专利名称：基因工程重组牛白细胞介素－2的复性方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。更具体地说，本发明涉及基因工程重组牛白细胞介素-2的复性方法。
背景技术：
重组牛白细胞介素2(rbIL-2)主要是由辅助T淋巴细胞产生的一种淋巴因子[1]，具有使牛活化淋巴细胞克隆增殖的能力，以及诱导NK及LAK细胞杀伤活性的能力[2]，在机体的免疫应答中起重要作用。重组牛白介素-2是一个由145个氨基酸组成的单链糖蛋白，分子量为15.48KD，有3个Cys，有一对分子内二硫键[1]。通过大肠杆菌表达的rbIL-2为不溶解、无活性的细胞内聚集物即包涵体。而变性溶解的包涵体，在适宜的氧化还原条件下重新折叠成为具有正确空间构象及分子内结构的生物活性分子。复性条件不适宜，会出现分子内二硫键的错配、分子间共价结合或疏水结合形成聚合体，一方面降低重组蛋白的比活性，造成产品质量不合格，同时又会产生沉淀析出，影响得率[3，4]。
随着基因工程的发展，对原核体系中高效表达产生的重组蛋白包涵体进行有效的体外变复性处理已成为一个很实际的问题。影响蛋白复性的因素很多，重组蛋白的自然特性是影响变性蛋白质折叠成有活性蛋白质的主要因素，其次，蛋白质的纯度、溶液的pH值、离子强度、目的蛋白浓度以及由变性到复性环境之间变换的速度等也是重要因素。
目前蛋白的复性方法很多，传统复性方法有透析、稀释和超滤。其中以稀释复性法为最常用的方法。透析和超滤复性法得到的蛋白复性率低；稀释复性法成本高、操作体积大、周期长，不适合工业放大。在以前的研究中[3，4，6-11]，对蛋白复性时的pH、温度、折叠促进剂、氧化还原条件等因素有所涉及，但只是讲述其原理、应用效果和大概范围，并未提出最佳使用量和最佳控制点。即使同一方法对不同蛋白质复性效率也不相同，因为不同的蛋白质具有不同的分子大小，不同的氨基酸组成，其分子结构，疏水程度等也不同。另外，人们对已知蛋白质结构形成的知识知之甚少，蛋白质的变复性理论指导十分有限。所以，有必要对每一个蛋白的复性条件如pH、蛋白浓度、巯基氧化还原对的比率、小分子折叠促进剂、复性方法等进行详细的研究探索。
因此，对于重组牛白细胞介素2，仍然需要一种复性率高、操作体积小、周期短的复性方法。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种重组牛白细胞介素2的复性方法。
本发明的另一个目的是提供一种用于重组牛白细胞介素2复性的试剂盒。
在本发明的第一方面，提供了一种重组牛白细胞介素2的复性方法，该方法包括a)将重组牛白介素2的包涵体经变性后在基本上由30-100mmol/L Tris-HCl、3.5-4.5mol/L尿素、0.5-1mol/L盐酸胍、0.3-0.7mol/L L-Arg、1∶3-3∶1比例的GSH和GSSG(GSH即还原型谷胱甘肽，GSSG即氧化型谷胱甘肽)组成、pH8-10的复性液中透析，透析温度为0-10℃，透析2-8小时或更长，以获得透析产物；b)将步骤a)中的透析产物转入基本上由30-100mmol/L Tris-HCl、2.8-3.3mol/L尿素、0.5-1mol/L盐酸胍、0.3-0.7mol/L L-Arg、1∶3-3∶1比例的GSH和GSSG组成、pH8-10的复性液中透析，透析温度为0-10℃，透析2-8小时或更长，以获得透析产物；c)将步骤b)中的透析产物转入基本上由30-100mmol/L Tris-HCl、1.5-2.5mol/L尿素、0.5-1mol/L盐酸胍、0.3-0.7mol/L L-Arg、1∶3-3∶1比例的GSH和GSSG组成、pH8-10的复性液中透析，透析温度为0-10℃，透析2-8小时或更长，透析产物离心后获得重组牛白介素2的复性产物；其中，步骤a)和步骤b)、步骤b)和步骤c)中所用的尿素浓度之差分别为0.5-1.5mol/L。
在本发明的另一方面，提供了一种用于重组牛白细胞介素2复性的试剂盒。
