专利名称：重组人b淋巴细胞刺激因子的分离纯化工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组蛋白质的分离纯化工艺，尤其是一种重组人B淋巴细胞刺激因子rhsBLyS的分离纯化工艺。
背景技术：
人B淋巴细胞刺激因子(hBLyS)是Moore PA等人(Science.1999 Jul9；285(5425)260-3)1999年新发现的一种与人体免疫调控密切相关的细胞因子，属肿瘤坏死因子(TNF)超家族，为II型跨膜蛋白，主要在人体外周血单核细胞、脾脏、淋巴结、骨髓等组织中表达，并能在某些金属蛋白酶的作用下以胞外可溶性部分(hsBLyS)游离于外周血中发挥作用。hsBLyS是一种淋巴细胞的共刺激因子，对活化的B细胞有强烈的促进增殖和分化的刺激作用对正常的B细胞，在用PMA和Anti-IgM预活化后，hsBLyS能诱导其大量增殖并分泌各型免疫球蛋白，其中大部分为IgM和IgA。在体内，hBLyS对囊外B细胞的活化及抗原特异性IgM的分泌；免疫球蛋白的同型转换；脾脏生发中心(GC)的形成有重要作用；同时hBLyS对CD4+和CD8+亚型T细胞也有间接活化作用。
Novak AJ等人(Blood.2004 Jan 15；103(2)689-94.Epub 2003 Sep 25)证明hBLyS有三个受体B细胞成熟蛋白(Bcell maturation protein BCMA)、跨膜激活CAML作用因子(Transmembrane activator and CAML-interactor TACI)和BAFF-R。三者均属于TNF受体超家族，胞外有两个富含Cys的重复序列，胞内没有死亡结构域(Death Domain DD区)。hBLyS与其受体作用后，可能通过TNF受体结合蛋白(TNFR-associated factors TRAFs)家族中的某些成员，活化，促进细胞增殖和分化。
rhsBLyS是采用反转录PCR技术克隆其cDNA片段，并将其插入到表达载体，构建重组表达质粒，并转化到大肠杆菌或真核细胞中，筛选高效稳定表达rhsBLyS的工程细胞株，对其表达产物进行蛋白分离纯化和性质鉴定。hBLyS自1999年被发现以来，引起了欧美各国学者的高度重视，包括一些著名的生物技术和制药公司在内的许多研究机构已在国际著名刊物上发表了是上百篇相关论文，对其作用机制、受体信号和动物模型等作了一定的研究，结果表明体内hBLyS的水平对维持机体免疫系统的“稳态”非常重要，hBLyS表达缺陷将极大的降低人体的免疫能力；而其过量表达已被证明与红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病密切相关(Ramanujam M.Arhritis Res Ther.2004；6(5)197-202.Epub 2004 Jul 29)，另外，hBLyS还与B系肿瘤、艾滋病及器官移植排斥的发生有关。对hBLyS作用机理的深入探讨将有助于阐明人体免疫系统尤其是体液免疫机制，并对相关疾病的治疗有重要价值。2000年11月，美国HGSI公司开发的作为治疗普通可变性免疫缺陷症(CVID)的重组hBLyS的胞膜外可溶性功能区(rhsBLyS)，已经FDA批准进入人体II期临床试验。中国国内还没有临床实验报道。
从1999年发现BLyS的早期，Moore PA等人(Science.1999 Jul9；285(5425)260-3)克隆到其基因，并在真核细胞中得到了表达。由于真核细胞培养成本昂高，放大困难，得率低，且糖基化修饰不会影响rhsBLyS的活性。此后，很多研究机构开始实现了大肠杆菌的表达，张志方(中山大学学报自然科学版，2002年41卷3期72-76页)和高会广(中国生化药物杂志2004年第25卷第1期1-5页)等人将GST，His等标签与hsBLyS融合表达，然后通过亲和层析制备了纯度较高的样品，但这种样品由于引入了标签蛋白，在人体内使用会产生严重的免疫反应，从而限制了其临床应用。
