专利名称：优化的TACI-Fc融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及用基因重组技术制备一种优化的融合蛋白，特别是TACI-Fc融合 蛋白及其治疗免疫疾病的用途。 技术背景淋巴细胞的发生和分化过程受到细胞因子的调控。B淋巴细胞刺激因子 (BLyS， 或称BAFF， TNSF13B， TH颜K， TALL-1， zTNF4)和APRIL是对机体的免 疫反应具有重要调节作用的细胞因子(Schneider, 2005， Current opinion in immunology, 17:282-289; Seyler et al. ， 2005, The Journal of Clinical Investigation, 115:3083-3092)。它们能够促进B淋巴细胞的发育和增殖，提高血 清中各种免疫球蛋白的表达量。BLyS和APRIL对T淋巴细胞的成熟亦具有关键的调 节作用，故对细胞免疫也具有重要的作用(Wang et al. , 2001， Nature Immunology, 2:632-637)BLyS和APRIL通过淋巴细胞表面的受体调节淋巴细胞的免疫应答反应。它们 与细胞膜受体TACI (Transmembrane activator and CAML-interactor)和BCMA(B cell maturation antigen)结合。此外，BlyS也能与另一个受体BAFF-R相结合。B 淋巴细胞表达TACI， BCMA和BAFF-R。成熟的T淋巴细胞表达TACI。 BLyS和APRIL经 这几个受体的信号传递调节淋巴细胞的活化，增生和发育，增加免疫反应。此外， 在淋巴细胞肿瘤，BLyS和APRIL亦具有促进肿瘤细胞分裂，抑制肿瘤细胞调亡，因 而能加快肿瘤的进程。BLyS和APRIL的过量表达是多种自身免疫疾病的病因之一。这些疾病包括 系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、干燥综合征等。临床研究表明，BLyS的浓度往往 与自身免疫疾病的严重程度成正相关。因此，抑制BLyS和APRIL就成为治疗自身免 疫疾病的一个有效途径。同时，由于BLyS和APRIL加快B淋巴细胞肿瘤的进程，抑制3BLyS和APRI也能用于治疗B淋巴细胞肿瘤，例如慢性淋巴细胞白血病，多发性骨髓 瘤，B淋巴细胞淋巴瘤等。由于TACI对BLyS和APRIL具有很高的亲和力，可以用可溶性TACI (TACI的细 胞外部分)阻止BLyS或APRIL与细胞膜受体(TACI， BCMA， BAFF-R)之间的相互作 用，从而达到阻断BLyS或APRIL的生物学活性，治疗自身免疫疾病或肿瘤的目的。多项研究表明，TACI胞外部分与IgG Fc片段的融合蛋白(TACI-Fc)能有效 地抑制BLyS造成的病变 (Gross et al. ， 2001, Immunity, 15:289-302)。但 是，研究亦发现利用自然序列的TACI的胞外部分构建的TACI-Fc融合蛋白在细胞表 达过程中存在蛋白易于降解的问题，得到的产品不均一。因此自然序列的TACI与Fc 的融合蛋白不适合于工业化生产。本发明的目的在于用基因工程改进TACI-Fc融合 蛋白，使之成为适合工业化生产的药物组合。 发明内容本发明涉及用基因工程技术构建和生产能阻断BLyS和APRIL的蛋白质药物， 制备方法以及这类药物在疾病治疗上的应用。本发明提供数种由TACI的片断与免疫球蛋白Fc片断融合得到的具有阻断 B-淋巴细胞增生的融合蛋白，其结构具有以下特征融合蛋白的TACI部分包括来自TACI胞外区氨基末端区的部分序列，富半胱 氨酸区的全部序列，和柄区的部分序列，融合蛋白的免疫球蛋白Fc包括铰链区， CH2区和CH3区，TACI序列与Fc序列之间是直接融合，或经连接序列融合。其中的TACI片段选自TACI的第13至108氨基酸序列或第13至118氨基酸序 列。所述连接序列为9Gly。其中的免疫球蛋白Fc片段选自人或动物的免疫球蛋白Fc,是Fc全长或是部 分序列，Fc选自IgG，， IgM， IgD， IgA，每种免疫球蛋白类型包括各亚型，如 IgGl， IgG2，IgG3， IgG4，优选IgGl。其中所述的TACI片段选自人或动物的TACI序列。 本发明特别优选的融合蛋白如下a.融合蛋白T1:由TACI的第13至108氨基酸序列与免疫球蛋白IgGl Fc融 合而成。(序列表中序列l)b. 