人b淋巴细胞刺激因子受体的氨基酸模拟表位及其应用的制作方法

专利名称：：人b淋巴细胞刺激因子受体的氨基酸模拟表位及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物制药和基因工程领域，特别是涉及B淋巴细胞刺激因子受体(BAFF-R)蛋白的一个模拟表位肽及其编码DNA与其在制备抗肿瘤疫苗和药物中的应用。
背景技术：
：1.BAFF-R分子及其抑制剂的相关研究人BAFF-R是一个全长为184氨基酸残基的III型膜蛋白，人鼠同源性为56%。其胞外部分的CRD区只有4个半胱氨酸，是已知的TNFR超家族成员中最少的。BAFF-R基因定位于人22ql3.1-13.31，在脾脏、淋巴结和外周血中表达，而在骨髓和胎肝中未检测到其存在。与B淋巴细胞刺激因子其它两个受体TACI和BCMA不同，BAFF-R只与BAFF高亲合力结合，它在B细胞发育及其功能方面发挥着重要的作用；与BAFF-R有关的信号途径似乎与BAFF引起的B细胞增殖效应直接相关，一旦其缺失将导致B细胞内稳态失调，BAFF-R的可溶性蛋白可明显地抑制BAFF对B细胞的刺激作用，Thompson和Yan同时发现在一种免疫缺陷型小鼠模型A/WySnJ中BAFF-R基因的第三外显子发生突变而缺失，表现为免疫能力的极度低下，这与BAFF基因敲除小鼠的表型几乎是一致的，而BCMA与TACI基因敲除的小鼠表现的症状要轻得多，前者与野生型相比无任何差异，后者只呈现出轻度的B淋巴细胞数量增多和免疫器官的肿大。因此推测，BAFF-R是BAFF介导成熟B细胞存活的最重要的受体。基于BAFF-R作为靶点的药物开发是目前慢性B淋巴细胞白血病治疗领域的热点。早在2000年，美国人类基因组公司(HGSI)就开发了放射性同位素标记的BAFF蛋白LymphoRadTM-131用于治疗B-CLL，目前正处于临床试验阶段；最近RamadeviNimmanapalli等人在权威杂志《BLOOD》上报道BAFF/rGel也是一种潜在靶向BAFF-R的B-CLL的治疗性融合蛋白。近年来，特别是随着分子生物学、生物化学、免疫学等的飞速发展，新理论、新技术的不断出现和成熟，为探索新的肿瘤疫苗治疗奠定了坚实的基础，因此，设计筛选BAFF-R有效抗原表位，设计新型肿瘤抗原肽，是慢性B淋巴细胞白血病的新的治疗办法。2.治疗性疫苗研究进展治疗性疫苗从诞生到现在已有200多年的历史，目前虽不能完全代替药物，但已成为疾病治疗的辅助手段。据2002年统计，有55种肿瘤治疗性疫苗进入临床研究阶段，其中6种已进入临床III期。利用致病因子增强机体的特异免疫应答，尤其是细胞免疫应答，是治疗性疫苗的发展方向，其目标是使特异性抗原具有免疫原性及免疫反应性，产生保护性细胞免疫应答。外来抗原如何顺利被抗原提呈细胞摄取，以及如何突破机体对它的低反应性，成为治疗性疫苗亟待解决的问题。预防性疫苗针对感染原的免疫反应，通过产生体液免疫反应来识别并中和再次入侵的病原体，从而阻止疾病发生。而治疗性疫苗目的在于诱导抗原特异的T细胞反应，能杀伤肿瘤细胞或感染有病原体的病态细胞。它在抗原诱导产生疾病之后接种，接种对象是慢性疾病患者，其免疫应答常处于低下水平，如何突破免疫耐受以及增强机体的免疫应答是研究中经常出现的问题。目前，治疗性疫苗的研究已经取得重大突破，细胞型疫苗、多肽型疫苗、重组基因疫苗等的研究都在广泛开展。3.噬菌体展示技术研究进展噬菌体抗体库技术，能够绕过免疫动物和细胞融合等过程制备单克隆抗体，并能通过在原核细胞体系中抗体片段的克隆选择，分离得到几乎所有抗原的人源性抗体，因此，已成为生命科学研究的突破性进展之一。噬菌体展示技术的最大优点是一旦噬菌体库建成后，就可以根据需要从库中获得能与目标抗原结合的抗体，完成初期的筛选通常只需要2-3周，而且抗体可以进行大批量生产。一些生物技术公司已经利用噬菌体展示技术生产人抗体治疗剂，其中包括Cambridge抗体技术(CAT)、Crucell、Dyax和Morphosys。第一个治疗风湿性关节炎的人抗体药物HUMIRA已经上市，该抗体是CAT公司和Abbott实验室研制的。利用噬菌体展示技术生产的HUMIRA证明了人单克隆抗体的有效性，271名病人的治疗数据显示，HUMIRA改善了50%病人的类风湿性关节炎症状；另一报道中只提到一些轻微的副作用，如注射位点反应，皮疹和头痛，这表明HUMIRA的安全性和较好的耐受性。