专利名称：一种重组牛肠激酶的生产方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域。更具体地，本发明提供了一种高效生产重组牛肠激酶(Enterokinase or Enteropeptidase，EK)的生产方法，以及有关的工程细胞的构建、重组牛肠激酶的表达和纯化工艺。
背景技术：
目前，在生物学领域，很多时候要求切割蛋白，把靶蛋白和运载蛋白切开，因此需要在靶蛋白和运载蛋白的连接区设计特异的蛋白酶解位点，已经有许多商业化载体在其多克隆位点前和编码运载蛋白序列之间加入了蛋白酶解位点的序列。常见的蛋白酶主要有Xa因子、凝血酶、肠激酶(Enterokinase orEnteropeptidase)等等。但值得指出的是，实际操作中这些酶在很多时候不能够实现完全切割。另外，蛋白酶的特异性也不是绝对的，如凝血酶的最佳切割位点有两种，可见其在实际物系中发生非特异切割的可能性很大。
基于以上种种原因，在众多备选的酶解方法中，肠激酶作为一种对(Asp)4-Lys序列表现出高度特异性的丝氨酸蛋白酶，因其反应条件相对比较宽松，在pH4.5-9.5、温度4℃-45℃之间完全保有活性；有无变性剂也均不影响酶切作用。反应过程中底物蛋白质其他无关部位发生断裂的可能性低，并且其切割位点在全部识别序列之后，切出的目标蛋白首位氨基酸可完全忠实于天然蛋白等特点，在基因工程制药领域成为融合表达时下游纯化的首选工具酶之一。
肠激酶是脊椎动物十二指肠壁粘膜分泌的一种司职食物消化的蛋白酶，近年于微生物、血液、昆虫、海星中也发现有类似物。牛的肠激酶由大小两个亚基组成，其中小亚基具有酶活中心的基本特征，因而被命名为催化亚基，由235个氨基酸组成，理论分子量26,262道尔顿，理论等电点(pI)5.1，其保有全酶的酶切活性与对底物的高度特异性，为牛肠激酶在基因工程制药领域被广泛研究与应用奠定了基础。
国外对重组牛肠激酶催化亚基(EKL)的表达研究始于1993年，由美国GI公司LaVallie等在哺乳动物细胞COS中进行了功能性表达，随后以人工合成的六肽底物Gly-(Asp)4-Lys-β-萘胺和天然底物胰蛋白酶原验证了这种由705bp编码的重组蛋白亚基保持着全酶的活性，拉开了以基因工程的方法生产重组牛肠激酶催化亚基(rEKL)的序幕。1995年Lisa在大肠杆菌中融合表达rEKL，并在目标蛋白编码序列前引入肠激酶识别位点，融合蛋白经自催化切割释放出活性rEKL。重组蛋白酶活与在COS中的报道基本一致，但产率增至1mg/125mg湿菌。相较于用提纯的方法获得的天然牛肠激酶全酶(EKn)，rEKL对天然底物胰蛋白原的活性要低几十倍，而相反对人工底物如白介11融合蛋白的酶切活性比EKn要高出上百倍。
1996年Laura等首次尝试应用酵母表达系统分泌表达rEKL，经离子交换与亲和层析纯化后，目标蛋白产量达6.3mg/L发酵液上清，其活性也明显高于大肠杆菌和哺乳动物细胞表达系统。进而，该产品被应用于当时美国正在新药研发阶段的重组人白细胞介素11的下游纯化，取得了令人满意的结果。随后，研究小组所属的Invitrogen公司将此重组酶制剂商品化，广泛应用于基因工程制药领域和其他以EK为识别位点的融合蛋白。
2000年南斯拉夫的一个科研小组成功地将EKL在丝状真菌(filamentousfungus Aspergillus niger)进了高效分泌表达，活性蛋白收率1.9mg/L培养液上清。2001年韩国科学家Seong首次将组氨酸亲和标记引入rEKL的3’端，在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达并有效地分泌到培养基中。rEKL-(His)6产量为1mg/L发酵液上清，其活性与大肠杆菌表达系统持平。
国内目前对重组肠激酶的研究还很少，仅有的公开报道是2002年YUAN等运用Trx-EKL融合表达体系对肠激酶催化亚基进行了原核表达，纯化后酶产量4.3mg/100mL发酵液，酶比活720U/mg蛋白。中国专利2004100148607采用毕赤氏酵母中表达了在末端添加了组氨酸标签的重组黄牛肠激酶催化亚基，得率5mg/L。
因此目前重组牛肠激酶的生产存在工艺复杂，成本高，产物得率低，活性弱等问题。目前商品化的动物肠组织来源的肠激酶全酶活性不高，且常伴污染性丝氨酸蛋白酶的出现。而且因进口酶制剂本身的高成本，使得采用此酶的融合表达一向被称为是“一套昂贵的表达体系”。
