForsythosideA)是从木犀科连翘属植物连翘(FructusForsythiae)中提取的有效成分。以前是以连翘苷作为考察连翘提取工艺的指标，近年来随着连翘有效成分研究的深入，发现连翘苷无抗菌活性，发挥抗菌活性的是连翘酯苷。而连翘酯苷中几乎全部是连翘酯苷A在起作用，但是连翘酯苷A又很难单独稳定存在，因此在习惯上，常把含有连翘酯苷A的连翘酯苷类有效成分称作连翘酯苷。连翘酯苷(A)的结构式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>文献中提到连翘酯苷为咖啡酸的衍生物，分子结构中具有酯键和糖苷键，在酸、碱和高温条件下容易分解，而分解后产生的咖啡酸、D-葡萄糖、L-鼠李糖和一次级苷的抗菌活性大大减弱。由于以前未能注意到此问题，所以银翘解毒丸、银翘解毒片等成药只检出咖啡酸，而连翘酯苷(A)可能在加工过程中已发生了水解。发明人经过反复研究，认为如果能够把连翘酯苷最大程度分离出来，得到高纯度的连翘酯苷有效成分，必将发挥更好的药理药效作用，其抗菌抗病毒的疗效也将增强。在以往的技术研究中，发明人已经获得了提取高纯度连翘酯苷的工艺方法，并已申报多项中国发明专利如CN200610027024.1、CN200610027036.4、CN200610027037.9、CN200510030815.5、CN200610148179.0。以上专利技术可以使连翘酯苷有效成分纯度达到90%以上。但是目前没有现有技术对这种高纯度连翘酯苷的抑菌抗病毒、解热抗炎药理活性进行过研究。
发明内容本发明的目的是提供高纯度连翘酯苷在制药中的用途，具体涉及高纯度连翘酯苷在制备抑菌、抗病毒、解热、抗炎药物中的用途。本发明所涉及的高纯度连翘酯苷是用各种方法从连翘属植物中提取的、纯度在90%以上的连翘酯苷单体。本发明通过下述技术方案施行(l)采用2，4-二硝基苯酚致热大鼠及细菌内毒素致热大鼠造模，观察高纯度连翘酯苷的退热作用；(2)采用小鼠耳肿胀法和对小鼠毛细管通透性影响的试验观察高纯度连翘酯苷的抗炎作用；(3)采用小鼠炭廓清能力的影响试验及小鼠淋巴细胞转化试验，观察高纯度连翘酯苷对免疫功能的影响；(4)选择呼吸系统常见病毒病原包括流感乙型病毒、单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇B-3病毒，进行高纯度连翘酯苷的体外抗病毒试验；(5)选择呼吸系统常见病原菌包括肺炎克雷柏、溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念珠菌，进行高纯度连翘酯苷体外抑菌试验；(6)用小鼠呼吸道合孢病毒感染性支气管炎、肺泡炎疗效模型，进行高纯度连翘酯苷的体内抗病毒试验。结果证明(1)高纯度连翘酯苷对2，4-二硝基苯酚致热大鼠及细菌内毒素致热家兔均有较好的退热作用；(2)高纯度连翘酯苷具有抑制二甲苯致小鼠耳肿胀的作用，对醋酸致小鼠毛细管通透性增高也有较好的抑制作用；(3)高纯度连翘酯苷能较好的增加小鼠炭廓清能力，增加淋巴细胞转化率，提示对免疫功能有一定增强作用；(4)高纯度连翘酯苷体外有抗病毒作用；(5)高纯度连翘酯苷体外有抑制溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、草绿色链球菌和表皮葡萄球菌的作用；(6)高纯度连翘酯苷可使模型鼠肺组织病毒含量减少，减轻炎性损害程度、增加脾指数和胸腺指数。本发明的有益效果突出体现在(1)高纯度连翘酯苷在连翘属植物中含量高且易提取，其抗菌抗病毒提高免疫力作用显著，未见急性、长期毒性，将其进一步开发应用于治疗感染性疾病、发热性、炎症性疾病的药物，縮短疾病周期，改善症状具有重要意义。