构建噬菌体展示系统应用最广泛的载体是丝状噬菌体，亦有采用A噬菌体和T4噬菌体为载体建立其展示系统。大肠杆菌丝状噬菌体包括，M13、fl、fd等，其特性相似，基因组均为一单链环状，大小约6。4kb，共编码IO个不同的蛋白质，在丝状噬菌体10个蛋白质中，与表面展示有关的蛋白质主要是由基因m(g3)和基因VlII(g8)，编码的外壳蛋白P3和P8，分别可构成P3和P8展示系统。P3和P8蛋白的N端均游离在外，外源肽通过柔性接头与其N端连接，融合蛋白即可展示外源肽段的构象。P3和P8融合蛋白的差别在于:(1)融合外源肽段大小的能力不同，P3可融合较大的外源肽段，这是P3展示系统的最突出特点，对外源多肽或蛋白质的大小无严格限制，较长的多肽甚至整个蛋白质都可整合到基因III外壳蛋白上，大至50kDa的蛋白质已被成功展示。而P8分子较小，只能融合较小的外源肽段，如五肽或六肽，携带肽段太大会影响外壳的组装；(2)拷贝数不同，P3展示系统的拷贝数仅为3-5个，故可用于选择高亲和力的配体。P8展示系统的拷贝数极多，制备人工疫苗则以P3作为融合部位更为适宜。除此以外Hufton等发表了P6展示系统展示系统的研究报告，但该系统的展示效率不及P3和P8。噬菌体展示技术的出现和发展为人们大规模发展和筛选新型抗肿瘤药物提高了强大的手段，同时伴随着噬菌体展示多肽库技术的发展，应用小肽模拟抗原抗体反应已成为发展的趋势。这是因为含有关键残基的短肽能够模拟蛋白质上的抗原决定簇，多数情况下，几个残基与它结合分子所形成的非共价键构成了全部结合的主要部分，即蛋白质之间的相互作用是通过局部肽段间的相互作用实现的。噬菌体展示技术已经广泛用于蛋白质相互作用位点的研究，例如整合素通讯的膜表面受体，为细胞生长、分化、迁移所必需，Koivunen等分别用5肽、6肽、7肽、9肽的随机噬菌体肽库筛选与整合素结合的小肽，从四个肽库中均筛选到包括RGD序列的小肽，反之，用含RGD序列的纤维粘连素片段从随机肽库中筛选到与之结合的小肽，都具有CWDDG/LWLC的序列，此序列类似于Hong等筛选到的与腺病毒PentonRGD位点结合小肽MTSDDL的序列。两组均证实KODLW序列存在于整合素亚基中，并参与RGD的交联作用。通过噬菌体展示技术，确定整合素的与RGD序列蛋白之间相互作用的重要残基，为设计整合素特异性抑制剂提供了有价值的信息。从随机肽库中筛选与目的筛选物相结合的小肽，已有多篇文献成功报道，筛选的成功与否有赖于高质量肽库及高纯度的筛选物，有文献报道，将筛选方法稍作修饰。即可用复合物如全血清或其它体液从肽库中筛选与目的物结合的小肽。已有多个研究小组证实，利用多克隆血清从随机肽库中筛选出疾病专一的模拟抗原决定簇是可能的。这种方法在预先不知道抗原的任何信息的情况下，从一个大的肽库中筛选出呈现特异性模拟抗原决定簇的噬菌体，这种特异性噬菌体只能与病人血清反应而不与正常血清反应，并且模拟抗原决定簇的序列是否与原始分子相似都不会影响它应用于疫苗，因而在新发现的疾病反面更有意义。
发明内容本发明的目的是筛选出人B淋巴细胞刺激因子受体(BAFF-R)的7氨基酸模拟表位，从而构建一种能在体内诱导出针对BAFF-R的特异性抗体的疫苗。本发明实现上述目的所采用的技术方案是人B淋巴细胞刺激因子受体的7氨基酸模拟表位，是以B淋巴细胞刺激因子受体单克隆抗体作为抗原，在噬菌体随机呈现7肽库中筛选得到与BAFF-R单克隆抗体高亲和力的BAFF-R分子的模拟表位，其氨基酸序列为GlyTyrThrArgTipGlyCys。上述的BAFF-R分子的模拟表位与BAFF-R分子的蛋白序列及基因序列无任何同源性，与BAFF-R分子单克隆抗体具有特异的亲和性。实现上述的B淋巴细胞刺激因子受体的7氨基酸模拟表位的筛选方法，按以下步骤完成1)噬菌体随机呈现7肽库的筛选以0.1mol/L的NaHC03，pH8.6，100ug/ml稀释的BAFF-R单抗，包被ELISA板孔，过夜后，将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻叩除尽残余液体；然后用1%牛血清白蛋白的TBS，50mMTris-HCl，pH7.5，4。C孵育，封闭2h，再采用0.1%Tween20的TBST洗涤6次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻叩除尽残余液体。