融合蛋白T2:由TACI的第13至118氨基酸序列序列和免疫球蛋白IgGl Fc融合而成。(序列表中序列2)c. 融合蛋白T3:由TACI的第13至118氨基酸序列，连接序列9Gly，免疫球 蛋白IgGl Fc融合而成。(序列表中序列3)其中TACI选自人或动物TACI (跨膜激活剂-CAML相互作用子， transmembrane activator and CAML interactor， TACI)的的细胞夕卜区域的序 列。本发明还涉及编码本发明蛋白质的DNA序列。 所述DNA序列见序列表中序列5-7自然序列的TACI与Fc的融合蛋白由于存在降解的问题而不适合于工业化生 产。PCT/US2002/015910描述了用去除氨基末端区全部序列和柄区部分序列的TACI 与Fc的融合蛋白可以防止蛋白降解。但是，已有报道证明去除氨基末端区显著降 低TACI的生物学活性(Wu et al, ， 2000， The Journal of Biological Chemistry, 275: 35478-35485)。本发明的关键在于利用蛋白质前体加工酶(Proprotein convertase， PC) 人工神经网络(artificial neural networks)计算机软件系统分析了 TACI胞外 区域的氨基酸序列。分析结果显示TACI的胞外区域序列包含两个PC酶切位点 (第9和第135氨基酸)。除此之外，另有两个位点(第12和第120氨基酸)的 积分亦接近PC酶切位点临界值。这几个PC酶切位点很有可能是造成TACI在表达 过程中降解的主要原因。基于这一发现，我们在优化的TACI分子中避开了这几个 PC酶切位点，将不含有PC酶切位点的TACI片段与Fc相融合。我们的实验证实 新的融合蛋白有效地防止了 TACI在表达过程中的降解。除了用截断的TACI序列 外，也可以用其他方法避免这些PC酶切位点，例如可以用DNA点突变的方法去除 这些PC酶切位点。因此多种优化方法都可选用。本发明优化的TACI-Fc融合蛋白 保留了氨基末端区的绝大部分序列和较长的柄区序列。优化的TACI-Fc融合蛋白克 服了蛋白降解的问题。与去除氨基末端区的TACI-F融合蛋白向比较，本发明优化 的TACI-Fc融合蛋白生物学活强，蛋白表达量高。融合蛋白质的构建技术基于分子克隆方法，具体实验方法可参考〈<分子克隆 》第二版和第三版等实验手册。用PCR合成的方法将编码有上述融合蛋白的DNA克隆到载体中。表达该融合 蛋白的载体可以是分了-生物学所常用的质粒。融合蛋白的氨基末断前加上信号肽序 列以保证蛋白质从细胞中分泌出来。载体序列中包括用于驱动基因表达的启动了， 蛋白质翻译起始和终止信号，以及多聚腺苷酸(PolyA)序列。载体中有抗菌素抗性 基因以利于质粒在细菌中所繁殖。另外，载体中还包括真核细胞选择性基因用于稳 定转染细胞株的选择。在完成质粒的构建以后，各融合蛋白的DNA序列经测序证实。然后用质粒 DNA转染细胞，表达相应的蛋白质。能够用于表达这些融合蛋白的表达系统有多 种，它们包括，但不限于，哺乳动物细胞，细菌，酵母，昆虫细胞，等等。从哺乳动物细胞所表达的蛋白质具有糖基修饰。由于本发明的TACI-Fc融合 蛋白的氨基酸序列中包括糖基化的氨基酸，因此，哺乳动物细胞是表达这些蛋白质 的最佳细胞。可用于蛋白质大规模表达的哺乳动物细胞有多种，例如CH0细胞， SP20细胞，NS0细胞，C0S细胞，BHK细胞，PerC6细胞，等等。许多其他细胞也 可用于这些蛋白质的表达和生产，因此都包括在本发明所能使用的细胞之列。编码 多肽的质粒可经转染(transfection)进入细胞。转染细胞的方法有多种，其中包括 (但不限于)电钻孔(electroporation)，脂质体(liposome)介导，钙介导，等 等。除了哺乳动物细胞，其他表达系统也能用于这些融合蛋白的表达，例如细 菌，酵母，昆虫细胞，等等，它们也包括在本发明所能使用的细胞范围。这些表达 系统的蛋白质产量有可能比哺乳动物细胞为高，但这类表达系统所生产的蛋白质 通常缺乏糖基化或者所形成的糖链与哺乳动物细胞不同。蛋白质表达后，可用酶联免疫吸附试验(ELISA)或其他方法测定细胞培养液 中融合蛋白质的浓度。由于这些融合蛋白质具有免疫球蛋白Fc片断，因此可用A 蛋白或G蛋白亲和层析法初步提取所表达的融合蛋白质。由于本发明的TACI-Fc融合蛋白质的基本作用是阻断BLyS和APRIL。 BLyS 和APRL是刺激B-淋巴细胞发育和T淋巴细胞成熟的关键因子，因此TACI-Fc融合功能异常相关的疾病和B淋巴细胞异常增生导致的疾病。