所述试剂盒包含i)第一复性液，所述复性液基本上由30-100mmol/L Tris-HCl、3.5-4.5mol/L的尿素、0.5-1mol/L的盐酸胍、0.3-0.7mol/L的L-Arg、1∶3-3∶1比例的GSH和GSSG组成，pH8-10；ii)第二复性液，所述复性液基本上由30-100mmol/L Tris-HCl、2.8-3.3mol/L的尿素、0.5-1mol/L的盐酸胍、0.3-0.7mol/L的L-Arg、1∶3-3∶1比例的GSH和GSSG组成，pH8-10；和iii)第三复性液，所述复性液基本上由30-100mmol/L Tris-HCl、1.5-2.5mol/L的尿素、0.5-1mol/L的盐酸胍、0.3-0.7mol/L的L-Arg、1∶3-3∶1比例的GSH和GSSG组成，pH8-10；其中，第一复性液和第二复性液、第二复性液和第三复性液中所用的尿素浓度之差分别为0.5-1.5mol/L。
本发明重组牛白细胞介素2的复性方法相比传统方法有蛋白复性率高、操作体积小、周期短等优点。
图1A是rbIL-2变性后经Sephacryl S-200凝胶柱分离纯化时的紫外(280nm)检测图，变性液中无DTT。图1B是rbIL-2变性后经Sephacryl S-200凝胶柱分离纯化时的紫外(280nm)检测图，变性液中DTT浓度为20mmol/mL。图1C是图1A和图1B中峰1-5的还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。图1D是图1A和图1B中峰1-5的非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。图1C和图1D中，B代表样品缓冲液；M代表蛋白标记；泳道1-4代表图1A中的峰1、2、3、5；泳道5-7代表图1B中的峰1、2、4；箭头代表目标rbIL-2。
图2表示pH对rbIL-2复性的影响。
图3表示氧化还原条件(GSH和GSSG的比例)对rbIL-2复性的影响。其中，11mmol/L GSH；21mmol/L GSH+0.1mmol/L GSSG；31mmol/LGSH+0.125mmol/L GSSG；41mmol/L GSH+0.2mmol/L GSSG；51mmol/LGSH+0.33mmol/L GSSG；61mmol/L GSH+1mmol/L GSSG；71mmol/L GSSG。
图4表示折叠促进剂(L-Arg)对rbIL-2复性的影响。1在透析复性液中无添加；2在透析复性液中添加0.75mol/L盐酸胍；3在透析复性液中添加0.5mol/L L-Arg；4在透析复性液中添加0.75mol/L盐酸胍和0.5mol/L L-Arg。
图5A表示rbIL-2复性上清还原SDS-PAGE的结果。图5B表示rbIL-2复性上清非还原SDS-PAGE的结果。图5A和图5B中，M代表蛋白标准；1变性液中添加添加DTT使其达到10mmol/mL；2变性液中无DTT。
具体实施例方式
本发明通过将透析法和稀释法相结合，并创新性地采用脲浓度梯度，提供了一种重组牛白介素2的复性方法，该方法的特点是蛋白复性率高、操作体积小、周期短。
本发明的一个方面提供了重组牛白细胞介素2的一种复性方法，该方法包括a)将重组牛白介素2的包涵体经变性后在基本上由30-100mmol/L Tris-HCl、3.5-4.5mol/L尿素、0.5-1mol/L盐酸胍、0.3-0.7mol/L L-Arg、1∶3-3∶1比例的GSH和GSSG组成、pH8-10的复性液中透析，透析温度为0-10℃，透析2-8小时或更长，以获得透析产物。其中尿素浓度可以是3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4或4.5mol/L，优选3.8-4.2mol/L，最优选4mol/L；盐酸胍浓度可以是0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0mol/L，优选0.6-0.8mol/L，最优选0.75mol/L；L-Arg浓度可以是0.3、0.4、0.5、0.6或0.7mol/L，优选0.4-0.6mol/L，最优选0.5mol/L；GSH和GSSG比例可以是1∶3、1∶2.5、1∶2、1∶1.5、1∶1.4、1∶1.3、1∶1.2、1∶1.1、1∶1、1.1∶1、1.2∶1、1.3∶1、1.4∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1，优选1∶2.5-2.5∶1，更优选1∶1.5-1.5∶1，最优选1∶1。透析温度优选是2-6℃，更优选3-5℃，最优选4℃。