加入200ul用TBST稀释的含2X10"pfu的库噬菌体溶液，室温孵育lh;倾去液体，去除未结合的噬菌体，再用TBS+O.l%Tween20洗涤10次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻叩除尽残余液体；用100ul洗脱液洗脱结合的噬菌体，其洗脱液配方为0.2mol/lGlycine-HC1，Ph2.2，10g/lBSA，并迅速加入配方为lmol/1Tris-HCl，pH9.1的中和液中和；取lul测滴度，剩余液体加入20ml处于对数生长早期的R2738培养物中，其中大肠杆菌ER2738;20mg/l四环素的5mlLB培养基胰蛋白胨10g/l酵母提取物5g/1NaCl10g/l，于37'C剧烈振荡培养4.5h，得到扩增的噬菌体。将扩增好的噬菌体和大肠杆菌的混合液倒入离心管，于4。C，12000rpm离心10min;上清转入新的离心管，再离心，取80%的离心上清转入新的离心管，加入1/6体积的PEG8000/NaCl，其配方为PEG8000200mg/ml，NaC12.5M，4°C静置过夜；次日，4°C，10000rpm离心15min，倾去离心上清；再用快速离心法离心一次，吸尽残留上清；lmLTBS重悬沉淀，于4°C10000rpm离心5min，将残留的细胞沉淀下来；上清加入l/6体积的PEG/NaCl;冰裕lh，4°C,10000rpm离心15min，倾去上清，用200ul含0.01%%&的TBS重悬沉淀，10000rpm离心lmin;上清即为扩增好的洗脱液，lul用于测滴度，余下的液体于4'C存放。200ulBAFF-R单抗溶液新一孔，用余下一轮筛选，为了提高筛选肽的严谨性，第二轮和第三轮筛选中BAFF-R单抗浓度分别降至50yg/ml和20yg/ml;第二轮和第三轮的筛选中，加入的第一轮和第二轮筛出的噬菌体应根据滴度计算相当于2X10"pfu噬菌体的液体体积；将TBST中Tween20的浓度提高至0.5%;第三轮的洗脱产物不需进行扩增，取lul进行滴度测定，剩余存放于4'C环境。从滴度测定中，菌斑数<100的平板上随机挑取50个分割良好噬菌斑进行扩增和纯化，即用无菌牙签蘸取的50个分隔良好的蓝色噬菌斑分别放入对数中期培养的ER2738中，37。C剧烈振荡培养4.5h后，瞬间离心30s。新的离心管，同法再离心一次，取80%的上清，即得扩增的噬菌体液体。2)特异性噬菌体筛选以100ug/ml的NaHC03pH8.6，包被96孔酶联板，同时对每个孔设立1%BSA对照孔，同型的IgGl对照孔，4。C孵育过夜；倾去包被液，加入5mg/LBSA,0.lmol/LNa线，pH8.6的封闭液，4'C封闭2h，以步骤1)中的TBST洗6次，每次均要除尽残余液体；将50个纯化的1X107孔噬菌体分别加入NaHC03pH8.6中，BSA和同型抗体IgGl包被孔中室温孵育2h。TBST洗6次，每孔加入HRP标记的小鼠抗M13噬菌体mAb100uL,其比例l:5000，室温孵育lh;TBST洗6次，MTT显色后测定A450nm处的吸光值。3)噬菌体呈现肽的序列测定根据ELISA结果，筛选出10个与BAFF-R单抗有较高亲和力而与其他对照亲和力低的克隆进行序列测定；噬菌体克隆的扩增同前，取噬菌体培养上清；常规提取噬菌体单链DNA，以单链DNA为模板，采用噬菌体随机肽库试剂盒中所提供的测序引物，引物序列为5，-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3，，在ABI310DNA自动测序仪上进行自动测序，根据DNA测序结果，推导出噬菌体所呈现随机肽的氨基酸序列，比较不同克隆之间氨基酸序列的同源性，即可得到筛选的模拟表位，其氨基酸序列分别为-GlyTyrThrArgTrpGlyCys实现上述的B淋巴细胞刺激因子受体的7氨基酸模拟表位构建多肽表位疫苗的方法，可以是纯化上述展示7氨基酸表位模拟肽的噬菌体。采用无佐剂直接免疫法，即以纯化的阳性噬菌体颗粒进行小鼠腹腔注射免疫。构建多肽表位疫苗的方法，还可以是将化学合成的7氨基酸模拟表位的cDNA与噬菌体连接，扩增纯化阳性的噬菌体，得到多肽表位疫苗。可直接行小鼠腹腔注射免疫。所说的噬菌体是常规的。上述的模拟表位构建的表位多肽疫苗能够在小鼠体内诱导出针对该表位的抗血清；该抗血清亦能够识别BAFF-R细胞天然表达的BAFF-R分子；能够有效杀伤BAFF-R+细胞。