这些 疾病包括(但不限于)风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，B-淋巴细胞肿瘤，等等。 TACI-Fc融合蛋白可以作为提纯的重组蛋白质注射到病人体内。也可以将编码融合 蛋白的DNA序列插入到适当的载体中，用基因治疗或细胞治疗的方法在病人体内表 达。所以，本发明所涉及的融合蛋白质的使用方法有多种形色，不仅包括蛋白质本 身，也包括编码融合蛋白的DNA。本发明还包括融合蛋白的药物组合物。组合物中可以含有药物可接受的载 体。药物组合物可以以任何形式的药物制剂形式存在，优选的是注射剂，包括水剂 和冷冻干燥注射剂。该药物组合物可以按照制剂学常规技术制备，包括将药物活性 成分，本发明的多肽与药物载体混合，按照制剂技术制成所需要的剂型。
图l:利用蛋白质前体加工酶(PC)人工神经网络系统对TACI蛋白氨基酸序列的分析结果。位于TACI的胞外区域第9和第135氨基酸是PC酶切位点。第12和第120氨基酸的积分亦接近PC酶切位点临界值。图2:显示自然TACI蛋白全长和四种TACI-Fc融合蛋白的结构。图3:四种TACI-Fc融合蛋白在CH0细胞蛋白表达量的比较。图4:显示四种TACI-Fc融合蛋白与BLyS结合的试验结果。结果显示它们都与BLyS具结合能力，尤其以T3的结合能力最强。图5:纯化的T3融合蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。电泳结果显示从CHO高效表 达细胞系生产的T3融合蛋白呈单一条带，其分子量约为42 kD，与预期的糖基化 后的T3融合蛋白的分子量相吻合。图6: T3融合蛋白在的胶原诱导的小鼠关节炎模型显示显著的抗自身免疫疾病的作 用。小鼠关节炎病情发展以关节炎临床积分为量度。结果显示TACI-Fc融合蛋白 T3治疗的小鼠临床积分显著比对照组为轻，差别非常显著(P<0.01).具体实施方式
本发明通过以下实例对TACI-Fc融合蛋白的设计，构建，和试验作了详细说 明，但本发明的内容及用途并不限制于实例的范围。 实施例1: TACI序列分析。蛋白质前体加工酶(Proprotein convertase， PC)能在细胞内特异性地切 割蛋白多肽。对许多蛋白质来说，PC切割是蛋白质翻译后的修饰加工过程中的一 个重要步骤。蛋白质前体加工酶家族由多种酶组成。它们能识别蛋白质内的特异氨 基酸序列，并对这些序列经行切割。蛋白质前体加工酶人工神经网络(PC artificial neural networks)是一个利用已知PC酶切位点数据库预测蛋白质序 列中可能存在的PC酶切位点的计算机软件系统。可以利用该系统分析蛋白质中存 在的PC酶切位。本发明将TACI氨基酸序列全长输入PC人工神经网络软件系统， 分析发现TACI的胞外区域序列中包含两个PC酶切位点(第9和第135氨基酸)。 除此之外，另有两个位点(第12和第120氨基酸)的积分亦接近PC酶切位点临 界值(图l)。鉴此，在设计优化的TACI-Fc融合蛋白时可避开这几个PC酶切位 点，将不含有酶切位点的TACI片段与Fc相融合。基于这一发现，我们构建了若 干个TACI-Fc融合蛋，其TACI部分来自TACI的第12至120氨基酸之间(图 2)。它们的共同特征是1)包含TACI氨基末端区的大部分序列，2)包含富半胱 氨酸区的全部序列，和3)包含柄区的部分序列。实施例2。融合蛋白质及其质粒的构建。用Qiagen公可RNA提纯药盒从人外周血单个核细胞提纯总RNA。然后用逆 转录酶从RNA合成cDNA。再用不同的引物利用聚合酶链反应(PCR)扩增获得所需要 的TACI片断。免疫球蛋白Fc片断从已克隆的IgGl Fc质粒经PCR扩增获得。最 后用PCR将TACI和Fc序列相融合，从而构建成TACI-Fc融合蛋白质的DNA序 列。聚合酶链反应包括变性95'C, 30秒；退火56'C, 45秒；延伸72'C， 2分, 30个循环。用TA cloning试剂盒，把TACI和Fc的PCR产物分别克隆入pCR2. 1 质粒，转染E。 coli，选取白色菌落，加入LB培养基，培养过夜。再用Qiangen 质粒提取试剂盒提取质粒，径酶切和测序鉴定TACI和Fc序列。最后，采用拼接 PCR方法把TACI和IgG Fc cDNA连接在一起。将TACI-Fc片段插入表达质粒中。 将重组质粒转染E。 coli，选取阳性菌落，提取质粒后经酶切和测序鉴定目的序 列。将质粒转染CHO细胞以获得融合蛋白的表达。