b)将步骤a)中的透析产物转入基本上由30-100mmol/L Tris-HCl、2.8-3.3mol/L尿素、0.5-1mol/L盐酸胍、0.3-0.7mol/L L-Arg、1∶3-3∶1比例的GSH和GSSG组成、pH8-10的复性液中透析，透析温度为0-10℃，透析2-8小时或更长，以获得透析产物。其中尿素浓度可以是2.8、2.9、3.0、3.1、3.2或3.3mol/L，优选2.9-3.2mol/L，最优选3mol/L；盐酸胍浓度可以是0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0mol/L，优选0.6-0.8mol/L，最优选0.75mol/L；L-Arg浓度可以是0.3、0.4、0.5、0.6或0.7mol/L，优选0.4-0.6mol/L，最优选0.5mol/L；GSH和GSSG比例可以是1∶3、1∶2.5、1∶2、1∶1.5、1∶1.4、1∶1.3、1∶1.2、1∶1.1、1∶1、1.1∶1、1.2∶1、1.3∶1、1.4∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1，优选1∶2.5-2.5∶1，更优选1∶1.5-1.5∶1，最优选1∶1。透析温度优选是2-6℃，更优选3-5℃，最优选4℃。
c)将步骤b)中的透析产物转入基本上由30-100mmol/L Tris-HCl、1.5-2.5mol/L尿素、0.5-1mol/L盐酸胍、0.3-0.7mol/L L-Arg、1∶3-3∶1比例的GSH和GSSG组成、pH8-10的复性液中透析，透析温度为0-10℃，透析2-8小时或更长，透析产物离心后获得重组牛白介素2的复性产物。其中尿素浓度可以是1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5mol/L，优选1.8-2.2mol/L，最优选2mol/L；盐酸胍浓度可以是0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0mol/L，优选0.6-0.8mol/L，最优选0.75mol/L；L-Arg浓度可以是0.3、0.4、0.5、0.6或0.7mol/L，优选0.4-0.6mol/L，最优选0.5mol/L；GSH和GSSG比例可以是1∶3、1∶2.5、1∶2、1∶1.5、1∶1.4、1∶1.3、1∶1.2、1∶1.1、1∶1、1.1∶1、1.2∶1、1.3∶1、1.4∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1，优选1∶2.5-2.5∶1，更优选1∶1.5-1.5∶1，最优选1∶1。透析温度优选是2-6℃，更优选3-5℃，最优选4℃。
其中，步骤a)和步骤b)、步骤b)和步骤c)中所用的尿素浓度之差分别为0.5-1.5mol/L。
在本发明的实施中，透析时间的选择可根据复性时温度、pH和氧化还原对的浓度等具体复性条件而定，而且这种选择在本领域技术一般人员的能力范围之内。例如，透析时间可以是2-8小时或更多，优选3-6小时，最优选4小时。在本发明的实施中，离心条件的选择在本领域一般技术人员的能力范围之内。
在本发明的某些实施方式中，在步骤c)之后还包括用PBS，pH8-10(较佳为pH8-9、更佳为8.5左右)缓冲液或Tris等缓冲范围在pH8-10的其他缓冲系统进行透析。透析产物离心后即得到重组牛白细胞介素2的复性蛋白。