重组蛋白rhsBLyS作为异源蛋白，在细菌中大量表达常会导致生成无活性的包涵体。跟可溶形式的蛋白质产物相比，包涵体蛋白具有一定的优势，包括产物浓度高，不易被宿主的蛋白酶降解，对宿主细胞的毒性较低等。但是怎样将无活性、错误折叠的包涵体蛋白转化为可溶的具有生物活性的产物，是摆在研究者面前的一大问题。高浓度的变性剂和还原剂溶解包涵体，溶解后除去过多的变性剂和还原剂以诱导蛋白质重折叠。传统的方法主要有稀释、透析、超滤等，但都具有一定的局限性。稀释法由于操作简便，应用较广，然而，变性的蛋白质被稀释进入复性缓冲液时，必须严格控制在较低的浓度，以防止蛋白质聚集，这就不可避免的扩大反应体积，耗费大量的时间和缓冲液，要求巨型的反应容器和大量的变性剂，使后续工作较为繁琐。透析总会引起蛋白质附着在透析袋上造成损失，此外还耗费时间。超滤是一个较好的选择，因为可以迅速除去变性剂。但是，蛋白质聚集体会堵住膜孔，并且，不利于大规模使用。目前在纯化工艺中大多采用了稀释复性和透析复性，这些工艺具有不易放大，可重复性差以及成本昂贵等缺点。
发明内容
为了克服现有工艺不易放大、可重复性差、成本高的不足，本发明提供一种采用凝胶过滤柱上复性工艺，有效地解决了问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是将含有重组蛋白rhsBLyS的包涵体进行分离纯化和溶解；然后Sephacryl S-200凝胶过滤柱上复性；DEAESepharose.F.F柱层析；收集目的蛋白峰，经过0.22微米过滤；所得蛋白即为重组人B淋巴细胞刺激因子。
本发明优选的技术方案的具体操作如下包涵体的分离纯化和溶解用50mM Tris-HCl，5mM EDTA，0.15M NaCl，pH 8.0，洗涤包涵体，离心收集沉淀，重复3-4次，用50mM Tris-HCl，3M urea，5mM EDTA，0.15mM NaCl，pH 8.0，洗涤包涵体离心收集沉淀，重复3-4次，用0.5％Triton X-100(v/v)，5mM EDTA，0.15mM NaCl，pH 8.0，洗涤包涵体离心收集沉淀，重复3-4次，用50mM Tris-HCl，8M尿素，0.15M DTT，溶解包涵体；Sephacryl S-200凝胶过滤柱上复性用50mM Tris-HCl，5mMEDTA，150mM NaCl，pH 8.0平衡凝胶过滤柱，用变性蛋白经过0.45μm过滤后上样，用50mM Tris-HCl，5mMEDTA，150mM NaCl，1.25mM GSH，0.25mM GSSG，pH8.0的缓冲液洗脱，收集洗脱蛋白峰，用洗脱蛋白峰于50mM Tris-HCl，50mM NaCl(pH 7.4)缓冲液中4℃透析12-24h；DEAE Sepharose.F.F柱层析用50mM Tris-HCl，50mM NaCl(pH 7.4)缓冲液平衡6-10个柱体积，用透析过后的蛋白上样，用50mMTris-HCl缓冲液(pH 7.4)，NaCl浓度采用线形梯度从0.1M到1M，收集洗脱蛋白峰，收集目的蛋白峰经过0.22μm膜过滤。
本发明根据复性前后的蛋白质分子大小不同，利用凝胶介质加以分离，洗脱出来。可将各系统之间的相互作用转化为不同的流体体积，由此观察到蛋白质在折叠过程中伴随着流体半径的改变，不同状态的蛋白质得以分离，获得更为真实的结果。凝胶过滤柱上复性是一个动态的过程，蛋白质在穿过柱子的过程中柱子的分配系数有所改变。该过程涉及到两个关键步骤第一是蛋白质溶于高浓度变性剂溶液中，进入层析柱床。蛋白质完全变性，没有活性，处于外水体积中不进入凝胶孔，而变性剂可以自由扩散进入凝胶微孔内，蛋白质得以与变性剂相分离而开始复性。第二个步骤是用复性缓冲液对蛋白质进行洗脱复性。复性过程中蛋白质大小发生改变，完全折叠或部分折叠的蛋白质流体半径减少，得以进入部分凝胶微孔内而与变性蛋白质相分离。变性剂分子最小，可以完全进入凝胶微孔，移动速度最慢，因而最晚被洗脱。由于蛋白质的折叠中间体进入凝胶微孔，彼此之间被凝胶介质分离开来，减少了相互作用的机会，抑制了聚集的生成。凝胶过滤柱上复性时变性蛋白质的浓度高达10-20mg/ml。