随着越来越多的基因工程产品采用融合表达策略，rEKL具有重要的市场利用价值，而且对进一步促进我国蛋白融合技术的发展与应用也具有极其重要的意义。
本发明提供了一种高效生产重组牛肠激酶的生产方法，采用新型毕赤酵母表达体系分泌表达牛肠激酶催化亚基，通过优化其基因序列，并优化发酵与纯化工艺，获得快速、简便、稳定、活性高的一种牛肠激酶的生产方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高效简便的生产重组牛肠激酶的方法。
本发明的另一目的就是提供重组牛肠激酶的编码序列和用于该方法的表达载体及工程细胞。
在本发明的第一方面，就是提供了一种编码重组牛肠激酶的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列编码区与SEQID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
在另一优选例中，所述的核苷酸序列含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有权利要求1所述的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的表达载体是pGAPZA/α-EKL。
在本发明的第三方面，提供了一种工程细胞，其特征在于，它整合有权利要求3所述的表达载体。
在另一优选例中，所述的工程细胞是毕赤酵母。
在本发明的第四方面，提供了一种生产重组牛肠激酶的方法，该方法包括步骤a)在适合的表达条件下，培养如权利要求5所述的宿主细胞，从而分泌表达出重组牛肠激酶；b)分离纯化分泌的重组牛肠激酶蛋白。
图1是融合基因α-EKL的构建示意图。
图2是重组质粒pGAPZA/α-EKL构建示意图。
具体实施例方式
本发明人通过深入而广泛的研究，通过基因编码序列的优化设计，在胞外构建了含有酿酒酵母α-因子前导肽序列的重组牛肠激酶融合蛋白基因，使其在毕赤酵母细胞内中高效分泌表达。在此基础上完成了本发明。
根据重组牛肠激酶催化亚基天然氨基酸序列，按密码子偏爱性，在不改变氨基酸序列的条件下，全基因合成重组牛肠激酶催化亚基的目的基因序列，将该基因克隆到pUCl9中测序验证后，用分子生物学方法，体外构建融合蛋白α-EKL的融合序列，然后克隆入表达载体pGAPZA。转化、整合入P.pastoris宿主细胞染色体，通过施加不同浓度抗性，筛选抗性最强克隆，进而筛选出高表达工程细胞。摇瓶试验表明，生长48小时后，表达水平5mg/L以上。
在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程细胞。在本发明中，工程菌表达的重组牛肠激酶发酵条件没有特别限制。可以采用本领域常规的发酵条件。例如，合适的培养基包括(但不限于)以下组成(i)氮源含有机氮源和无机氮源，其中有机氮源如蛋白胨、酵母粉，或二者的混合物，总浓度0.1-3％；无机氮源如氨水或NH4Cl、(NH4)2SO4等铵盐，浓度0-1.5％。
(ii)无机盐包括磷酸盐、枸盐酸盐、Mg2+盐等。较佳地，磷酸盐缓冲体系浓度20-200mM，pH5-8；Mg2+盐0-5mM。
(iii)在培养基中添加维生素B1作为补充维生素，浓度1～1000PPM。
(iv)根据M9培养基中的微量元素配方，微量元素可加0.1-2ml/L培液。
(v)碳源包括甘油、葡萄糖、乳糖等。可以是单一碳源，也可以是混合碳源。较佳地，碳源选自下组甘油浓度为0.1-3％；乳糖浓度为0.1-3％；葡萄糖浓度为0.1-1.5％。
为大规模获得重组牛肠激酶，需要在发酵罐中进行优化培养。本发明研究了中试发酵工艺，优化后的表达水平达到30mg/L。
在发酵表达重组牛肠激酶后，对表达的rEKL进行分离。
通常，发酵样品先以离心、过滤等方式获得发酵液上清，去除菌体。发酵液上清可通过盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析纯化，也可直接进行层析纯化。
适用于本发明的层析技术包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
