专利名称：重组枯激酶的生产方法及其生物活性的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域。涉及生产重组枯激酶的方法，具体地说是建立一整套工程菌(PBV-NK/JM109)的发酵，从培养的发酵液中分离纯化分泌的枯激酶的层析纯化方法，以及培养热诱导后，收集包涵体，溶解包涵体的变性、复性和纯化蛋白质的方法及所获得纯化枯激酶的产品。
现有的天然枯激酶，最初是由日本学者须见洋行从纳豆中分离的枯草杆菌(BacillusSubtilis)的发酵物中鉴定出的。它具有很强的纤溶活性和激活内皮细胞产生内源t-PA的功能。近年日本大力开发纳豆食品作为保健食品，预防和治疗血栓性疾病。但由于自然菌产生的枯激酶量少，发酵时间长，难以应用于大规模生产。
本发明的目的是，通过在天然枯激酶基础上，以获得工程菌株，产生重组枯激酶，解决由于自然菌产生枯激酶量少，发酵时间长，难以用于生产的问题。
实现本发明的具体技术措施是首先筛选分离出枯激酶菌种，在此条件下克隆枯激酶基因，测序，构建高效表达枯激酶的工程菌株，以获得高表达工程菌株，并建立重组枯激酶的生产方法，经提取纯化，活性检测确定。其生产工艺方法包括工程菌种的发酵，饱和硫酸铵沉淀目的蛋白，目的蛋白硫酸铵沉淀物的透析，用DEAE-纤维素DE-52柱层析分离目的蛋白，用CM-纤维素CM-52进一步纯化目的的蛋白。用PEG-10000浓缩目的蛋白，Sephadex G-100柱层析纯化目的蛋白等步骤。
1.工程菌种及发酵，重组PBV-NK/JM109为本中心构建，从4℃保存的菌种平皿中，挑取单菌落接种在5mlLB培养液试管中，含Amp抗菌素100μg/ml，30℃培养，180转/分钟，振荡培养18小时。按1∶50接种在200mlLB培养液/1000ml三角瓶中，氨苄为100μg/ml。30℃，150转/分钟，培养24小时后，离心，6000转/分钟，20分钟，收集上清液，电泳检测目的蛋白在发酵液中的含量。
2.饱和硫酸铵沉淀目的蛋白以60％饱和硫酸铵沉淀枯激酶。在0℃条件下，称取硫酸铵，经粉碎后，缓慢地加入到上清液中，边加边搅拌，待全部加完后，在同样条件，继续搅拌2小时，4℃冰箱过夜，离心，6000rpm，20分钟，4℃，收集沉淀，并用小量pH7.4，10mM磷酸缓冲液溶解沉淀物。
3.目的蛋白硫酸铵沉淀物的透析上述溶解的沉淀物，在4℃对蒸馏水1200ml透析，3-4小时换水1次，透析24小时以上，所得透析液，再对10MmPBS(PH7.4)透析过夜，此时获得的透析液，供层析分离用。
4.用DEAE-纤维素DE-52柱层析分离目的蛋白，由于目的蛋白在PH7.4时带有正电荷，菌体蛋白为负电荷，因此，经过柱后，杂蛋白与DE-52发生离子交换而留在柱上，而目的蛋白流出，从而使大部分杂蛋白和色素被除去，获得初步分离的枯激酶，样品中目的蛋白浓度近50％。目的蛋白在DE-52柱层析时，保留在第2峰后部和整个第2个峰留份中。如图2、图4所示。从6000ml培养液得20-30mg目的蛋白。
5.用CM-纤维素CM-52进一步纯化目的蛋白如图3、图4所示，用CM-52柱层析纯化目的蛋白的层析曲线。
将DE-52分离的有活性馏份合并后，调PH至6.4，在4℃下，以1∶3的比例，静态交换吸附样品，至少在4小时以上，然后抽滤收集CM-52，并用2-5倍体积的10mMPBS(PH6.4)洗CM-52，被洗后的CM-52，装在层析柱中(0.0cm×100cm)，连接蛋白质检测仪，280mM，继续用PBS淋洗，在仪器基线走直后，改梯度洗脱，用0M与1MNaCl的10mMPBS(PH6.4)各300ml。分部收集样品后，测定活性，并电泳检测组分，合并单一目的蛋白馏份，转入SephadexG-100柱纯化。