在本发明的另一方面，提供了一种用于重组牛白细胞介素2复性的试剂盒。所述试剂盒包含i)第一复性液，所述复性液基本上由30-100mmol/L Tris-HCl、3.5-4.5mol/L的尿素、0.5-1mol/L的盐酸胍、0.3-0.7mol/L的L-Arg、1∶3-3∶1比例的GSH和GSSG组成，pH8-10。其中尿素浓度可以是3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4或4.5mol/L，优选3.8-4.2mol/L，最优选4mol/L；盐酸胍浓度可以是0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0mol/L，优选0.6-0.8mol/L，最优选0.75mol/L；L-Arg浓度可以是0.3、0.4、0.5、0.6或0.7mol/L，优选0.4-0.6mol/L，最优选0.5mol/L；GSH和GSSG比例可以是1∶3、1∶2.5、1∶2、1∶1.5、1∶1.4、1∶1.3、1∶1.2、1∶1.1、1∶1、1.1∶1、1.2∶1、1.3∶1、1.4∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1，优选1∶2.5-2.5∶1，更优选1∶1.5-1.5∶1，最优选1∶1。
ii)第二复性液，所述复性液基本上由30-100mmol/L Tris-HCl、2.8-3.3mol/L的尿素、0.5-1mol/L的盐酸胍、0.3-0.7mol/L的L-Arg、1∶3-3∶1比例的GSH和GSSG组成，pH8-10。其中尿素浓度可以是2.8、2.9、3.0、3.1、3.2或3.3mol/L，优选2.9-3.2mol/L，最优选3mol/L；盐酸胍浓度可以是0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0mol/L，优选0.6-0.8mol/L，最优选0.75mol/L；L-Arg浓度可以是0.3、0.4、0.5、0.6或0.7mol/L，优选0.4-0.6mol/L，最优选0.5mol/L；GSH和GSSG比例可以是1∶3、1∶2.5、1∶2、1∶1.5、1∶1.4、1∶1.3、1∶1.2、1∶1.1、1∶1、1.1∶1、1.2∶1、1.3∶1、1.4∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1，优选1∶2.5-2.5∶1，更优选1∶1.5-1.5∶1，最优选1∶1。
iii)第三复性液，所述复性液基本上由30-100mmol/L Tris-HCl、1.5-2.5mol/L的尿素、0.5-1mol/L的盐酸胍、0.3-0.7mol/L的L-Arg、1∶3-3∶1比例的GSH和GSSG组成，pH8-10。其中尿素浓度可以是1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5mol/L，优选1.8-2.2mol/L，最优选2mol/L；盐酸胍浓度可以是0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0mol/L，优选0.6-0.8mol/L，最优选0.75mol/L；L-Arg浓度可以是0.3、0.4、0.5、0.6或0.7mol/L，优选0.4-0.6mol/L，最优选0.5mol/L；GSH和GSSG比例可以是1∶3、1∶2.5、1∶2、1∶1.5、1∶1.4、1∶1.3、1∶1.2、1∶1.1、1∶1、1.1∶1、1.2∶1、1.3∶1、1.4∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1，优选1∶2.5-2.5∶1，更优选1∶1.5-1.5∶1，最优选1∶1。
其中，第一复性液和第二复性液、第二复性液和第三复性液中所用的尿素浓度之差分别为0.5-1.5mol/L。