经过2-3步纯化，可得到rEKL纯品，纯化得率40％以上，纯度95％以上，纯品得率约12mg/L发酵液。
纯化后rEKL的酶活活性用融合蛋白底物法测定，经测定，其比活约为2.5×106IU/mg。
在本发明的一个实例中，提供了重组牛肠激酶融合蛋白基因的获得及表达质粒的构建，优化后的基因使得表达重组牛肠激酶的表达量提高。
在本发明的另一个实例中，通过筛选获得了高表达重组牛肠激酶的菌株，提高了重组牛肠激酶的表达量。
在本发明的另一个实例中，通过不同启动子之间的比较，选择合适的表达载体表达重组牛肠激酶蛋白。
在本发明的另一个实例中，经过发酵工艺的优化，进一步提高了重组牛肠激酶的表达量。
在本发明的另一个实例中，经过纯化工艺优化，可得到纯品12mg/L。
中试研究表明，产品制造工艺稳定，操作简单，周期短，成本低，每升发酵液可获得重组牛肠激酶纯品12mg。适合产业化生产。
本发明的优点在于(1)优化了牛肠激酶催化亚基基因序列，并在该序列前导入了酿酒酵母α-因子前导肽序列，该融合蛋白基因非常适合在毕赤酵母中分泌表达，具有高表达、高稳定的特点。
(2)表达工艺简单，表达载体含有不需要甲醇诱导的启动子，能组成型的高效表达牛肠激酶，在发酵过程中无需更换培养基或添加诱导剂，简化了操作工艺，比甲醇作为诱导剂的表达菌具有更高的安全性，有利于规模化生产。
(3)通过控制关键的发酵工艺条件，使表达水平进一步提高。
(4)纯化工艺简便，回收率高。由于是分泌蛋白，因此简化了纯化工序，使纯化回收率大大提高，使大规模生产重组牛肠激酶成为可能。
(5)采用毕赤酵母为工程细胞，很好地保持了重组牛肠激酶的活性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 融合基因的获得及表达质粒的构建根据牛肠激酶催化亚基的氨基酸序列，考虑毕赤酵母的密码子偏爱性，全基因合成编码重组牛肠激酶催化亚基的目的基因序列，将该基因序列克隆到pUC19中并测序验证。融合蛋白α-EKL的构建见图1，以含有rEKL编码序列的质粒pUC19/rEKL为模板，通过PCR扩增得到可与酿酒酵母α-因子前导肽序列以正确的框架进行融合的EKL基因。同时，以含有酿酒酵母α-因子前导肽编码序列的质粒pPIC9K(购自Invitrogen公司)为模板，PCR扩增得到α-因子前导肽序列。把纯化后的上述两种PCR产物分别用限制酶XhoI进行消化，对两种酶切产物进行连接。以连接产物为模板进行PCR扩增，得到可用于分泌表达的融合基因α-EKL。
重组质粒构建线路如图2所示，将人工合成的α-EKL基因用EcoRI进行酶切处理后，琼脂糖凝胶电泳回收约1kb片段；同时将质粒pGAPZA(购自Invitrogen公司)用EcoRI进行酶切，回收大片段。将两个片段用T4 DNA连接酶进行连接，连接产物转化进入大肠杆菌DH5α(购自Promega公司)。小量制备质粒，通过酶切鉴定含α-EKL的阳性克隆。pGAPZA接入外源基因后可以将其多拷贝整合到宿主菌的染色体上进行高效表达，同时本身携带有一个Zeocin抗性基因，可以用于转化子的筛选。载体pGAPZA多克隆位点前有组成性表达的GAP启动子，不需诱导剂即可在宿主菌GS115中高效表达外源基因。
实施例2 高表达重组牛肠激酶工程菌株的筛选将构建好的重组质粒pGAPZA/α-EKL大量制备，线性化，电穿孔转化宿主细胞P.pastorisGS115，涂布含有不同浓度抗生素Zeocin的YPDS平板筛选高抗的阳性克隆，并进行小摇表达实验筛选得到重组牛肠激酶高表达的工程酵母菌株(含α-EKL)。
实施例3 选择合适的表达载体在构建重组质粒pGAPZA/α-EKL时，我们同时构建了重组质粒pPIC9K/rEKL，通过与实施例2相似的过程，我们获得了重组牛肠激酶高表达的工程酵母菌株(含rEKL)。将这两个工程酵母菌株在表达环境、表达时间等一致的前提下的表达量做了一个比较，发现含α-EKL工程酵母菌株中牛肠激酶的表达量明显高于含rEKL的工程酵母菌株。根据结果，我们选择GAP作为表达肠激酶的首选启动子。