6.用PEG-10000浓缩目的蛋白在CM-52柱梯度洗脱时，枯激酶在0.15-0.2MNaCl浓度时被洗下，收集后，用PEG浓缩为5ml左右，过SephadexG-100柱除盐和进一步纯化。
7.SephadexG-100柱层析纯化目的蛋白SephadexG-100柱(0.8cm100cm)，经10mMPBS(PH7.4)平衡后，将5ml浓缩的CM-52柱样品，缓慢加入，样品进入胶后，加入10mMPBS(PH7.4)。开始洗脱。紫外280mμ检测，收集峰馏份，洗脱峰呈对称状，所得活性馏份电泳检测为单一条带的枯激酶。为最终产品。
本发明是在天然枯激酶基础上，获得的工程菌株，产生的重组枯激酶，其优点在于用E.coli培养时间短，产酶量大，便于提取、纯化，可工业化生产。
本发明所提供的附图是
图1，为本发明的工艺流程图2，DE-52和柱层析纯化曲线图3，CM-52纯化层析纯化曲线图4，DE-52(A)和CM-52(B)层析样品SDS电泳5，Sephadex G-100纯化蛋白电泳6，重组枯激酶包涵体的SDS-PAGE电泳7，洗涤包涵体的变性电泳8，纯化枯激酶的SDS-PAGE电泳及电泳扫描图9，体外纤溶结果
图10，纯化枯激酶的活性测定结果
图11，纯化枯激酶的HPLC
图12，体外溶解血块结果本发明结合实施例1、2对附图进一步说明。
实施例1一，本实施例的技术要点1.细菌发酵为低密度高表达。
2.包涵体变性剂为尿素。
3.包涵体复性后，柱层析纯化，两步，DE-52柱和CM-52柱。
二、实验操作步骤(
图1)1.工程菌株，重组PBV-NK/E.coliJM109，为本中心构建。从4℃保存的工程菌平皿上挑取单菌落接种在5mlLB培养液管中(含氨苄青霉素100μg/ml)30℃，180转/分钟，振荡培养16-18小时后，按2∶50接种于摇瓶中(含氨苄青霉素100μg/ml)，30℃，180转/分钟，振荡培养16小时作为种子液。
2.发酵，按2∶50将种子液接入于200mlLB/1000ml三角瓶中(含氨苄表霉素100μg/ml)PH7.2，30℃，180转/分，振荡4-5小时，待菌密度达到OD600为0.3-0.4时，迅速升温至42℃，诱导表达4-5小时，离心收集菌体，6000转/分，20分钟，电泳检查目的蛋白表达量。湿菌体为5-7g/升。见图6。
3.菌体的裂解离心收集菌体，弃去上清，称菌体重量，按1∶10加入20mM/L PBS PH7.4洗菌体1次。离心后，仍按1∶10将菌体悬浮于缓冲液A中(缓冲液A50mM/L Tris HCL PH8.0 0.5mM/LEDTA，50mM/L Nacl，5％甘油，0.5mM/LDTT)，在超声波细胞破碎仪上，超声30分钟，显微镜下检查，破碎率在95％以上。向超声液中加脱氧胆酸(DOC)达终浓度0.2％，混匀后，室温放置10分钟，4℃，12000转/分，离心，15分钟，弃去上清，沉淀称重，即为包涵体。
4.包涵体的洗涤(1)以0.5％TritonX-100(用缓冲液A)配制，按1∶10重悬浮沉淀，(均匀，不得有颗粒)，室温搅拌20分钟，12000转/分，20分钟，弃上清，沉淀称重。
(2)用2M/LNacl(缓冲液A配制)，1∶10洗涤包涵体，室温搅拌1小时，12000转/分，离心20分钟，收集并称重沉淀包涵体。
(3)用3M/L尿素(缓冲液A配制)洗涤包涵体室温搅拌20分钟，12000转/分，离心20分钟，弃上清收集沉淀包涵体，称重。洗涤包涵体见图7。
5.包涵体变性以8M/L尿素溶解变性包涵体。8M/L尿素(用缓冲液A配制)，按1∶5加入尿素溶液，37℃溶解2小时以上，12000转/分，离心20分钟，上清为包涵体变性液，应呈无色或微黄色溶液。