在本发明的一个优选实施方式中，提供了重组牛白细胞介素2的一种复性方法，该方法包括，a)将重组牛白介素2的包涵体经变性后在基本上由50mmol/L Tris-HCl、由4mol/L尿素、0.75mol/L盐酸胍、0.5mol/L L-Arg、1∶1比例的GSH和GSSG组成、pH8.5的复性液中透析，透析温度为4℃，透析4小时以获得透析产物；b)将步骤a)中的透析产物转入基本上由50mmol/L Tris-HCl、3mol/L尿素、0.75mol/L盐酸胍、0.5mol/L L-Arg、1∶1比例的GSH和GSSG组成、pH8.5的复性液中透析，透析温度为4℃，透析4小时以获得透析产物；c)将步骤b)中的透析产物转入基本上由50mmol/L Tris-HCl、2mol/L尿素、0.75mol/L盐酸胍、0.5mol/L L-Arg、1∶1比例的GSH和GSSG组成、pH8.5的复性液中透析，透析温度为4℃，透析4小时，透析产物离心后获得重组牛白介素2的复性产物。
在本发明的一个优选实施方式中，提供了一种用于重组牛白细胞介素2复性的试剂盒，该试剂盒包含i)第一复性液，所述复性液基本上由50mmol/L Tris-HCl、4mol/L的尿素、0.75mol/L的盐酸胍、0.5mol/L的L-Arg、1∶1比例的GSH和GSSG组成，pH8.5；ii)第二复性液，所述复性液基本上由50mmol/L Tris-HCl、3mol/L的尿素、0.75mol/L的盐酸胍、0.5mol/L的L-Arg、1∶1比例的GSH和GSSG组成，pH8.5；iii)第三复性液，所述复性液基本上由50mmol/L Tris-HCl、2mol/L的尿素、0.75mol/L的盐酸胍、0.5mol/L的L-Arg、1∶1比例的GSH和GSSG组成，pH8.5。
在本发明某些实施方式中，所述试剂盒还可进一步包含PBS、Tris等缓冲范围在pH8-10的其他缓冲系统，用于维持一个稳定的pH范围。
适用于本发明复性液中的盐酸胍也可以用其他胍盐或变性剂代替，以维持一个有利于复性但不引起变性作用的复性剂浓度。
适用于本发明复性液中的折叠促进剂还可以是盐酸胍等变性剂、起分子伴侣作用的折叠促进剂，如热休克蛋白HSP70等，可以起到促进折叠作用，但不影响复性。
适用于本发明复性液中的氧化还原剂除GSH和GSSG外还可以是其他具有氧化还原缓冲作用的氧化还原对，如硫醇/二硫化物等。
如本文所用，“基本上由…组成”是指如本领域技术一般人员所知的，复性液中除指出的成分外还可含有其它的不影响或基本不影响复性效果的组分。
氧化还原剂如GSH和GSSG的绝对浓度在本发明中不起关键作用，氧化剂和还原剂的比例是影响复性效果的关键因素。
在一个实施方式中，在复性之前的变性步骤中，采用的变性液是含有6mol/L盐酸胍、50mmol/L Tris-HCl，pH8.0的变性液，未添加DTT。
在一个优选实施方式中，在复性之前的变性步骤中，采用的变性液是含有6mol/L盐酸胍、50mmol/L Tris-HCl，pH8.0的变性液，其中添加的DTT浓度为1-3mmol/mg蛋白，优选2mmol/mg蛋白。
在另一个优选实施方式中，在透析步骤c)之后还包括用PBS，pH8.5缓冲液透析，例如2、3、4、5、6、7或8小时或更长，然后20,000g离心30分钟除去不溶物，获得rbIL-2复性产物。
本发明人通过对rbIL-2变复性条件的研究，确定在rbIL-2蛋白变性溶解时，变性溶液中加入DTT的浓度为2mmol/mg蛋白时可取得较好的单体蛋白分离变性效果，确定rbIL-2复性的pH为8.5，巯基氧化还原对比例为1∶1，同时在复性液中添加0.5mol/L的L-Arg，0.75mol/L的盐酸胍等减少了无规凝聚物的产生，有效提高rbIL-2的复性效率。更主要的是采用了脲浓度梯度透析复性方法，使rbIL-2在较高蛋白浓度(3.5mg/mL)下较好地复性，复性率(即复性后rbIL-2蛋白浓度/复性前rbIL-2蛋白浓度)可达50％左右，SDS-PAGE分析表明(如图5A、5B所示)，复性上清中95％为rbIL-2，如文献[5]所述测定活性测定效价可达9.6×104IU/mL。