(2)病毒感染可以造成脾指数和胸腺指数降低，导致机体免疫力下降，而高纯度连翘酯苷用于干预治疗，显示连翘酯苷对感染引起的脾指数、胸腺指数降低有显著的调节作用，具有增强了免疫力功能，更有利于病毒的清除。(3)高纯度连翘酯苷显示在体内对呼吸道合胞病毒有良好的抑制作用。此病毒是引起呼吸系统感染的重要病原。将高纯度连翘酯苷用于呼吸道合胞病毒感染性支气管、肺泡炎模型，结果显示连翘酯苷可以抑制呼吸道合胞病毒在动物肺组织的增殖，减轻病毒引起的肺组织损伤,使动物免于呼吸道合胞病毒感染性肺炎，并呈良好的量效关系。(4)高纯度连翘酯苷的解热抗炎、抑菌抗病毒作用比低纯度连翘酯苷好，高纯度连翘酯苷还有低纯度连翘酯苷所没有的提高免疫力的作用。具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。实施例1(解热、抗炎)l.l实验目的观察高纯度连翘酯苷在解热、抗炎方面的用途。1.2实验材料1.2.1药品受试药物高纯度连翘酯苷为连翘有效成分提取物；纯度〉90%;上海玉森新药开发有限公司提供。理化性质本品为黄色粉末。保存条件4°C,避光保存。批号060425。试验设三个剂量组(以下简称高纯度组)。①大鼠给药配制方法按10ml/(kg尾静脉注射给药，低、中、高剂量组分别相当于临床日用量的3、6、12倍；②小鼠给药配制方法按10ral/(kg*d)给药，低、中、高剂量组分别相当于临床日用量的5、10、20倍。阳性对照药物双黄连注射液(以下简称双黄连)，黑龙江多多药业责任有限公司，批号:2005091512，试验时给药剂量大鼠为相当于临床日服剂量的6倍；小鼠为相当于临床日用剂量的10倍。连翘酯苷粗提药物(以下简称粗提物组)经HPLC测定，纯度低于90%。试验时给药剂量大鼠为相当于临床曰服剂量的6倍；小鼠为相当于临床日用剂量的10倍。1.2.2动物KM小鼠，雌雄各半，体重1822g，SPF级。SD大鼠，体重18(T220g，清洁级。1.2.3仪器塞多利斯BS124S电子天平、分光光度计。1.2.4试剂2，4-二硝基苯酚、二甲苯、冰醋酸、印度墨汁。.1.3数据处理采用组间T检验，以^士s表示。1.4方法及结果1.4.12，4-二硝基苯酚致热大鼠解热试验分组雄性大鼠200土20g，用水银体温计测正常体温，每日2次，连续3天。试验前每小时测体温一次，连续2次，选取体温在37.338.6。C之间者随机分6组，每组10只，即NS对照组、双黄连对照组、粗提物组、高纯度低、中、高剂量组，取其均值作为基础体温。造模大鼠给药后，立即背部皮下注射临时配制的1.5mg/ml2，4-二硝基苯酚10ml/kg，测量并记录O.5、1、1.5、2、3、4小时动物体温。结果显示，给药后0.5h,高纯度中、高剂量组与NS对照组比较即出现显著性差异(P〈0.05)，给药后lh~3h，高纯度低、中、高剂量组与NS对照组比较均出现不同程度显著性差异(P<0.05，P〈0.01);粗提物组给药12小时与NS对照组比较均出现不同程度差异(P〈0.05，P<0.01)，与高纯度组相比，起效慢，解热维持时间短。结果见表l.1。表i.i2，4-二硝基苯酚致热大鼠解热试验给药后各时相体温变化rc^土s)组别药前2次给药后各时相体温差值体温均值0.5hlh1.5h2h3h4hNS纟且38.19±0.250.77±0.131.47±0.261.45±0.261.37±0.221.12±0,230.68±0.253又黄连对38.18±0.280.51±0.26*0.81±0.28**0.84±0.28**0.64±0.32林0.59±0.21**0.47±0.20照组粗提物组38.17±0.140.74±0.121.OO士O.12**1.20±0.24*1.12±0.27*1,05±0.140.67±0.22高纯度低38.29±0.330.62±0.281.17±0.23*1.12±0.38*0.97±0.34**