8Tl蛋白TACI 13-108氨基酸+ Fc。见序列表序列1和5。T2蛋白TACI 13-118氨基酸+ Fc。见序列表序列2和6。T3蛋白TACI 13-118氨基酸+连接序列9Gly + Fc。见序列表序列3和7。此外，本研究亦包括另一个融合蛋白T4作比较。T4蛋白与其他三个融合蛋 白的区别在于不含TACI氨基末端区序列，由TACI的第30-110氨基酸序列和Fc序 列融合而成。T4的序列见序列表序列4和8。Tl融合蛋白引物序列正向引物AGCCGTGTGGACCAGGAGGAG反向引物GAGCTTGTTCTCACAGAAGTATGT2融合蛋白引物序列正向引物AGCCGTGTGGACCAGGAGGAG反向引物GAGCTCTGGTGGAAGGTTCACTGT3融合蛋白引物序列正向引物AGCCGTGTGGACCAGGAGGAG反向引物ACCTCCACCTCCACCTCCACCTCCACCGAGCTCTGGTGGAAGGTTCACTGGGCTCCTT4融合蛋白引物序列正向引物GCTATGAGATCCTGCCCCGAAG反向引物TGAAGATTTGGGCTCGCTCC实施例3: TACI-Fc融合蛋白在细胞中的表达。本发明以哺乳动物细胞为例提供了表达TACI-Fc融合蛋白的实例。将T1， T2， T3和T4四种融合蛋白克隆到pcDNA3. 1质粒(Invitrogen)。融合蛋白的 5'末端加人Flt-l信号肽序列。用质粒DNA提纯药盒(QIAGEN公司)提取四种 TACI-Fc高纯度质粒DNA。然后利用FUGEN6转染药盒(ROCHE公司)将质粒DNA分别 导入CH0细胞中。我们用瞬时转染(Transient transfection)法，对这四种TACI-Fc的表达水平进行了比较。用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基将CH0细胞在细 胞培养皿内培养。当细胞生长至一定时，将质粒DNA与FUGEN 6试剂(Roche)的 复合物加入细胞培养液中，培养三天后收集上清液。这些细胞上清液中含有表达的融合蛋白。融合蛋白的浓度用ELISA法定量确定。蛋白的浓度结果如图3，融合蛋 白的表达量以T3最高，T2其次，T4最低。因此，从蛋白的表达量来说，T3融合 蛋白是最佳的分子组合。实施例4:融合蛋白与BLyS的结合实验。在得到各融合蛋白的表达后，我们用BLyS结合试验测定了它们与BLyS的结 合活性。在这一试验中，首先将重组BLyS (R&D Systems公司)蛋白质包被在96 孔ELISA板上。用2。/。BSA阻断溶液封闭非特异性蛋白结合位点，向各孔加入含有不 同浓度的TACI融合蛋白质。37度培养两个小时。清洗以后，加入兔抗人Ig抗体-HRP。最终用过氧化物酶底物显色。用ELISA阅读仪测量96孔板各孔0D值。增高 的0D值代表融合蛋白质与BLyS的结合信号。我们发现与BlyS的结合能力以T3 最佳，T1和T2居中，T4最低(图4)。因此，无论从表达量还是对BLyS的结 合能力，T3融合蛋白是最佳的分子组合。实施例5:高效表达细胞系的建立。在确定T3融合蛋白是最佳的分子组合后，我们用稳定转染和基因扩增的方 法建立了 CHO稳定高效表达细胞株。将含有T3融合蛋白基因克隆到含DHFR基因 的质粒中。用QIAGEN公司DNA提纯药盒提取高纯度质粒DNA，再用电钻孔法转染 CH0细胞。转染后的细胞在选择培养中经行克隆培养，获得抗性克隆。用氨甲碟呤 (MTX)加压进行基因扩增，得到高效表达的细胞株。最后将细胞扩大培养，在生 物反应器中大规模生产该融合蛋白。融合蛋白的浓度用ELISA法定量确定。用该方 法，我们成功地大规模生产了T3融合蛋白。单细胞产量可大于每天每细胞20 pg。
T3融合蛋白可用A蛋白或G蛋白亲和层析提纯。 实施例7: TACI-Fc融合蛋白的电泳鉴定本发明用实验证明优化的融合蛋白在表达过程中不发生降解。将T3融合蛋 白高效表达细胞株在培养瓶中培养，等细胞生长至高密度后，收集细胞培养液上 清，用A蛋白亲和层析提纯融合蛋白。将纯化的融合蛋白与聚丙烯酰胺凝胶样品 缓冲液相混合，置于沸水浴中3分钟。将蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶加样后电泳。电 泳后的凝胶用考马斯亮蓝染色，甲醇脱色后观察蛋白条带。实验结果显示T3蛋白 呈单一条带(图5)，其分子量约为42 kD，与预期的糖基化后的T3融合蛋白的分子量相吻合。