本发明的有益效果是，不使用反相层析和有机溶剂，采用新颖的凝胶过滤柱上复性，简化了复性的过程，提高回收率，可以大规模工业化制备药用级的重组人B淋巴细胞刺激因子蛋白。
将本发明分离纯化工艺得到的产物，进行下列鉴定及分析表明，该产物即是高纯度的hsBLyS，其活性与标准品基本一致。
SDS-PAGE测定纯度，如图5所示，表明纯度大于98％。
HPLC检测纯度，标准品结果为图6，纯化样品的结果为图7，纯度大于98％。
Western blotting检测免疫原性，结果如图5。表明最终产物具有免疫原性。
N-末端氨基酸序列分析，结果表明其中N端前12个氨基酸序列是AVQGPEETVTQD，与预测一致。
质谱测定分子量，结果见图8，分子量为17.5与预测一致。
圆二色谱分析，结果见图9，表明复性后的产物具有典型的β-sheet，与解析出的晶体结构数据一致。
荧光光谱分析，结果见图10，表明复性后产物中酪氨酸所处的空间位置较复性前发生了改变。
紫外吸收光谱分析，见图11，结果表明hsBLyS最终产物与标准品一致，在275nm出现一吸收峰。
红外光谱分析，标准品结果见图12，hsBLyS的红外光谱分析见13，表明与标准品一致。
共刺激人B淋巴细胞增殖的活性分析，结果如图14，表明纯化后的产物与标准品活性几乎一致，能够在抗IgM协同刺激下，刺激B淋巴细胞的增殖。
图1是hsBLyS的诱导表达SDS-PAGE电泳图其中MMarker；1未诱导全菌；2诱导全菌；3超声上清；4超声沉淀。
图2是hsBLyS包涵体纯化SDS-PAGE电泳图其中MMarker；1超声沉淀；2Tris-HCl洗涤；33M尿素洗涤；4TritonX-100洗涤。
图3是Sephacryl S-200柱上复性层析图其中1、2杂蛋白；3目的蛋白。
图4是阴离子交换层析图其中4目的蛋白；5杂蛋白。
图5是SDS-PAGE检测hsBLyS纯度和Western blotting检测免疫原性示意图其中1Marker；2最终纯化产物浓缩20倍；3Western blotting结果。
图6是hsBLyS标准品(美国Peprotech)HPLC7是本发明产物的HPLC8是本发明纯化产物质谱9是本发明产物的圆二色谱分析10是本发明产物的荧光光谱分析11是hsBLyS的紫外吸收光谱分析图其中1本发明纯化产物；2标准品(美国Peprotech)。
图12是hsBLyS标准品的红外光谱分析13是本发明纯化产物的红外光谱分析14是体外hsBLyS刺激人B淋巴细胞增殖示意图具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
实施例1表达菌株BL21(DE3)过夜活化12小时，第二天按1∶100接种在500ml液体LB培养基(2L摇瓶)，共2瓶，培养至菌密度OD600为0.6，IPTG终浓度为1mM诱导表达5小时，温度控制在37℃，摇床速度为220rpm/min；5000-1000rpm/min，4℃离心收集菌体沉淀，诱导表达情况见图1；包涵体的分离纯化和溶解50Mm Tris-HCl，5mM EDTA，0.15M NaCl，pH 8.0，洗涤包涵体，5000rpm/min，4℃.离心15min，收集沉淀，重复3-4次；50mMTris-HCl，3M urea，5mM EDTA，0.15mM NaCl，pH 8.0，洗涤包涵体30min，4℃.