所述的人B淋巴细胞刺激因子受体的7氨基酸模拟表位的应用，体现在将7氨基酸模拟表位cDNA与噬菌体连接，扩增纯化展示表位模拟肽的噬菌体直接行小鼠腹腔注射免疫，或者直接合成七肽，选择合适的抗原呈递细胞如树突状细胞、佐剂或者细胞因子联合来强化特异性细胞免疫应答。本发明从腹水中纯化了针对BAFF-R蛋白的鼠源性抗体，洗脱液第3峰含有纯度较高的BAFF-R抗体(22KD、52KD),经Kodak成像系统进行扫描，所得BAFF-R抗体纯度约为90%，可用于MUC1抗原模拟表位的筛选。运用噬菌体随机7肽库技术，以纯化BAFF-R抗体为靶蛋白，进行噬菌体随机肽库3轮筛选，获得BAFF-R抗原模拟表位(GYTRWGC)。鉴定结果表明1个噬菌体展示肽克隆抑制率均在50%以上，能较大程度地特异性抑制抗原抗体结合，提示这些阳性克隆的外源肽具有一定的BAFF-R抗原模拟功能。用展示BAFF-R抗原模拟表位的噬菌体阳性克隆免疫小鼠，第3次免疫小鼠后，血清(1:1000)中能检测到较强的BAFF-R抗体阳性，小鼠脾脏淋巴细胞增殖率检测结果表明噬菌体展示肽表位可在无佐剂存在情况下，大大促进小鼠的脾淋巴细胞增殖，证明噬菌体是一较好的生物载体。结果表明该模拟抗原免疫小鼠后能激发体液及细胞免疫应答，具有良好的免疫原性。图l:小鼠免疫后血清抗体滴度变化以噬菌体展示肽免疫小鼠后，小鼠血清中BAFF-R抗体检测结果见图4-1。初次免疫2周后，血清(1:1000)中能检测到BAFF-R抗体阳性，说明体内已出现特异性IgG抗体，此后效价缓慢上升，于6周左右达高峰，2周后下降。说明该噬菌体克隆有较好的免疫原性。图2:MTT测定小鼠免疫后的淋巴细胞增殖率用MTT法分析抗原诱导小鼠脾脏淋巴细胞增殖的能力，结果表明所示用噬菌体展示表位免疫小鼠后，50ug噬菌体组及25ug噬菌体组淋巴细胞增殖率分别达到42%及36%，明显高于PBS对照组8%(P<0.01)。可见噬菌体展示表位可在无佐剂存在情况下，大大促进小鼠的脾淋巴细胞的增殖，由此进一步证明噬菌体是一较好的生物载体。图3:Westernblotting检测噬菌体展示肽的免疫原性，其中1、噬菌体人展示肽免疫组2.PBS对照组。为明确噬菌体展示肽表位的免疫效果，进行WesternBlot分析。以相同稀释度最大OD450值之纯化血清做为一抗，行蛋白印迹分析，结果显示纯化血清可识别分子量大于7000Da的BAFF-R蛋白，图中显示为特异的单一条带。具体实施例方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合附图和具体实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。实施例实现本发明的抗体纯化、肽库筛选、动物免疫以及抗体鉴定工作，按照以下步骤完成1.BAFF-R抗体的纯化和鉴定BAFF-R单抗腹水用上样缓冲液l:lO稀释后，上MONOQ离子交换柱进行阴离子交换层析，上柱、结合和洗脱。用含有0.35molNaCl的50mmolTris-HCl缓冲液(pH8.0)进行梯度洗脱，获得3个波峰。洗脱液经12。/。SDS-PAGE(图1)，结果证实第3峰含有纯度较高的BAFF-R抗体，经Kodak成像系统进行扫描，所得BAFF-R抗体纯度约为90%。2.Ph.D-7肽库的生物淘洗噬菌体随机七肽库(Ph.D,7TMphagedisplaypeptidelibrary):购自美国NewEnglandBiolabs公司，宿主菌选用大肠杆菌E.coliER2738,带有可被噬菌体感染的F'因子，具有四环素抗性，可与呈现了7肽的噬菌体形成a互补。测序引物序列为5，-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3，。2.1噬菌体滴度的测定2丄1接种ER2738单菌落于5-10mlLB培养基中，摇床培养至对数中期(OD600~0.5)。2丄2细胞生长时，微波炉融化上层琼脂，分成3ml等份于灭菌试管中，每个噬菌体稀释度一管。保存于45X:备用。2丄337。C预温LB/IPTG/Xgal平板，每个噬菌体稀释度取一个平板备用。2丄4在LB中准备10倍系列稀释的噬菌体。2丄5当菌体培养物达对数中期，分成200iU等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管。