6.包涵体复性(1)2M/L尿素复性，包涵体变性液，测定其蛋白浓度，复性要将其浓度稀至100μg/ml蛋白时进行。2M/L尿素复性在4℃，过夜，复性液(用缓冲液A配制)应呈清，透明，无聚集现象，然后，对缓冲液A透析多次除去尿素。
(2)稀释法复性。将变性液逐滴加入复性液中(100mM/L尿素的缓冲液A)，使蛋白质浓度达到0.1mg/ml，充分复性后，离心除去沉淀，超沪浓缩，透析除去尿素。
7.复性蛋白的柱层纯化(1)用DEAE-Cellulose DE-52柱层析分离，将平衡好的DE-52装入柱中(4×20cm)，以20mMPBS(PH7.4)平衡后，复性样品调PH7.4，通过该柱，收集流出部，电泳检查，将活性部分合并(见图2、图4A)。
(2)用CM-Cellulose CM-52柱纯化。处理好的CM-52，称取一定量，已经用20mMPBS PH6.5平衡的CM-52，加入到调PH6.5的上步活性馏份中，静态交换，16小时以上。然后抽沪，保留上清，CM-52装入柱中(0.8×60cm)，用平衡缓冲液洗去未交换或粘附的杂质，使检测仪基线走直，改0-1.0M/LNaCl(用20mMPBS，PH6.5配)进行梯度洗脱，收集峰馏份，活性和电泳检测，合并有活性，单一带部分，为精制品(见图3、图4B)。
(3)用SephadexG-100层析纯化，将CM-52活性馏份合并，PEG浓缩至10ml以下，过平衡好的SephadexG-100柱(0.8×60cm)，用同样20mMPBS、PH7.4洗脱，出现单一对称峰，为最终产品，合并冻干。结果见图5及图8，同时枯激酶的HPLC分析结果为单峰，纯度在99％以上，见
图11。
实施例2一、本实施例的技术要点1.重组枯激酶体外对纤维蛋白的溶解活性2.重组枯激酶体外对自然凝血块的溶解作用二、实验操作步骤1.体外对Agarose-纤维蛋白平板的溶圈活性，取Agarose(1％)溶液16.2ml，纤维蛋白原液16.2ml，凝血酶1.3ml，在45℃下，混匀后倒入到9cm×9cm×20cm的方盒中，室温放置1小时后，将不同浓度的重组枯激酶10μl，点在平板表面，30分钟后，放入到37℃，16-18小时，具有很大透明溶圈。表明重组枯激酶，体外对纤维蛋白的溶解作用。见图9、
图10。
2.体外溶解凝血块的作用，抽取一定量的兔血，倒入平皿中，4℃凝血后，用PBS，PH7.4，洗涤后，分别称取500mg，三块，放在三个小烧杯中，然后加入①生理盐水10ml，②含2mg重组枯激酶的10ml同样溶液，③含2mg重组链激酶的10ml同样溶液，37℃，振荡30分钟称重1次，记录血块重量，连续3次即90分钟，每次称血块重量记录，结果如表1和
图12所见。
表1枯激酶体外溶解血块实验结果
从表中结果可见，重组枯激酶具有很强的体外溶解血块的功能。
总之，本发明公开了一种重组枯激酶的生产技术方法，包括工程菌的培养、诱导表达，包涵体的分离，洗涤，裂解变性，复性方法和蛋白质的纯化工艺以及体外对纤维蛋白平板的血块的溶解活性与活性测定。
本发明纯化的产品可作为一种新的溶解血栓制剂，可以制成冻干粉供注射用，或制成片剂和胶囊供口服治疗预防心脑血管栓塞疾病。
权利要求
1.一种重组枯激酶的生产方法包括工程菌种的发酵，饱和硫酸铵沉淀目的蛋白，目的蛋白硫酸铵沉淀物的透析，用DEAE-纤维素DE-52柱层析分离目的蛋白，用CM-纤维素CM-52进一步纯化目的的蛋白。用PEG-10000浓缩目的蛋白，Sephadex G-100柱层析纯化目的蛋白等步骤，其特征在于工程菌种及发酵，从4℃保存的菌种平皿中，挑取单菌落接种在5mlLB培养液试管中，含Amp抗菌素100μg/ml，30℃培养，180转/分钟，振荡培养18小时。按1∶50接种在200mlLB培养液/1000ml三角瓶中，氨苄为100μg/ml。30℃，150转/分钟，培养24小时后，离心，6000转/分钟，20分钟，收集上清液，电泳检测目的蛋白在发酵液中的含量。