离心15min，收集沉淀，重复3-4次；0.5％Triton X-100(v/v)，5mM EDTA，0.15mM NaCl，pH 8.0，洗涤包涵体30min，4℃.离心15min，收集沉淀，重复3-4次，用8ml 50mM Tris-HCl，8M尿素，0.15M DTT 4℃溶解包涵体12h，包涵体纯化情况见图2；凝胶过滤柱上复性凝胶过滤柱Sephacryl S-200(2.6×80cm)用50mMTris-HCl，5mM EDTA150mM NaCl，pH 8.0平衡6个柱体积。变性蛋白经过0.45μm过滤后上样，50mM Tris-HCl，5mM EDTA，150mM NaCl，1.25mM GSH，0.25mM GSSG，pH 8.0的缓冲液洗脱，收集洗脱蛋白峰。柱上复性层析图见图3，洗脱蛋白峰于50mM Tris-HCl，50mM NaCl(pH 7.4)缓冲液中4℃透析12h；DEAE Sepharose.F.F柱层析阴离子交换柱DEAE-Sephorose Fast Flow用50mM Tris-HCl，50mM NaCl(pH 7.4)缓冲液平衡6个柱体积。用透析过后的蛋白上样，用50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)，NaCl浓度采用线形梯度从0.1M到1M。收集洗脱蛋白峰，收集目的蛋白峰经过0.22μm膜过滤，得纯化产物。离子交换层析见图4。
实施例2SDS-PAGE测定纯度制备15％浓度的分离胶，浓缩最终纯化产物20倍，与2×上样缓冲液(125mM Tris-HCl，pH 6.8，20％甘油，4％SDS，0.005％溴酚蓝，10％of 2-巯基乙醇)混合，沸水浴5min后上样电泳，考马斯亮蓝R-250染色，如图5。
实施例3HPLC检测纯度将冻干后的纯化产物样品和标准品分别溶解在pH7.4的PBS缓冲液中，浓度100μg/ml，流动相为PBS，温度为20-25度，流速控制在0.5mg/ml，OD280紫外检测器检测，见图6、图7。
实施例4Western blotting检测免疫原性纯化产物样品经SDS-PAGE电泳后转移到PVDF膜上，5％MTBS(50mMTris-HCl含有5％脱脂牛奶，pH 7.4)37℃封闭1小时，TBST(含有0.05％Tween 20，pH 7.4)洗涤15min，1∶1000鼠抗人hsBLyS IgG(ProSci incorporated，USA)37℃孵育90min。膜用TBST清洗10min，共三次，接着1∶500 TBST稀释的HRP偶联的羊抗鼠IgG(Santa Cruz Biotechnology，USA)37℃孵育60min，TBST清洗10min，共三次.TMB显色，结果见图5。
实施例5N-末端氨基酸序列分析产物样品经SDS-PAGE电泳后转移到PVDF膜上，Edman降解后，美国Applied Biosystems Model Procise automated proteinsequenator 491上测序。
实施例6质谱测定分子量最终纯化的产物脱盐处理制成干粉，于ABI Voyager-DEPro质谱工作站分析，见图8。
实施例7圆二色谱分析将纯化的产物用pH7.4的PBS缓冲液溶解为100μg/ml，光径0.05cm，于J-810 spectropolarimeter圆二色谱仪测定200-250nm远红外CD谱，见图9。
实施例8荧光光谱分析将纯化的hsBLyS溶解于pH7.4的PBS缓冲液，浓度100μg/ml，于FluoroMax-2 spectrofluorimeter荧光光谱仪测定，激发波长为280nm，扫描波长范围300-400nm，见图10。