实施例4 添加不同蛋白保护剂对表达水平的影响取单克隆，接种到BMGY一级种子液中，培养17-20hr；按1∶10的比例二级接种于250ml BMGY的1L三角烧瓶中，培养4~8hr左右，上罐发酵，pH 5.0、温度20℃、DO＞35％，待溶氧上升后流加50％甘油内含10％CA，或10％Peptone或10％Tryptone的培养液，36hr后取样。样品检测SDS-PAGE和蛋白含量以确定诱导阶段的最佳蛋白保护剂。
实施例5 重组肠激酶纯化对发酵液进行超滤浓缩，将发酵液的缓冲体系替换为磷酸盐溶液PB。超滤浓缩及更换缓冲液使用Millipore超滤器，超滤膜截流分子量为10KD，超滤时留取浓缩液(作用是去除小分子杂质和盐类)。发酵液上清超滤至体积剩下500ml左右，加入PB，继续超滤；反复此程序，直至样品的电导水平和PB缓冲液的电导水平接近。
层析1(阴离子交换层析)层析介质Q Sepharose FF缓冲液溶液APB溶液BPB+1M NaCl上样将超滤浓缩的hK5溶液上样。
清洗上样后用6CV的溶液A清洗层析柱。
梯度清洗后用10CV将溶液B从0％升至100％。
收集收集EKL样品峰。
层析2(疏水层析)层析介质phenyl Sepharose FF缓冲液溶液APB+1M NaCl溶液BPB上样将层析1的样品峰上样。
清洗上样后用6CV的溶液A清洗层析柱。
梯度清洗后用10CV将溶液B从0％升至100％。
收集收集EKL样品峰。
层析3(分子筛层析)层析介质Sephadex 75缓冲液PB上样层析1收集的样品主分。
样品经过此三步纯化，即阴离子交换层析、疏水层析、分子筛层析以后，纯度提高至95％以上，可得蛋白纯品12mg/L。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海新生源医药研究有限公司<120>一种重组牛肠激酶的生产方法<160>2<210>1<211>705<212>DNA<213>人工序列<221>misc_feature<222>(1)…(705)<223>优化的重组牛肠激酶序列<400>1attgtcggag gaagtgactc cagagaagga gcctggcctt gggtcgttgc tctgtatttc 60gacgatcaac aggtctgcgg agcttctctg gtgagcaggg attggctggt gtcggccgcc 120cactgcgtgt acgggagaaa tatggagccg tctaagtgga aagcagtgct aggcctgcat 180atggcatcaa atctgacttc tcctcagata gaaactaggt tgattgacca aattgtcata 240aacccacact acaataaacg gagaaagaac aatgacattg ccatgatgca tcttgaaatg 300aaagtgaact acacagatta tatacagcct atttgtttac cagaagaaaa tcaagttttt 360cccccaggaa gaatttgttc tattgctggc tggggggcac ttatatatca aggttctact 420gcagacgtac tgcaagaagc tgacgttccc cttctatcaa atgagaaatg tcaacaacag 480atgccagaat ataacattac ggaaaatatg gtgtgtgcag gctatgaagc aggaggggta 540gattcttgtc agggggattc aggcggacca ctcatgtgcc aagaaaacaa cagatggctc 600ctggctggcg tgacgtcatt tggatatcaa tgtgcactgc ctaatcgccc aggggtgtat 660gcccgggtcc caaggttcac agagtggata caaagttttc tacat 705