2.根据权利要求1所述的一种重组枯激酶的生产方法，其特征在于饱和硫酸铵沉淀目的蛋白。即以60％饱和硫酸铵沉淀枯激酶。在0℃条件下，称取硫酸铵，经粉碎后，缓慢地加入到上清液中，边加边搅拌，待全部加完后，在同样条件，继续搅拌2小时，4℃冰箱过夜，离心，6000rpm，20分钟，4℃，收集沉淀，并用小量pH7.4，10mM磷酸缓冲液溶解沉淀物。
3.根据权利要求1、2所述的一种重组枯激酶的生产工艺，其特征在于目的蛋白硫酸铵沉淀物的透析，是将溶解的沉淀物，在4℃对蒸馏水1200ml透析，3-4小时换水1次，透析24小时以上，所得透析液，再对10MmPBS(PH7.4)透析过夜，此时获得的透析液，供层析分离用。
4.根据权利要求1所述的一种重组枯激酶的生产工艺，其特征在于用DEAE-纤维素DE-52柱层析分离目的蛋白，选择目的蛋白在PH7.4时带有正电荷，菌体蛋白为负电荷时，经过柱后，杂蛋白与DE-52发生离子交换而留在柱上，而目的蛋白流出，从而使大部分杂蛋白和色素被除去，获得初步分离的枯激酶，此时目的蛋白浓度近50％。目的蛋白在DE-52柱层析时，保留在第2峰后部和整个第2个峰留份中。
5.根据权利要求1、4所述的一种重组枯激酶的生产工艺，其特征在于用CM-纤维素CM-52进一步纯化目的蛋白。即将DE-52分离的有活性馏份合并后，调PH至6.4，在4℃下，以1∶3的比例，静态交换吸附，至少在4小时以上，然后抽滤收集CM-52，并用2-5倍体积的10mMPBS(PH6.4)洗CM-52，被洗后的CM-52，装在层析柱中(0.0cm×100cm)，连接蛋白质检测仪，280mM，继续用PBS淋洗，在仪器基线走直后，改梯度洗脱，用0M与1MNaCl的10mMPBS(PH6.4)各300ml。分部收集目的蛋白，测定活性，并电泳检测组分，合并单一目的蛋白馏份，转入SephadexG-100柱纯化。
6.根据权利要求1、5所述的一种重组枯激酶的生产工艺，其特征在于用PEG-10000浓缩目的蛋白。即在CM-52柱梯度洗脱时，枯激酶在0.15-0.2MNaCl浓度时被洗下，收集后，用PEG浓缩为5ml左右，过SephadexG-100柱除盐和进一步纯化。
7.根据权利要求1、6所述的一种重组枯激酶的生产工艺，其特征在于SephadexG-100柱层析纯化目的蛋白。即SephadexG-100柱(0.8cm100cm)，经10mMPBS(PH7.4)平衡后，将5ml浓缩的CM-52柱样品，缓慢加入，样品进入胶后，加入10mMPBS(PH7.4)。开始洗脱。紫外280mμ检测，收集峰馏份，洗脱峰呈对称状，所得活性馏份电泳检测为单一条带的枯激酶。
全文摘要
重组枯激酶的生产方法及其生物活性,本发明属于生物工程技术,其主要解决自然菌产生枯激酶量少、发酵时间长,难以用于生产等问题。在自行筛选的Batillus Subtilis发酵产生枯激酶的基础,克隆出该酶基因,建立了一整套基因工程菌发酵,诱导表达,包涵体分离,洗涤,裂解,变性,复性和蛋白质纯化工艺,获得重组枯激酶纯品,其体外具有溶解纤维蛋白和凝结血块能力,体内有促进内皮细胞产生t－PA缩短优球蛋白溶解时间,及强的纤溶酶样活性。表明重组枯激酶可能作为新一代基因工程溶栓药物。
文档编号C12N15/52GK1336432SQ0011592
公开日2002年2月20日 申请日期2000年7月31日 优先权日2000年7月31日
发明者王春生, 杨志兴, 吴晶, 林元通, 程汉强, 许文娟 申请人:武汉迪普生物技术有限公司