每管加入10yl不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5min。2丄6将感染细胞加入45"C预温的上层琼脂培养管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37'C预温的LB/IPTG/Xgal平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。2丄7待平板冷却5min后，倒置于37'C培养过夜。2丄8检查平板，计数有~102个噬菌斑的平板上的斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每IOul噬菌体的空斑形成单位(pfu)滴度。2.2噬菌体的淘洗2.2.1准备100ug/ml的BAFF-R抗体溶液(溶于0.1MpH8.6的NaHC03)。2.2.2每微孔板每孔150ul上述溶液，反复旋转直到表面完全湿润。2.2.3在增湿容器中4'C轻微震荡，孵育过夜。平板可在此容器中4'C贮存备用。2.2.4第二天，挑ER2738单克隆(噬菌体滴度测定时铺的板)于10mlLB液体培养基中。如果同一天扩增洗脱的噬菌体，也可将ER2738接种于20mlLB液体培养基，这时请用250ml三角瓶(不要用50ml锥形管)。37。C剧烈震荡培养。2.2.5倒掉每板中的包被液，板倒置在干净的纸巾上用力拍甩以除去残余溶液。每孔加满封阻液，4'C作用至少1hr。2.2.6按2.2.5中所述方法除去封阻液。再用TBST(TBS+0.1%[v/v]Tween-20)缓冲液快速洗板6次。每次均旋转以使板或孔的底部及边缘均被洗到，倾去缓冲液，倒置在干净纸巾上拍甩以除去残余溶液(或使用自动洗板机)。此操作要快以避免板干燥。2.2.7用100ul的TBST缓冲液稀释2X1011的噬菌体(即10ul的原始文库)，然后加到己包被好的板上，室温温和摇动10-60min。2.2.8倾倒除去未结合噬菌体，倒置板在干净的纸巾上拍甩除去残余溶液。2.2.9按6中所述方法用TBST缓冲液洗板10次，每次换一干净纸巾以避免交叉污染。2.2.10根据所研究的分子间相互作用，用100yl适当的洗脱缓冲液洗脱结合的噬菌体。一般情况下，是将靶分子的已知配体以0.1-1mM的浓度溶于TBS溶液中或者用游离靶分子溶液(100Ug/ml溶于TBS中)从固定靶分子上将结合的噬菌体竞争性洗脱下来。室温温和摇动10-60min，将洗脱液吸入另一干净微量离心管中。另夕卜，也可用非特异性缓冲液如0.2MGlycine-HCl(pH2.2)，1mg/mlBSA来分离已结合的分子温和摇动HOmin，洗脱液吸入另一干净微量离心管中。然后再用15ti11MTris-HCl(pH9.1)中和上述洗脱液。按上述常规M13方法中的程序测定少量(~1ul)洗脱物的滴度。如需要，可对第一或第二轮洗脱物滴度测定所得的噬菌斑进行测序，方法见下述。(必要时可将剩余洗脱物4。C贮存过夜，第二天扩增。这时，可将ER2738在LB-Tet培养基中过夜培养，第二天将培养物l:100稀释于20mlLB中(用250ml三角瓶盛装)，加入未扩增洗脱物。37'C剧烈摇动培养4.5hr)。2.2.11剩余洗脱物应当被扩增将洗脱物加入到20mlER2738培养物中(菌体应当处于对数前期)，37'C剧烈摇动培养4.5hr。2.2.12将培养物转入一离心管中，然后，4°C10,000卬m离心10min。上清液转入另一离心管中，再离心。2.2.13将上清的上部80%转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl。让噬菌体4。C沉淀至少60min，最好过夜。2.2.14第三天4°C10,000rpm离心PEG沉淀15min。倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液。2.2.15沉淀物重悬于lmlTBS中，悬液转入微量离心管中，4"C离心5min使残余细胞沉淀。2.2.16上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育15-60min。