<210>2<211>235<212>PRT<213>智人<400>2Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val1 510 15Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu Val Ser20 25 30Arg Asp Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Arg Asn Met35 40 45Glu Pro Ser Lys Trp Lys Ala Val Leu Gly Leu His Met Ala Ser Asn50 55 60Leu Thr Ser Pro Gln Ile Glu Thr Arg Leu Ile Asp Gln Ile Val Ile Asn65 70 75 80Pro His Tyr Asn Lys Arg Arg Lys Asn Asn Asp Ile Ala Met Met His85 90 95Leu Glu Met Lys Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro Ile Cys Leu100 105 110Pro Glu Glu Asn Gln Val Phe Pro Pro Gly Arg Ile Cys Ser Ile Ala115 120 125Gly Trp Gly Ala Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Thr Ala Asp Val Leu Gln130 135 140 145Glu Ala Asp Val Pro Leu Leu Ser Asn Glu Lys Cys Gln Gln Gln Met150 155 160Pro Glu Tyr Asn Ile Thr Glu Asn Met Val Cys Ala Gly Tyr Glu Ala165 170 175Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met Cys180 185 190Gln Glu Asn Asn Arg Trp Leu Leu Ala Gly Val Thr Ser Phe Gly Tyr195 200 205Gln Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Pro Arg210 215 220 225Phe Thr Glu Trp Ile Gln Ser Phe Leu His230 23权利要求
1.一种编码牛肠激酶催化亚基蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列编码区与SEQ ID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
2.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，它是含有GAP启动子。
4.一种工程细胞，其特征在于，它整合有权利要求3所述的表达载体。
5.如权利要求4所述的工程细胞，其特征在于，它是毕赤酵母。
6.一种牛肠激酶的生产方法，其特征在于，该方法包括步骤(a)在适合的表达条件下，培养如权利要求5所述的工程细胞，从而分泌表达出牛肠激酶蛋白；(b)分离纯化出表达的牛肠激酶蛋白。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(a)所示的表达条件为诱导时间为12-120小时，较佳的为24-100小时；诱导pH为3-9，较佳的为5-7。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(b)所示的表达条件为(1).发酵液通过简单离心或超滤获得含有目的蛋白的上清液；(2).通过简单的离子交换层析、疏水层析等简单步骤，即可获得纯度在95％以上的纯品。
全文摘要
本发明提供了一种重组牛肠激酶的核苷酸序列，高效生产重组牛肠激酶的生产方法，以及有关的表达载体与工程细胞构建、表达和纯化的工艺。优化后的重组牛肠激酶蛋白基因非常适合在毕赤酵母中组成型分泌表达，同时通过发酵与纯化工艺优化，提高了表达量和纯化得率，具有表达高、稳定性好、活性高、生产工艺简便的优点。本发明可高效、简便、低成本的获得重组牛肠激酶纯品。
文档编号C12N9/64GK1869236SQ20051002613
公开日2006年11月29日 申请日期2005年5月24日 优先权日2005年5月24日
发明者孙九如, 任军, 黄阳滨, 杜碧金, 沈丽丽 申请人:上海新生源医药研究有限公司