本领域技术人员可理解，预期本发明的复性方法还可用于与重组牛白介素2具有相似性质的蛋白质的复性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1rbIL-2包涵体的提取、变性方法及rbIL-2变性液中DTT添加剂量的测定rbIL-2包涵体的制备本发明中用于生产重组牛白介素2的大肠杆菌为BL-21，购自上海普飞生物技术有限公司，货号200132。大肠杆BL-21的培养及发酵过程参见文献[12]。将5升发酵罐收获的菌体悬于3L高压匀浆破菌液(50mmol/LTris-HCl，100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，pH8.0)中，高压匀浆破菌(500bar，1600bar，900bar)三个循环后，于4℃，12000r/min离心20min，弃上清，所有的包涵体经3L洗涤液(50mmol/Ltris-HCl，1mmol/LEDTA，pH8.0)重悬洗涤后于4℃，12000r/min离心20min，弃上清即得rbIL-2包涵体。
rbIL-2包涵体的变性1.2g rbIL-2包涵体，加100mL变性液(6mol/L盐酸胍，50mmol/L Tris-HCl，20mmol/mL DTT，pH8.0)，室温搅拌过夜，使其溶解，4℃12000r/min离心20min，去除不溶物，上清备用。
rbIL-2变性液中DTT添加剂量的测定图1A，1B为rbIL-2的Sephacryl S-200柱分离纯化紫外检测图，经还原和非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定(图1C和图1D)，图1A中峰1为核酸及rbIL-2二聚体蛋白吸收峰，峰2主要为rbIL-2的二聚体蛋白，峰3才是该rbIL-2的单体蛋白峰，而峰5为盐峰。在图1B中，峰1仍为核酸及rbIL-2二聚体蛋白吸收峰，峰2主要为该rbIL-2的蛋白吸收峰，峰4为盐峰。由此可见，该rbIL-2蛋白在变性溶解时即已形成大量的双体蛋白，这对后面的复性明显不利，必须在该蛋白复性前加入还原剂以使已经形成的分子间二硫键还原，以形成rbIL-2单体。图1B表明，当在rbIL-2蛋白(10mg/mL)的变性液中加入20mmol/mL的DTT时，rbIL-2二聚体蛋白峰基本消失(DTT浓度继续增加，峰形和图1B基本相同)，而rbIL-2单体蛋白明显增多，这是rbIL-2复性的良好前提条件。所以，在rbIL-2蛋白变性溶解时，应在10mg/mL rbIL-2蛋白变性溶液中加入20mmol/mL的DTT。
实施例2rbIL-2复性条件的测定pH和温度的测定我们根据不同缓冲对的有效缓冲范围，比较了不同pH条件对rbIL-2包涵体复性的影响(图2)。变性的重组牛白介素2包涵体在各pH值条件下对复性液(50mmol/L Tris-HCl，1mmol/L GSH，1mmol/L GSSG，0.5mol/L L-Arg)透析复性。从pH7.0到pH9.0范围内，pH8.5时rbIL-2的复性率最高。所以以后我们均采用微碱条件pH8.5。
温度对rbIL-2的复性也有很大影响，在4℃，25℃，37℃范围内，温度越高，rbIL-2的复性效率也越低(数据未示)。本实验所有操作均在4℃进行。
氧化还原条件的测定天然状态的rbIL-2含有3个半胱氨酸，形成一对分子内二硫键，在复性过程中需要氧化还原剂来催化分子内二硫键的形成。通常所用的巯基氧化还原对为GSH/GSSG。变性的重组牛白介素2包涵体在具有不同比例的还原型和氧化型谷胱甘肽(GSH和GSSG)的复性液(50mmol/L Tris-HCl，pH8.5)中透析复性。图3显示在不同的毫摩尔比浓度下，GSH/GSSG比为1∶1时最有利于rbIL-2的复性。
由于溶解包涵体所用的变性液中含有一定的DTT，经200倍复性液透析后，在复性体系中仍含有一定量残余的DTT，该残余DTT还原GSSG，产生GSH和GSSG氧化还原对催化二硫键的交换。因此综合比较，我们确定适合rbIL-2复性的巯基氧化还原条件为GSH/GSSG为1∶1。