4'C离心10min，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸去残余上清。2.2.17沉淀物重悬于200U1TBS,0.02%NaN3中。离心1min，沉淀任何残余的不溶物。上清转入新鲜管中。此即为扩增后的洗脱物。2.2.18根据上述常规M13方法用LB/IPTG/Xgal平板滴定扩增后的洗脱物。4°C贮存。2.2.19再包被一个板或孔准备第二轮淘选时用。2.2.20.计数板上蓝斑数确定滴度。用这个值来计算相应于2X10Upfu的加入量。如果滴度太低，接下来的几轮淘选可用低至1(^pfu的噬菌体加入量进行试验。2.2.21.进行第二轮淘选用第一轮淘选扩增的洗脱物中2X1011pfu的噬菌体量重复步骤2.2.14-2.2.18，在清洗步骤中将Tween的浓度增至0.5%(v/v)。2.2.22在LB/IPTG/Xgal平板上测定第二轮淘选所得洗脱物扩增后的滴度。2.2.23.再包被一个板或孔准备第三轮淘选时用。2.2.24.第六天进行第三轮淘选用第二轮淘选扩增的洗脱物中2X1011pfu的噬菌体量重复步骤4-11，清洗步骤中同样用0.5%(v/v)的Tween。2.2.25.在LB/IPTG/Xgal平板上测定第三轮淘选所得洗脱物未扩增时的滴度。第三轮洗脱物不必再扩增，滴度测定时得到的噬菌斑可做测序用只要注意平板培养时间不要超过18小时，培养时间过长容易出现缺失。其余洗脱物4'C贮存。2.2.26.挑一ER2738单克隆于LB-Tet培养基中培养过夜(不要接种稀释后的铺板培养物)。按方法所述进行3轮生物淘洗，富集效果如表1所示表1噬菌体7肽库的生物淘筛<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>结果表明，经3轮淘洗，噬菌体克隆获得有效的富集。富集达200倍。2.3噬菌斑的扩增2.3.1将ER2738过夜培养物按1:100稀释接种于LB培养基，分lml到培养管中。每个要鉴定的克隆一管。一般情况下，由第三轮淘选物中取10个克隆便足以检测结合肽中的共有序列。2.3.2用灭菌牙签或吸头，挑一蓝色噬菌斑到上述lml培养管中。注意要从总量不到100个噬菌斑的平板上挑选，以便保证每个被挑的噬菌斑仅含一个DNA序列。2.3.337。C摇床培养4.5-5hrs。2.3.4培养物转入微量离心管中，离心30sec。上清转入以新鲜管中，再离心。用移液器将80%的上清转入新鲜离心管，此即为扩增噬菌体贮液，可以4'C贮存几个星期而对滴度影响不大。长期贮存应用灭菌甘油l:l稀释后，-2(TC贮存。2.4ELISA分析获得的噬菌体克隆2.4.1将BAFF-R抗体用包被液稀释成10ug/ml，包被双条可拆酶标板，100ix1/孔，平行两孔，4。C过夜。2.4.2弃掉包被液，每孔加满封闭液，37°C，lh。TBST(含0.5%Tween-20，下同)洗6次，取扩增后的噬菌体每个克隆取50u1+150ylTBST，混匀，加入板孔中，同时取2ul原库+200ulTBST作为对照，RT，lh。2.4.3TBST洗8次，每孔加入用封闭液(含lmg/mlBSA)1:5000稀释的HRP/anti-M13单抗100ul，RT，lh，TBST洗8次。每孔加入100ulTMB显色液，37°C，10-15min，加入50u12MH2S04终止显色，测定OD450。2.4.4分别从3轮筛选后测定滴度的平板上随机挑取40个蓝斑进行扩增，取50yl扩增液与150"1TBST(含0。5%Tween-20)混合，加入到酶联板中进行ELISA分析。2.4.5从上述筛选获得的噬菌体克隆中挑选BAFF-ROD450>0.6者，ELISA结果如表2显示，共获得10个阳性克隆。表2噬菌体克隆的ELISA分析结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2.5序模板的快速纯化2.5.1扩增噬菌斑。第一步离心后，取500ul移入一新的离心管中。加入200iUPEG/NaCl，颠倒混匀，RT10min。离心10min，弃上清。再次离心片刻，吸掉剩余上清。沉淀重悬于100u1IodineBuffer中，加入250p1乙醇，室温10min。离心10min，弃上清。70%乙醇洗涤，真空干燥片刻。沉淀重悬于30ulTE，送测序。2.5.2从上述筛选获得的噬菌体克隆，扩增后提取噬菌体ssDNA，进行插入肽的DNA序列测定。