0.89±0.310.62±0.29剂量组高纯度中38.15±0.250,56±0.22*1.02±0.23林0.82±0.28林0.78±0.28林0.56±0.30料0.46±0.28剂量组高纯度高38.25土0.220.55±0.23*1.06±0.18**1.06±0.17**0.83±0.34**0,59±0.37**0,41±0.32剂量组_注与NS组比较，*P〈0.05，**P<0.011.4.2细菌内毒素致热大鼠的解热试验内毒素溶液的配制取定量内毒素标准管一只，用注射用生理盐水溶液稀释至lOeu/ml,现用现配。分组同1.4.1。造模静脉注射给药后lh，每只动物静脉注射细菌内毒素lml/kg(10eu/ml)，于内毒素攻击后l、1.5、2、3及4h各测体温l次。结果显示，与NS对照组比较，高纯度高剂量组及双黄对照组给药0.5h后即出现显著性差异(P<0.01)，给药lh至4h，高纯度中、高剂量组及双黄对照组与NS对照组比较均出现不同程度显著性差异(P<0.05、P<0.01);高纯度低剂量组给药1.5h至4h与NS对照组出现极显著性差异(P〈0.Ol);粗提物组给药1.5h和2h与NS对照组比较出现显著性差异(P〈0.05)。结果见表1.2:表1.2细菌内毒素致热大鼠的解热试验给药后各时相体温变化('C，X±s)_药前2次给药后各时相体温差值组别-体温均值0.5hlh1.5h2h3h4hNS组38.2±0.310.30±0.180.67±0.241.06±0.241.20±0.301.13±0.340.69±0.42双黄连对38.2±0.280.12±0.14*0.36土0.20**0.35±0.15**0.44±0.19**0.37±0.29林0.23±0,22**照组粗提物组38.1±0.240.240±0.110.49±0.260.61±0.15**0.54±0.13**0.82±0.200.70±0.22高纯度低38.3±0.330.18±0.130.53±0.300.62±0.33**0.67±0.23**0.58±0.19**0.41±0.23**剂量组高纯度中一38.2±0.250.16±0.160.32±0.24**0.43±0.27**0.59±0.15**0.56±0.26林0.47±0.24*剂量组高纯度高38.3±0.220.13±0,14*0.21±0.20**0.32±0,25林0.41±0.39**0.27±0.24**0.29±0.30**剂量组注与NS组比较，*P<0.05,**P<0.011.4.3高纯度连翘酯苷对二甲苯致小鼠耳肿胀的作用分组同1.4.1造模10ml/kg连续静脉给药4天，末次给药后30min每只小鼠左耳涂二甲苯50ul，右耳作空白对照，致炎15min后将小鼠脱颈椎处死，剪下两耳，用打孔器(直径7腦)分别在两耳同一部位打下耳片，称重，计算肿胀度和肿胀抑制率。公式肿胀度=左耳片重量_右耳片重量空白对照组耳肿胀度一给药组耳肿胀度肿胀抑制率=-X100%空白对照组耳肿胀度结果显示，NS组小鼠左耳红肿，耳肿胀度高达0.0145土0.0037g，而高纯度连翘酯苷高、中、低剂量组小鼠及双黄连对照组的耳肿胀度均小于NS对照组，且与NS组比较中剂量有不同的显著性差异(P〈0.05，P〈0.01);连翘酯苷粗提物组与NS组比较无显著性差异。结果见表丄.3:表1.3连翘酯苷对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注与NS组比较，*P〈0.05,**P〈0.011.4.4高纯度连翘酯苷对小鼠血管通透性影响的实验取体重18-22g小鼠，分组同1.4.1。动物给药后lh尾静脉注射0.5%伊文思蓝生理盐水溶液0.lml/10g体重，随即腹腔注射0.6y。