重要的是，没有观测到分子量小于42 kD的蛋白条带。这一结果说 明本发明改良后的TACI-Fc融合蛋白序列有效地防止了蛋白在表达过程中被切割和 降解，可以用于工业化大规模生产。实施例8: TACI-Fc融合蛋白的抗自身免疫疾病作用本发明利用胶原诱导的小鼠关节炎模型证明改良的TACI-Fc融合蛋白在体内 的抗自身免疫生物学活性。将8周龄的DBA/1小鼠分成了两组，每组10只。向小 鼠以皮内注射与福氏完全佐剂混合的200微克牛II型胶原蛋白。21天后，再注射 与福氏不完全佐剂混合的牛II型胶原蛋白。自第24天开始，实验组小鼠皮下注射 T3融合蛋白，每鼠每次100微克， 一周三次。对照组鼠注射同剂量的正常人 IgG。小鼠关节炎病情发展以关节炎临床积分为量度。实验结果显示T3组病情显著 比对照组为轻，临床积分差部非常显著(P〈0.01)(图6).综上所述，本发明所优化构建的TACI-Fc融合蛋白克服了 TACI蛋白降解的 问题，且具有生物学活性强，蛋白表达量高的特点，可以用于工业化大规模生产。序列表<110>南京健博生物技术有限公司〈120〉优化的TACI-Fc融合蛋白及其用途<歸8〈210>1〈211>323<212>PRT<213>人工序列〈400>1SerArgValAspGlnGluGluArgPheProGlnGlyLeuTrpThrGlyValAlaMetArg 15 10 15 20SerCysProGluGluGlnTyrTrpAspProLeuLeuGlyThrCysMetSerCysLysThr 21 25 30 35 40IleCysAsnHisG]nSerGlnArgThrCysAlaAlaPheCysArgSerLeuSerCysArg 41 45 50 55 60LysGluGlnGlyLysPheTyrAspHisLeuLeuArgAspCysIleSerCysAlaSerlle 61 65 70 75 80CysGlyGlnHisProLysGlnCysAlaTyrPheCysGluAsnLysLeuAspLysProHis 81 85 90 95 100ThrCysProLeuCysProAlaProGluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPhePro 101 105 110 115 120121 125 130 135 140141 145 150 155 160HisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyrArgValValSer 161 165 170 175 180ValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSer 181 185 190 195 200AsnLysAlaLeuProAlaProIleGluLysThrlleSerLysAlaLysGlyGlnProArg 201 205 210 215 220GluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGlnValSer 221 225 230 235 240LeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsn 241 245 250 255 260GlyGlnProGluAsnAsnTyrLysAlaThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhe 261 265 270 275 280281 285 290 295 300CysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSer 301 305 310 315 320ProGlyLys 321 323<210>2<211>333<212>PRT<213〉人工序列<400〉2SerArgValAspGlnGluGluArgPheProGlnGlyLeuTrpThrGlyValAlaMetArg 15 10 15 2021 25 30 35 40IleCysAsnHisGlnSerGlnArgThrCysAlaAlaPheCysArgSerLeuSerCysArg 41 45 50 55 60LysGluGlnGlyLysPheTyrAspHisLeuLeuArgAspCysIleSerCysAlaSerlle 