根据测序结果的比较。根据插入区的核酸序列推导出外源多肽的氨基酸序列；比较所获得的多肽氨基酸序列，寻找比较保守的核心序列。一般而言，如果大部分多肽中含有3个以上很相似的序列，则可以认定为该序列是这些多肽中的一个核心序列。依据其氨基酸序列同源程度，获得其同源性基序GYTRWGC。2.6、竞争抑制实验2.6.1将人BAFF-R蛋白包被微孔，BSA封闭，阳性噬菌体克隆与BAFF-R单抗室温共孵育2h^2.6.2加入微孔，37'C孵育lh后，缓冲液洗涤，加入HRP标记的羊抗鼠抗体，TMB显色，测OD450值。2.6.3计算抑制率抑制率=(抑制前OD450-抑制后OD450)/抑制前OD450X100%，结果显示1个噬菌体展示肽克隆抑制率均在50%以上，能较大程度地特异性抑制抗原抗体结合，提示阳性克隆的外源肽具有一定的BAFF-R抗原模拟功能。2.7噬菌体展示肽表位疫苗的构建2.7.1合成可表达7肽的基因序列GGATACACCAGAAGGGGAAGC。2.7.2将合成的基因片段和噬菌体载体M13经过37'C酶切过夜，割胶，纯化，4'C连接过夜。2.7.3第二天将获得的基因连接产物转化大肠杆菌E.coliER2738，PCR检测阳性克隆。2.7.4获得的阳性克隆为携带有展示肽表位的噬菌体表位疫苗，结过扩增，纯化制备，-2(TC冻存。2.8、噬菌体展示肽表位的免疫原性研究2.8.1免疫方案及取样免疫方法纯化展示表位模拟肽的噬菌体。采用无佐剂直接免疫法，即以纯化的阳性噬菌体颗粒进行小鼠腹腔注射免疫，每隔2周免疫1次，于第0，2，4，6周时相同剂量各免疫一次。免疫血清制备隔两周釆集血清一次，分离血清，-201:冻存。2.8.2酶联免疫吸附实验(ELISA):用包被缓冲液稀释BAFF-R蛋白(0.1mg/ml)，取各100Pl，加入96孔酶联板，每组样品设三个重复孔，贴密封膜置4'C过夜。弃包被液，取100封闭缓冲液加入样品孔内，37'C孵育lh，以封闭非特异性结合。弃封闭液，洗涤(5minX3次)，加入经1:50稀释的小鼠血清100Ul(抗体稀释液)，37。C孵育2h。洗涤(5minX3次)，加入1:2000的HRP-羊抗小鼠IgG100iU，于37。C孵育lh。洗涤(5minX3次)，加入底物缓冲液I，避光反应5-10min后出现微黄色显色反应，即加入2M的硫酸终止反应，此时显色呈橙黄色，测定450nm波长下吸光度值(A)，绘制抗体滴度-时间曲线。以PBS阴性对照组血清所测A450作为背景值，各组ELISA测得的A值以高于阴性对照组背景值3倍为阳性。2.8.3蛋白印迹实验取BAFF-R蛋白样品各10yl，分别加50ul去离子水稀释，然后加入3ml考马斯亮蓝定量液，混匀，静置10min。另取60yl去离子水加入3ml考马斯亮蓝定量液作为空白对照。用紫外分光光度仪行蛋白定量。将滤纸、PVDF膜切成与凝胶相同大小，滤纸置于去离子水中浸润5min，电转液中平衡15min。PVDF膜置甲醇中lmin，然后放入电转液中。用两张大滤纸贴于两个多孔垫料表面，依次将凝胶大小滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸整齐重叠夹于多孔垫料之间，将凝胶转移至电转移槽中，使PVDF膜位于正极侧，凝胶位于负极侧，于4°C，20V恒压下电转移12h。取下PVDF膜，用一细针头于蛋白分子量标准各条带水平刺l-2个小孔作标志，用于判断免疫印迹条带的位置和分子量大小。最后将凝胶用考马斯亮蓝染色观察电转移效果是否完全。按0.4ml/cn^膜加5%封闭液至玻璃平皿中，置入PVDF膜，持续摇动孵育膜lh(或于4"C静置过夜)。PVDF膜移入含一抗的10ml溶液(相同稀释度最大OD450的小鼠特异性抗血清，稀释浓度1:1000)平皿中，室温持续摇动孵育膜lh(或于4。C静置过夜)。PVDF膜移入另一平皿，用1XTBST漂洗6-8X5min。将PVDF膜置入含25ul抗鼠IgG-HRP二抗的10ml溶液(二抗浓度1:500，用1%封闭液配制)平皿中，持续摇动下孵育30min。用1XTBST漂洗膜6-8X5min。镊子夹持膜的一角，下缘接触吸水滤纸，以吸出膜中的TBST溶液。膜置入底朝上置于干净吸水滤纸上，吸净膜表面液体，观察结果并摄像。以噬菌体展示肽免疫小鼠后，小鼠血清中BAFF-R抗体检测结果见图2。