实施例9紫外吸收光谱分析将纯化的hsBLyS溶解于去离子水，以相同的去离子水做空白，在日本岛津UV-240记录式紫外分光光度计上扫描，测定波长范围190-320nm，见图11。
实施例10红外光谱分析将纯化的hsBLyS干粉用KCN压片，红外光谱仪BRUKERVECTOR22测定。标准品结果见图12。hsBLyS的红外光谱分析见13。
实施例11共刺激人B淋巴细胞增殖的活性分析从健康人外周血中分离人B淋巴细胞(Proliferative Assays For B Cell Function，Current Protocols inImmunology，UNIT 3.10)，加入anti-IgM和纯化产物，终浓度分别为10μg/ml和2μg/ml，37℃、5％CO2培养箱中培养72h，之后采用MTT法测细胞密度，见图14。
权利要求
1.重组人B淋巴细胞刺激因子的分离纯化工艺是将含有重组蛋白rhsBLyS的包涵体进行分离纯化和溶解；然后Sephacryl S-200凝胶过滤柱上复性；DEAE Sepharose.F.F柱层析；收集目的蛋白峰，经过0.22微米过滤；所得蛋白即为重组人B淋巴细胞刺激因子。
2.根据权利要求1所述的重组人B淋巴细胞刺激因子的分离纯化工艺，其特征在于，具体操作如下包涵体的分离纯化和溶解用50mM Tris-HCl，5mM EDTA，0.15M NaCl，pH8.0，洗涤包涵体，离心收集沉淀，重复3-4次，用50mM Tris-HCl，3M urea，5mM EDTA，0.15mM NaCl，pH8.0，洗涤包涵体离心收集沉淀，重复3-4次，用0.5％Triton X-100(v/v)，5mM EDTA，0.15mM NaCl，pH8.0，洗涤包涵体离心收集沉淀，重复3-4次，用50mM Tris-HCl，8M尿素，0.15M DTT，溶解包涵体；Sephacryl S-200凝胶过滤柱上复性用50mM Tris-HCl，5mM EDTA，150mM NaCl，pH8.0平衡凝胶过滤柱，用变性蛋白经过0.45μm过滤后上样，用50mM Tris-HCl，5mM EDTA，150mM NaCl，1.25mM GSH，0.25mM GSSG，pH8.0的缓冲液洗脱，收集洗脱蛋白峰，用洗脱蛋白峰于50mM Tris-HCl，50mM NaCl(pH7.4)缓冲液中4℃透析12-24h；DEAE Sepharose.F.F柱层析用50mM Tris-HCl，50mM NaCl(pH7.4)缓冲液平衡6-10个柱体积，用透析过后的蛋白上样，用50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，NaCl浓度采用线形梯度从0.1M到1M，收集洗脱蛋白峰，收集目的蛋白峰经过0.22μm膜过滤。
全文摘要
本发明涉及一种重组蛋白质的分离纯化工艺，尤其是一种重组人B淋巴细胞刺激因子rhsBLyS的分离纯化工艺。本发明所采用的技术方案是将含有重组蛋白rhsBLyS的包涵体进行分离纯化和溶解；然后Sephacryl S－200凝胶过滤柱上复性；DEAE Sepharose.F.F柱层析；收集目的蛋白峰，经过0.22微米过滤；所得蛋白即为重组人B淋巴细胞刺激因子。将本发明分离纯化工艺得到的产物，进行一系列鉴定及分析表明，该产物纯度大于98％，其活性与标准品基本一致。本发明的有益效果是，不使用反相层析和有机溶剂，采用新颖的凝胶过滤柱上复性，简化了复性的过程，提高回收率，可以大规模工业化制备药用级的重组人B淋巴细胞刺激因子蛋白。
文档编号C07K1/00GK1660902SQ20041006581
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月20日 优先权日2004年12月20日
发明者张双全, 曹鹏 申请人:南京师范大学