61 65 70 75 80CysGlyGlnHisProLysGlnCysAlaTyrPheCysGluAsnLysLeuArgSerProVal 81 85 90 95 100AsnLeuProProGluLeuAspLysProHisThrCysProLeuCysProAlaProGluLeu 101 105 110 115 120121 125 130 135 140141 145 150 155 160PheAsnTrpTyrValAspGlyValGluVa皿sAsnAlaLysThrLysProArgGluGlu 161 165 170 175 180GlnTyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeu 181 185 190 195 200AsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProIleGluLys 201 205 210 215 220ThrlleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSer 221 225 230 235 240ArgAspGluLeuThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrPro 241 245 250 255 260<210〉3〈211>342〈212>PRT〈213>人工序列<400>3序列3:SerArgValAspGlnGluGluArgPheProGlnGlyLeuTrpThrGlyValAlaMetArg 15 10 15 2021 25 30 35 40IleCysAsnHisGlnSerGlnArgThrCysAlaAlaPheCysArgSerLeuSerCysArg 41 45 50 55 6061 65 70 75 80CysGlyGlnHisProLysGlnCysAlaTyrPheCysGluAsnLysLeuArgSerProVal 81 85 90 95 100101105110115120121 125 130 135 140LysProLysAspThrLeuMetlleSerArgThrProGluValThrCysValValValAsp 141 145 150 155 160ValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHis 161 165 170 175 180AsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyxAsnSerThrTyrArgValValSerVal 181 185 190 195 200LeuThrVa!LeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlylysGluTyrLysCysLysValSerAsn 201 205 210 215 220Lu221 225 230 235 240ProGlnVEilTyrThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGlnValSerLeu 241 245 250 255 260261 265 270 275 280GlnProGluAsnAsnTyrLysAlaThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePhe 281 285 290 295 300LeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCys 301 305 310 315 320SerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSerPro 321 325 330 335 340Glylys 341 342<210〉4<211>313<212〉PRT<213>人工序列<400〉4AlaMetArgSerCysProGluGluGlnTyrTrpAspProLeuLeuGlyThrCysMetSer 15 10 15 2021 25 30 35 40SerCysArgLysGluGlnGlyLysPheTyrAspHisLeuLeuArgAspCysIleSerCys 