醋酸0.20ml/只，20min后脱颈椎处死，剪开腹部皮肤肌肉，用6ml生理盐水分3次洗涤腹腔，吸管吸出洗涤液、合并后加入生理盐水至10ral，3000rpm离心15min;取上清液与590nm比色测定，记录OD值进行统计分析。结果显示，高纯度中、高剂量组与NS组比较有显著性差异(P〈0.05)，低剂量组无显著性差异(p>0.05)，双黄连对照组与NS组比较有显著性差异(P〈0.05);粗提物组与NS组比较无差异(P〉0.05)。结果见表1.4。表1.4连翘酯苷对腹腔注射醋酸致小鼠腹腔毛细管通透性增高的影响(^土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注与NS组比较，*P<0.05，**P<0.-011.5结论高纯度连翘酯苷对2，4-二硝基苯酚致热大鼠及大肠杆菌内毒素致热家兔均有较好的退热作用；高纯度连翘酯苷具有抑制二甲苯致小鼠耳肿胀的作用，对醋酸致小鼠毛细管通透性增加也有较好的抑制作用。而粗提物有一定退热作用，但是效果不如高纯度连翘酯苷好；且对二甲苯致小鼠耳肿胀、醋酸致小鼠毛细管通透性增加没有抑制作用实施例2(增强免疫力试验)2.l实验目的观察高纯度连翘酯苷在增强免疫力方面的用途。2.2实验材料同实施例1中的1.2实验材料2.3数据处理同1.3。2.4方法及结果2.4.1高纯度连翘酯苷对小鼠碳廓清能力的影响分组同1.4.1。10ml/kg连续尾静脉注射给药l周，取各组小鼠，分别经尾静注射20%印度墨汁0.lml，于注射后1分钟和5分钟各采血20ul置2ml0.l%Na2C03溶液中混匀，于680nm下测定OD值，并按下式计算K值。公式K=(logODl-1ogOD5)/(t5-tl)结果显示，高纯度高剂量组与NS组比较有极显著性差异(P<0.01)，低、中剂量组无显著性差异(P〉0.05);粗提物组与NS组比较无显著性差异(P〉0.05);双黄连对照组与NS组比较有显著性差异(P〈0.05)。结果见表2.1。表2.l连翘酯苷对碳廓清能力的影响(^士s)组别n体重K值NS组1021.8±1.150.0950±0.0320双黄连对照组1021.3±1.%0.0604±0.0399*粗提物组1021.6±1.560.0850±0.0270高纯度低剂量组1021.4±1.530.0767±0.0464高纯度中剂量组1021.4±1.280.0730±0.0288高纯度高剂量组1021.8±0.910.0577±0.0235**注与NS组比较，*P<0.05，**P<0.012.4.2淋巴细胞转化试验分组同1.4.1，每组12只。于给药的前3d，每鼠均加肌注植物血凝素(PHA)8mg/kgd，连续给药8天，于最后l次给药后2h，小鼠剪尾取血，推片，瑞氏染色，油镜观察，计算外周血淋巴细胞转化率。公式转化细胞数淋巴细胞转化率％=-X100%转化细胞数+未转化细胞数结果显示，高纯度低、中、高剂量组及双黄连对照组与NS组比较均有极显著性差异(P〈0.01);粗提物组与NS组比较无显著性差异(P〉0.05)，结果见表2.2表2.2连翘酯苷对PHA致小鼠淋巴细胞转化的影响(^土s)组别n体重(g)转化率(％)NS组1227.2±2.443.5±11.2双黄连对照组1228.0±2.568.8±8.1**粗提物组1227.1±2.248.5±10.7高纯度低剂量组1226.8±2.365.1±14.6**高纯度中剂量组1227.9±2.176.3±12.0**高纯度高剂量组1227.1±2.178.5±11.6**注与NS组比较，*P〈0.05,**P〈0.012.5结论本实验结果表明，高纯度连翘酯苷能较好的增加小鼠炭廓清能力，抑制PHA对小鼠淋巴细胞的转化，具有增强免疫抵抗力的作用；而连翘酯苷粗提物没有这个作用。实施例3(体外抗病毒试验)3.1病毒增殖将流感甲型接种MDCK细胞上，加维持液置37。