折叠促进剂对rbIL-2复性的影响我们首先比较了溶解于标准透析复性液(50mmol/L Tris-HCl，100mmol/LNaCl，pH8.5)的不同浓度的L-Arg对rbIL-2复性的影响，发现0.5mol/L的L-Arg可明显提高rbIL-2的复性效率(图4)。图4的结果说明L-Arg可非特异性结合于错配二硫键和不正确折叠结构，降低其稳定性，并使蛋白向正确折叠方向进行的理论。
图4显示，0.75mol/L的盐酸胍也可提高rbIL-2的复性效率，这和Fisher等报道的盐酸胍在非变性浓度下是很有效的促进剂相吻合，因为低浓度盐酸胍能保护解叠的或部分折叠分子的疏水基，防止它们相互作用而聚集。另外，图4还显示，0.5mol/LL-Arg加上0.75mol/L盐酸胍可进一步提高rbIL-2的复性效率。
实施例3rbIL-2包涵体脲浓度梯度复性将200mL如实施例1所述变性的rbIL-2(3.5mg/mL)装入透析袋中，对2L含4mol/L尿素的复性液透析复性。复性液组成为50mmol/LTris-HCl，0.5mol/LL-Arg，0.75mol/L盐酸胍，GSH/GSSG比例为1∶1，pH8.5，透析温度为4℃；4小时后转入2L含3mol/L尿素的相同的复性液中透析；4小时后再转入2L含2mol/L尿素的复性液中透析复性；4小时后对2LPBS(pH8.5)透析复性；4小时后20,000g离心30分钟)去除不溶物，获得rbIL-2复性蛋白。
比较例rbIL-2脲浓度梯度复性方法的效果测定我们比较了稀释复性法和脲浓度梯度透析法对rbIL-2复性的影响。表1显示，传统的稀释复性方法操作周期长，处理的体积大，需要超滤浓缩，且复性效率较低。这是因为变性蛋白稀释后，无规凝聚通常在几分钟内就会出现，而复性过程却相当缓慢，需要几个小时。稀释复性就是蛋白质在强变性能力的盐酸胍的稀释过程中突然大幅度地脱离变性环境，这样不利于蛋白质的正确折叠，蛋白质易形成异构体及寡聚体。
表1.脲浓度梯度复性与稀释复性效果的比较
和传统稀释复性法相比，脲浓度梯度透析复性法可以使rbIL-2在较高蛋白浓度下得到较好的复性，且操作体积不大，周期短。这是因为脲浓度梯度透析法复性是逐步缓慢地脱离变性环境而进入变性剂复性浓度区域，这样可以使得变性蛋白有足够的时间和环境来完成正确折叠。
本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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权利要求
1.一种重组牛白介素2的复性方法，该方法包括a)将重组牛白介素2的包涵体经变性后在基本上由30-100mmol/L Tris-HCl、3.5-4.5mol/L尿素、0.5-1mol/L盐酸胍、0.3-0.7mol/L L-Arg、1∶3-3∶1比例的GSH和GSSG组成、pH 8-10的复性液中透析，透析温度为0-10℃，透析2-8小时以获得透析产物；b)将步骤a)中的透析产物转入基本上由30-100mmol/L Tris-HCl、2.8-3.3mol/L尿素、0.5-1mol/L盐酸胍、0.3-0.7mol/L L-Arg、1∶3-3∶1比例的GSH和GSSG组成、pH 8-10的复性液中透析，透析温度为0-10℃，透析2-8小时，以获得透析产物；c)将步骤b)中的透析产物转入基本上由30-100mmol/L Tris-HCl、1.5-2.5mol/L尿素、0.5-1mol/L盐酸胍、0.3-0.7mol/L L-Arg、1∶3-3∶1比例的GSH和GSSG组成、pH 8-10的复性液中透析，透析温度为0-10℃，透析2-8小时，透析产物离心后获得重组牛白介素2的复性产物；其中，步骤a)和步骤b)、步骤b)和步骤c)中所用的尿素浓度之差分别为0.5-1.5mol/L。
2.如权利要求1所述的复性方法，其特征在于，所述步骤a)、b)、c)中各复性液的尿素浓度分别为4mol/L、3mol/L和2mol/L。