初次免疫2周后，血清(1:1000)中能检测到BAFF-R抗体阳性，说明体内已出现特异性IgG抗体，此后效价缓慢上升，于6周左右达高峰，2周后下降。说明该噬菌体克隆有较好的免疫原性。为明确噬菌体展示肽表位的免疫效果，进行WesternBlot分析。以相同稀释度最大OD450值之纯化血清做为一抗，进行蛋白印迹分析，结果显示纯化血清可识别分子量大于7kDa的BAFF-R蛋白，图中显示为特异的单一条带(图3)3、脾脏淋巴细胞增殖率的检测取免疫结束后2周小鼠，脱颈椎处死。无菌条件下取脾脏，用含5%小牛血清的PBS缓冲液洗涤两次去除表面血污后，置于不锈钢筛网(60-80目)上用剪刀剪碎，用磨杵均匀碾磨，制成匀浆。用淋巴细胞分离液梯度离心(2000rpmX20min)，分离淋巴细胞，制成单细胞悬液。用RPMI1640培养液(含10%小牛血清、100U/ml青链霉素)的调整浓度为5X10"ml后，取100iU加入96孔培养板，分组加入10ul相应的噬菌体、ConA(5ug/ml)及PBS，每组设3个平行孔，于37oC，5%C02培养箱中培养72h。离心(1000rpmX10min)后，弃上清。培养板中另外加入100nl含10。/。小牛血清的RPMI1640培养液及10iUMTT(20ug/ml)。继续培养4h后，离心弃上清，加入200ulDMSO，震荡后测定450nm下的光吸收值(OD值)。以ConA组为阳性对照，PBS组为阴性对照，按以下方法计算增殖率。增殖率气OD实验孔-OD对照孔)/(OD阳性对照孔-OD对照孔)X100%。用MTT法分析抗原诱导小鼠脾脏淋巴细胞增殖的能力，结果表明(如图2)所示用噬菌体展示表位免疫小鼠后，50ug噬菌体组及25ug噬菌体组淋巴细胞增殖率分别达到42%及36%，明显高于PBS对照组8%(P<0.01)。可见噬菌体展示表位可在无佐剂存在情况下，大大促进小鼠的脾淋巴细胞的增殖，由此进一步证明噬菌体是一较好的生物载体。4、安全性分别称取各组小鼠平均体质量，观察免疫后小鼠体质量的动态变化。处死小鼠后，观察肝、脾大小。小鼠个体质量与空白对照组相比，无显著差异，安全性较好，免疫后小鼠肝脾未见显著肿大，无明显的毒副作用。权利要求1.人B淋巴细胞刺激因子受体的7氨基酸模拟表位，其特征在于，以B淋巴细胞刺激因子受体单克隆抗体作为抗原，在噬菌体随机呈现7肽库中筛选得到与BAFF-R单克隆抗体高亲和力的BAFF-R分子的模拟表位，其氨基酸序列为GlyTyrThrArgTrpGlyCys。2.如权利要求1所述的人B淋巴细胞刺激因子受体的7氨基酸模拟表位，其特征在于，所述的BAFF-R分子的模拟表位与BAFF-R分子的蛋白序列及基因序列无任何同源性，与BAFF-R分子单克隆抗体具有特异的亲和性。3.实现权利要求1所述的人B淋巴细胞剌激因子受体的7氨基酸模拟表位构建多肽表位疫苗的方法，是将化学合成的7氨基酸模拟表位的cDNA与噬菌体连接，扩增纯化阳性的噬菌体，得到多肽表位疫苗。4.如权利要求4所述的构建多肽表位疫苗的方法，其特征在于，所述的模拟表位构建的表位多肽疫苗能够在小鼠体内诱导出针对该表位的抗血清；该抗血清亦能够识别BAFF-R细胞天然表达的BAFF-R分子；能够有效杀伤BAFF-R+细胞。5.权利要求1所述的人B淋巴细胞刺激因子受体的7氨基酸模拟表位的应用，是将7氨基酸模拟表位与噬菌体连接，扩增纯化展示表位模拟肽的噬菌体直接行小鼠腹腔注射免疫，或者直接合成七肽，选择合适的抗原呈递细胞如树突状细胞、佐剂或者细胞因子联合来强化特异性细胞免疫应答。全文摘要本发明涉及BAFF-R蛋白的一个模拟表位肽及其编码DNA与其在制备抗肿瘤疫苗和药物中的应用。BAFF-R的7氨基酸模拟表位，是以BAFF-R单克隆抗体作为抗原，在噬菌体随机呈现7肽库中筛选得到与BAFF-R单克隆抗体高亲和力的BAFF-R分子的模拟表位，其氨基酸序列为GlyTyrThrArgTrpGlyCys。还可利用上述7氨基酸模拟表位构建多肽疫苗。本发明中的噬菌体展示肽克隆抑制率均在50％以上，能较大程度地特异性抑制抗原抗体结合，可在无佐剂存在情况下，大大促进小鼠的脾淋巴细胞增殖，该模拟抗原免疫小鼠后能激发体液及细胞免疫应答，具有良好的免疫原性。文档编号A61K38/08GK101348521SQ20081019630公开日2009年1月21日申请日期2008年9月4日优先权日2008年9月4日发明者夏志南,鹏曹申请人:江苏省中医药研究院