C、5%0)2培养，在96h后出现90%以上的病变，冻融3次后吹打离心，定量分装，-8(TC冰箱冻存备用。3.2病毒毒力测定将备用流感病毒甲型病毒用维持液做10倍比系列稀释，纵向重复3孔，横向依次接种在96孔板内的单层细胞上，37°C、5免C02培养，每日观察病变，48-恥h后，将板孔内液体吸弃，加W中性红100ul置37'C染色2h，弃染液，用洗液将多余染料充分洗脱，加脱色液100ul，室温脱色10min，用酶标仪在540nm波长测定0D值，用公式1、2计算细胞病变率，然后公式3计算比距，比距与高于50%的病变率病毒稀释度指数相加，获得TCID50(Reed-Muench方法)。结果流感甲型TCID50为10-3/ml。细胞存活率八各组OD值-空白对照OD值)/(正常细胞OD值-空白对照OD值)(公式l)细胞病变率=1-细胞存活率.............."…(公式2)细胞比距=(高于50%病变率-50%)/(高于50%病变率-低于50%病变率)…(公式3)3.3药物细胞毒性测定将药物用细胞培养液l:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560稀释，接种于多孔板中已经长成单层的MDCK细胞上，37°C、5。/。C02培养，每日观察细胞病变，连续7d观察药物毒性，细胞出现病变者判为药物毒性，并根据公式l、2计算药物半数中毒浓度，结果见表3，1。表3.1药物毒性试验(半数中毒浓度IC50(mg/ml))<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>从表3.2看出，三种药物对流甲有一定抑制效果，连翘酯苷抑制流感甲型病毒的抑制指数为13.8，略高于感冒退热颗粒，但略低于利巴韦林。3.5结论与评价连翘酯苷可以抑制流感甲型病毒在MDCK细胞上的繁殖，抑毒指数为13.8，略高于感冒退热颗粒，但略低于利巴韦林。综上所述，在体外连翘酯苷对流感甲型病毒具有一定的抑制作用。实施例4(体内抗病毒试验)4.1实验材料实验动物昆明种鼠，雄性，体重1314g，洁净级。受试药物高纯度连翘酯苷由上海玉森新药开发有限公司提供，批号分别为060425，连翘酯苷纯度90%。阳性对照药利巴韦林注射液产地山东省鲁抗辰欣药业有限公司批号国药准字H20003176。病毒株呼吸道合胞病毒(Long株)。细胞株HEL:人胚肺细胞，为呼吸道合胞病毒宿主细胞株；H印-2:人喉癌细胞系，为呼吸道合胞病毒宿主细胞株。培养液PH7.2的磷酸盐生理盐水(PBS):含NaCL8g、KCL0.2g、KH2P040.2g、Na2HP042.9g，加双蒸水至1000ml，除菌过滤，分装置4'C备用。细胞消化液胰酶(Diffico公司产品)1.25g用1000mlPBS溶解，除菌过滤，分装青霉素瓶，置-2(TC冰箱备用。仪器C02恒温培养箱；分光光度计；恒温培养箱；净化工作台；离心机；-8(TC冰箱；_20°C冰箱；酶标仪；722分光光度计。实验室P2实验室。4.2试验方法与结果4.2.l细胞复苏传代将液氮冻存的H印-2、服L细胞在37'C水浴lmin内迅速融化，悬浮于培养液中，于细胞培养瓶中37'C、5%<:02静止培养，3d后长成单层，用0.25%胰酶消化，1:3(HEL细胞1:2)传代，细胞长成单层时用于试验。4.2.2病毒活化和传代将冻干保存的呼吸道合胞病毒毒种0.5ml接种于已经长成单层的H印-2细胞上，37'C、5%0)2培养，3-5d后出现细胞病变，用同样方法将病毒传代扩增。收获的病毒冻融3次、吹打离心(10000r/min，20min)、定量分装、-8(TC冰箱冻存备用。4.2.3病毒毒力测定制备多孔板内单层细胞备用。用维持液将病毒液做10倍比系列稀释，纵向重复3孔，横向依次接种在96孔板内单层细胞上，37°C、5。