3.如权利要求1所述的复性方法，其特征在于，所述复性液中盐酸胍的浓度均为0.75mol/L，所述复性液中L-Arg的浓度均为0.5mol/L。
4.如权利要求1所述的复性方法，其特征在于，所述复性液中GSH和GSSG的比例均为1∶1。
5.如权利要求1所述的复性方法，其特征在于，所述复性液的pH均为8.5，所述透析均在4℃进行，透析时间均为4小时。
6.如权利要求1所述的复性方法，其特征在于，步骤c)后还包括用PBS缓冲液进行透析。
7.如权利要求1所述的复性方法，其特征在于，该方法包括a)将重组牛白介素2的包涵体经变性后在基本上由4mol/L尿素、0.75mol/L盐酸胍、0.5mol/L L-Arg、1∶1比例的GSH和GSSG组成、pH 8.5的复性液中透析，透析温度为4℃，透析4小时，以获得透析产物；b)将步骤a)中的透析产物转入基本上由3mol/L尿素、0.75mol/L盐酸胍、0.5mol/L L-Arg、1∶1比例的GSH和GSSG组成、pH 8.5的复性液中透析，透析温度为4℃，透析4小时，以获得透析产物；c)将步骤b)中的透析产物转入基本上由2mol/L尿素、0.75mol/L盐酸胍、0.5mol/L L-Arg、1∶1比例的GSH和GSSG组成、pH 8.5的复性液中透析，透析温度为4℃，透析4小时，透析产物离心后获得重组牛白介素2的复性产物。
8.如权利要求1所述的复性方法，在所述步骤a)之前还包括变性步骤，该变性步骤中所用变性液是添加了DTT的标准变性液，其中标准变性液为6mol/L盐酸胍，50mmol/L Tris-HCl，pH8.0，DTT浓度为2mmol/mg蛋白。
9.一种用于重组牛白介素2复性的试剂盒，该试剂盒包含i)第一复性液，所述复性液基本上由30-100mmol/L Tris-HCl、3.5-4.5mol/L的尿素、0.5-1mol/L的盐酸胍、0.3-0.7mol/L的L-Arg、1∶3-3∶1比例的GSH和GSSG组成，pH8-10；ii)第二复性液，所述复性液基本上由30-100mmol/L Tris-HCl、2.8-3.3mol/L的尿素、0.5-1mol/L的盐酸胍、0.3-0.7mol/L的L-Arg、1∶3-3∶1比例的GSH和GSSG组成，pH8-10；和iii)第三复性液，所述复性液基本上由30-100mmol/L Tris-HCl、1.5-2.5mol/L的尿素、0.5-1mol/L的盐酸胍、0.3-0.7mol/L的L-Arg、1∶3-3∶1比例的GSH和GSSG组成，pH8-10；其中，第一复性液和第二复性液、第二复性液和第三复性液中所用的尿素浓度之差分别为0.5-1.5mol/L。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含i)第一复性液，所述复性液基本上由50mmol/L Tris-HCl、4mol/L的尿素、0.75mol/L的盐酸胍、0.5mol/L的L-Arg、1∶1比例的GSH和GSSG组成，pH8.5；ii)第二复性液，所述复性液基本上由50mmol/L Tris-HCl、3mol/L的尿素、0.75mol/L的盐酸胍、0.5mol/L的L-Arg、1∶1比例的GSH和GSSG组成，pH8.5；iii)第三复性液，所述复性液基本上由50mmol/L Tris-HCl、2mol/L的尿素、0.75mol/L的盐酸胍、0.5mol/L的L-Arg、1∶1比例的GSH和GSSG组成，pH8.5。
全文摘要
本发明提供重组牛白介素－2的脲浓度梯度复性方法及用于该方法的试剂盒。利用该复性方法，复性液中重组牛白介素－2的复性率可达50％以上，活性测定效价可达9.6×10
文档编号C07K1/06GK101041685SQ20061002499
公开日2007年9月26日 申请日期2006年3月23日 优先权日2006年3月23日
发明者李震, 李祥瑞, 于瑞嵩, 黄建珍, 徐立新, 沈世缘 申请人:上海市农业科学院