41 45 50 55 60AlaSerlleCysGlyGlnHisProLysGlnCysAlaTyrPheCysGluAsnLysLeuArg 61 65 70 75 80SerGluProLysSerSerAspLysProHisThrCysProLeuCysProAlaProGluLeu 81 85 90 95 100LeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetlleSer 101 105 110 115 120ArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHisGluAspProGluValLys 121 125 130 135 140PheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGlu 141 145 150 155 160GlnTyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeu 161 165 170 175 180181185190195200201 205 210 215 220ArgAspGluLeuThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrPro 221 225 230 235 240241 245 250 255 260ProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAspLys 261 265 270 275 280281 285 290HisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSerProGlyLys 301 305 310 313295300<210〉5<211〉969<212〉DNA<213>人工序列〈400>5agccgtgtgg accaggagga gcgctttcca cagggcctgt ggacgggggt ggctatgaga 60tcctgccccg aagagcagta ctgggatcct ctgctgggta 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权利要求
1、一种由截断的TACI与免疫球蛋白Fc组成的融合蛋白，其特征在于，融合蛋白的TACI部分包括来自TACI胞外区氨基末端区的部分序列，富半胱氨酸区的全部序列，和柄区的部分序列，融合蛋白的免疫球蛋白Fc包括铰链区，CH2区和CH3区，TACI序列与Fc序列之间是直接融合，或经连接序列融合。
2、 权利要求1的融合蛋白，其特征在于，其中的TACI片段选自TACI的第13 至108氨基酸序列或第13至118氨基酸序列，其中连接序列为9Gly，其中的免 疫球蛋白Fc片段选自人或动物的免疫球蛋白Fc，选自IgG, ， IgM， IgD， IgA, 每种免疫球蛋白类型包括各亚型。
3、 权利要求l的融合蛋白，其特征在于，其中的免疫球蛋白Fc片段选自IgGl。
4、 权利要求l的融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为序列表l-3的序列。
5、 编码有权利要求1的蛋白质的DNA序列。
6、 权利要求5的DNA序列，其特征在于，为序列表5-7的序列。
7、 含有权利要求5所述DNA序列的载体。
8、 含有权利要求7中所述载体的细胞，这些细胞可用于相应的权利要求1中的 融合蛋白质的表达，它们选自真核细胞或原核细胞。
9、 权利要求l的融合蛋白在制备阻断BLyS或APRIL的药物中的应用。
10、 含有权利要求l的融合蛋白的药物组合物。
全文摘要
本发明涉及一种优化的TACI-Fc融合蛋白，该蛋白是用基因工程方法优化构建的融合蛋白质，融合蛋白质由来自TACI的多肽片断与免疫球蛋白Fc融合而成，优化的TACI-Fc融合蛋白不尽克服了天然TACI蛋白容易降解的问题，而且更具有生物学活性强，蛋白表达量高的特点，本发明包括这些融合蛋白质的构建，制备和在疾病治疗方面的应用。
文档编号A61P35/00GK101323643SQ20071011116
公开日2008年12月17日 申请日期2007年6月15日 优先权日2007年6月15日
发明者征 刘 申请人:烟台荣昌生物工程有限公司