/。C02培养，显微镜下观察细胞病变和病变率，公式1计算比距，比距与低于50%的病变率病毒稀释度指数相加，获得TCID50。结果见表4.1。细胞比距=(高于50%病变率-50%)/(高于50%病变率-低于50%病变率)……公式(1)表4.1:病毒毒力测定(TCID50/ml)24h48h呼吸道合胞病毒10-5.610-8.8由表1看出，呼吸道合胞病毒24hTCID50为10-5.6;48hTCID50为10-8.8。4.2.4体内疗效模型的建立和病毒感染剂量的确定昆明种小鼠40只，雄性，体重1314g，随机分为4组，每组10只，分别为病毒大剂量组、病毒中剂量组、病毒小剂量组和正常对照组。各组动物乙醚麻醉下分别鼻腔接种上述呼吸道合胞病毒毒液50ui1、30ul、10ul和细胞培养液50"1，常规喂养，每日观察动物存活情况，死亡动物及时解剖。在第7d末次给药40min后，将动物眼动脉丛放血，牵颈臼处死，无菌取肺组织。结果见表4.2:表4.2病毒重分离结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>从上述结果和上表可以看出，接种50y1病毒为造模最适剂量。4.2.5体内抗病毒药效学试验昆明种鼠70只，雄性，体重1314g。将动物按体重随机分为7组正常对照组、病毒模型对照组、利巴韦林对照组和高纯度连翘酯苷大、中、小剂量组，连翘酯苷粗提物组，每组10只。各组动物经尾静脉注射给药(给药剂量见表4.3)3天后，各组动物在乙醚麻醉下造模，正常组动物鼻腔接种细胞培养液50"1，其余动物均鼻腔接种呼吸道合胞病毒毒液50u1，各组动物继续按表4.3剂量尾静脉注射给药7天。表4.3动物给药剂量正常对照组阳性药物对照组高纯度组(mg/kg体重)粗提物组(生理盐水ml)(mg/kg体重)大剂量组中剂量组小剂量组给药剂量0.158.31.500.750.3750.75在第7d末次给药2h后，将动物称重后取血、取胸腺、脾称重计算免疫学指数(表4.4);表4.4免疫学指数检测结果(i±s,『10)正常对照组病毒模型组阳性药物组受试药物粗提物组(生理盐水)(生理盐水)(利巴韦林)大剂量组~中剂量组~小剂量组体重25.54±2.58*15.84±1.9520.57±3.8823.36±4.84*21.59±5.1820.78±4.4520.12±3.21脾重O.19±0.090.07±0.010.18±0.090.15±0.050,12±0.080.15±0.040.11±0.10脾指数0.64±0.240.38±0.13*0.90±0.5*0.67±0.15*A0.62±0.21*A0.61±0.11*A0.45±0.24胸腺重O.ll土O.020.05±0.020.08±0.040.10±0.030.10±0.030.07±0.040.08±0.06胸腺指数0.43±0.07*0.28±0.080.38±0.180.45±0.11*A0.41±0.07*A0.32±0.140.30±0.12*与病毒组比较大剂量组体重t=2.595,p<0.05;正常组体重t=3.460，p<0.05;大剂量组脾指数t=3.333,p<0.05;中剂量组脾指数t=2.479，p<0.05;小剂量组脾指数t=2.712,p<0.05;正常对照组脾指数，t=4.55，p<0.05;大剂量组胸腺指数t=2.742,p<0.05;中剂量组胸腺指数t=6.190，p<0.05;正常组组胸腺指数t=2.545，p<0.05。与正常对照组比较大中小剂量组脾指数以及大剂量组胸腺指数t值分别为1.20，0.85，0.46，1.081，p>0.05。从上表可以明显看出，动物感染病毒后，生长发育受到影响，体重小于正常对照组，具有显著性差异。而给与高纯度连翘酯苷干预后，大中小剂量组动物体重都有增加，其中大剂量组具有显著性差异；同时，感染病毒的小鼠脾指数、胸腺指数降低，与正常对照组比较具有显著性差异。而给与高纯度连翘酯苷干预后，大、中、小剂量组动物脾和胸腺指数都有增加，其中大、中、小剂量组的脾指数和大剂量组的胸腺指数与病毒对照组比较均有显著性增加，达到正常水平(与正常对照组比较P〉0.05),表明连翘酯苷对病毒感染引起的免疫力低下有显著的调节作用。而连翘酯苷粗提物则无提高免疫力的作用。将各组肺组织用玻璃匀浆器匀桨，加lOOul的细胞维持液吹打悬浮，高速离心(lOOOOr/rain)lOmim，做1:10稀释，再做连续2倍比系列稀释(2-1、2-2、2-3、2-4)后横向依次加入96孔板孔内己经长成单层的HEL细胞上，纵向重复3孔。37°C、5%C02培养，每日观察细胞病变，第7d记录终末含毒浓度，计算终末含毒指数的几何均数，判断体内抗病毒效果，结果见表4.5。表4.5连翘酯苷体内抗病毒试验结果(5土s,n-10)正常对照组病毒对照动物阳性药物组高纯度组粗提物组(利巴韦林)大剂量组中剂量组~~小剂量组动物死亡率(％)020000010病毒阳性率(％)0(0/10)80(8/10)70(7/10)20(2/10)30(3/10)50(5/10)终末含毒01.55±1.11l.OO士O.970.20±0.44*0.40土0.710.50±0.881.IO土O.52承与病毒模型组比较t-2.85，p<0.05.由表4.5看出，高纯度连翘酯苷具有良好的体内抗病毒作用，且效果优于利巴韦林。4.2.6动物肺组织病理学检査将石蜡包埋HE染色组织切片做显微镜检测，按照如下组织病例学评分系统进行评分，结果见表4.6。表4.6动物病理学检测评分结果(^土s，n-10)对照组病毒模型动物阳性药物组受试药物组粗提物组(利巴韦林)大剂量组中剂量组小剂量:组细支气管、支气管周围浸润01.80±0.601.80±0.670.70±0.670.80±0.601.OO土O.781.60±0.54细支气管、支气管周围浸润02.0±0.601.50±0.880.60±0,500.90±0.71l.OO士O.781.60±0.83细支气管、支气管腔渗出01.40±0.531.20±0.440.70±0,500.80±0.331.30±0.500.90±0.45血管周围浸润01.70±0.671.40±0.710.70±0.441.20±0.671.50±0.531.40±0.66实质性肺炎00.90±0.780.30±0.710.20±0.670.20±0.440.20±0,440.30±0.37病理指数014.60±4.7411.60±5.295.50±3.157.00±4.159.60±5.0410.20±0.22表明大、中、小剂量的高纯度连翘酯苷均具有减轻病毒引起的肺组织损伤的所用，并表现出显著的量效关系，效果明显优于阳性药物利巴韦林和连翘酯苷粗提物。附组织病理学评分标准A.细支管、支气管周围浸润(部位的百分率)0=无；1=少许(〈25%);2=许多(25%75%);3=所有(>75%)。B.细支气管、支气管浸润的定性0=无偶见轻微的浸润，或支气管周围淋巴样细胞团块见于正常动物；1=轻不正常，常常伴有间断的环；2=中度完整的环或新月形的环，伴有〈5个细胞的厚度；3=严重完全的环，伴有〉510个细胞厚度。C.细支气管/支气管腔渗出O二无；1=轻度，《25%腔闭合；2=重度，》25%腔闭合。D.血管周围浸润，(部位的百分率)O-无；1=少(<10%);2=许多(10%50%);3二大多数(〉50%)E.实质性肺炎0=无；1=轻度斑状实质性浸润；2=重度。斑和融合的实质性浸润。分数的计算二A+3(B+C)+D+E=0-26分实施例5(体外抑菌试验)5.1实验材料5.1.1受试药物连翘酯苷的高纯度药品和粗提物见1.2.15.1.2细菌菌种细菌菌种和病毒毒种乙型溶血性链球菌(SDCDC02410—5)、金黄色葡萄球菌(SDCDC25923)、草绿色链球菌(SDCDC02404)、表皮葡萄球菌(SDCDC02519)。5.1.3培养液MEM细胞培养液，含10%新生牛血清、MEM细胞维持液，含2%新生牛血清；营养肉汤。5.1.4仪器恒温培养箱、净化工作台、-8(TC冰箱、-2(TC冰箱、722分光光度计。、5.2试验方法与结果5.2.1活化菌种及菌液制备将冻干保存的菌种接种于营养肉汤，37'C培养过夜，重复接种培养，获得活化菌种。5.2.2抑菌试验将药物用细菌培养基稀释成20mg/ml浓度，然后做2倍比系列稀释(1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128)，取lml分别加等容量的菌液乙型溶血性链球菌(1.35X107/ml)、金黄色葡萄球(l.18X108/tnl)、表皮葡萄球菌(4.05Xl07/ral)、草绿色链球菌(1.9X107/ml)。每个药物稀释度、每株菌重复3个试管；同时设药物对照，即上述相同浓度的药物中加等量灭活菌液；菌液对照，即菌液加等容量培养液；培养液对照。37。C培养24h，用722分光光度计于600nm检测吸光度，用公式③计算细菌抑制率，并将获得的数据代人公式①计算比距，比距与低于50%的病变率病毒稀释度指数相加，获得半数抑菌浓度。(抑菌试验OD值一药物对照OD值)/菌液对照OD值一空白对照OD值)…公式③5.2.3结果见表5.1。表5.1体外抑菌试验结果金黄色葡萄球菌草绿色葡萄球菌表皮葡萄球菌溶血性链球菌半数抑菌浓度2-2.5(3.54mg/ml)2-3.5(1.77g/ml)2-4.5(0.88g/ml)2-2.6(3.30g/ml)从上述内容和上表可以看出，连翘酯苷具有一定的体外抑菌效果。5.3结论与评价连翘酯苷对乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、草绿色链球菌、表皮葡萄球菌有抑菌活性，而这些细菌都属于革兰氏阳性菌，故提示连翘酯苷对革兰氏阳性菌效果更为显著。权利要求1.高纯度连翘酯苷在制备解热、抗炎药物中的应用。2.高纯度连翘酯苷在制备增强免疫力药物中的应用。3.高纯度连翘酯苷在制备抗病毒药物中的应用。4.根据权利要求3所述高纯度连翘酯苷的用途，其特征是高纯度连翘酯苷在制备抗呼吸道合胞病毒、流感甲型病毒药物中的应用。5.高纯度连翘酯苷在制备抗菌药物中的应用。6.根据权利要求5所述连翘酯苷的用途，其特征是高纯度连翘酯苷在制备抗革兰氏阳性菌药物中的应用。7.根据权利要求6所述高纯度连翘酯苷的用途，其特征是高纯度连翘酯苷在制备抗乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、草绿色链球菌、表皮葡萄球菌药物中的应用。全文摘要本发明属医药
技术领域：
，公开了高纯度连翘酯苷在制备抑菌、抗病毒及其它药物中的应用。本发明是通过实验证明了高纯度连翘酯苷的解热、抗炎、提高免疫力、抑菌、抗病毒的作用，包括高纯度连翘酯苷(1)对致热大鼠的退热实验；(2)抑制二甲苯致小鼠耳肿胀、降低小鼠毛细管通透性作用的实验；(3)增加小鼠炭廓清能力，增加淋巴细胞转化率实验；(4)体外抗流感甲型病毒、体内抗呼吸道合胞病毒作用的实验；(5)体外抑制乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、草绿色链球菌和表皮葡萄球菌的实验。文档编号A61K36/634GK101390869SQ200710094089公开日2009年3月25日申请日期2007年9月19日优先权日2007年9月19日发明者玄振玉,勇王申请人:上海玉森新药开发有限公司