强免疫原性重组内源性因子的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地指一种强免疫原性重组内源性因子的制备方法 及应用。
【背景技术】
[0002] 血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)在正常生理情 况下如胚胎形成及病理情况下如肿瘤的生长均有表达，参与新生血管的形成。
[0003] 血管生成是一个多步骤的复杂过程，需要大量细胞因子的协调作用，其中VEGF是 起核心作用的血管形成正调控因子。其具有促进血管内皮细胞增殖、存活及迀移和诱导血 管生成、增强血管通透性及血管舒张等作用。在正常的生理情况下，血管生长是受一系列作 用因子严格控制的，这些因子既可以开启血管生成也可以抑制血管生成。然而，在肿瘤生长 过程中这种平衡却被打破，在瘤块不断长大的过程中必须要有足够的氧气和营养供应，这 时就需要大量新生血管的形成来满足要求，肿瘤细胞本身或者刺激机体相关细胞大量表达 VEGF。所以这就提示人们或许可以通过研制抗VEGF的药物来达到广谱抑制甚至治疗肿瘤 的效果。
[0004] 目前，以VEGF/VEGFR为靶标的抗肿瘤药物的研发已取得了很大进展，有多种药物 已批准上市或正在临床试验中。最开始的关于抗VEGF药物的研宄都是基于被动免疫基础 上，其中作为第一批被美国FDA批准并投入临床使用的抗血管生成类药物贝伐单抗就是一 种针对VEGF-A的人源化鼠单克隆抗体。它与传统化学疗法联合使用在临床治疗中可有 效的抑制多种人类肿瘤细胞的生长，如结直肠癌、肾细胞癌、乳腺癌、非小细胞型肺癌、肝癌 等。至今已有多种抗血管生成单克隆抗体被证实具有抗肿瘤的临床疗效，但这些药物不仅 昂贵，而且由于血浆半衰期短抗血管能力有限，临床治疗经常需要大剂量长期静脉摄入，由 此带来较多毒副反应，使患者需要住院治疗及特殊护理，这些都给患者及医疗体系带来巨 大的经济负担。随着分子免疫学及肿瘤免疫学的迅猛发展，肿瘤治疗性疫苗因其特异性高 针对性强且毒副作用小等特点，已经成为恶性肿瘤主动免疫治疗发展的重要方向，特别是 以VEGF/VEGFR为靶位的抗肿瘤血管生成主动免疫治疗取得了令人鼓舞的研宄进展。
[0005] 但是，由于VEGF本身是机体的内源性因子，存在免疫耐受机制而很难诱导产生抗 体或抗体效价较低，所以研宄VEGF疫苗首要解决的问题就是怎样提高VEGF疫苗的免疫原 性。有研宄者将异源的VEGF用于免疫动物，如用非洲爪蟾的VEGF免疫小鼠，但免疫后并未 检测到有效的抗VEGF抗体。免疫学中常用的增强较弱抗原免疫原性的方法是将该抗原成 分连接到有强抗原特性的蛋白载体，或是配以佐剂。有研宄者将VEGF蛋白与其它免疫原性 较强的蛋白相偶联进行融合表达，如来自于破伤风毒素的辅助T细胞表位，来自结核分支 杆菌的热休克蛋白65等，但得到的融合蛋白仍然不能激发有效的免疫反应，不能产生高效 价的抗VEGF抗体和显著的抗瘤效果。古巴研宄者将VEGF与来自于脑膜炎奈瑟球菌的膜蛋 白进行融合表达，用于免疫动物，经检测可以诱导产生一定效价的抗VEGF抗体，但是效果 仍然不甚理想，如存在抗体效价较低，需连续多次（多达8~10次以上）免疫等问题，且与 VEGF融合表达的脑膜炎奈瑟球菌的膜蛋白，其安全性仍有待进一步证实。因此，采用新的方 法和策略，得到更为有效及安全的VEGF抗原，从而打破机体的免疫耐受，诱导产生高效价 的抗体，获得良好的抗瘤效果，是研发以VEGF为靶标的抗肿瘤疫苗的关键。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术不能有效解决上述自身抗原的弱免疫原性的缺 陷，提供一种可增强自身蛋白抗原免疫原性的方法及该方法的应用。
[0007] 为实现上述目的，其一，本发明提供了一种强免疫原性重组内源性因子的制备方 法，该方法为：利用DNA shuffling技术对内源性因子的免疫原性进行基因改组，然后从重 组后的基因中筛选表达具有较高免疫原性内源性因子的基因序列。
[0008] 上述方法中，所述DNA shuffling技术中选取多个基因或基因家族用于基因改组， 所述基因或基因家族来源于不同物种且种属间具有同源性的基因。
[0009] 上述方法中，所述DNA shuffling技术中选取的用于基因改组的基因家族优选为 3个以上。
[0010] 上述强免疫原性重组内源性因子的制备方法，具体地包括以下步骤：
[0011] ⑴获取用于基因改组的多个物种中待改组的内源性因子的基因片段，其中，多个 物种中包含了待增强内源性因子免疫原性的目的物种；
[0012] (2)对步骤⑴获得的基因片段进行酶切，得到片段大小在10~IOObp的DNA小 片段；
[0013] (3)以DNA小片段互为模板和引物进行PCR扩增，得到大小不等的PCR产物片段；
[0014] (4)以PCR产物片段作为模板，利用混合引物进行PCR扩增，得到扩增片段，所述混 合引物是根据步骤（1)中得到的多个物种的基因片段中同源性片段的前后序列进行设计 所得，每个物种各有一对引物；
[0015] (5)利用扩增片段构建表达载体，转化菌种后，利用根据所述目的物种中内源性因 子的基因片段所设计的引物对，对转化菌种中所含基因进行PCR检测筛选，得到一组具有 较高免疫原性的内源性因子基因；
[0016] (6)通过对步骤（5)得到的一组具有较高免疫原性的同源性因子基因进行筛选表 达，得到强免疫原性重组内源性因子。
[0017] 本发明还提供了上述强免疫原性重组内源性因子的制备方法在制备抗肿瘤疫苗 及与内源性因子表达增加相关疾病的疫苗中的应用。
[0018] 其二，本发明提供了一种强免疫原性重组VEGF的制备方法，该方法为：利用DNA shuffling技术对VEGF的免疫原性进行基因改组，得到重组VEGF，其中选取的用于基因改 组的基因家族分别来自小鼠、大鼠、鸡、兔、猴、狗、人中的任意3个或3个以上。
[0019] 上述强免疫原性重组VEGF的制备方法，具体地包括以下步骤：
[0020] (1)获取用于基因改组的小鼠、大鼠、鸡、人的VEGF的基因片段；
[0021] (2)利用Dnase I酶对步骤⑴获得的基因片段进行酶切，得到片段大小在10~ IOObp的DNA小片段；
[0022] (3)以DNA小片段互为模板和引物进行PCR扩增，得到大小不等的PCR产物片段， 其中，PCR扩增条件为94°C 4分钟，随之以94°C 45秒、55°C 45秒和72°C 50秒进行55个循 环，最后以72°C 10分钟结束；
[0023] (4)以PCR产物片段作为模板，利用混合引物进行PCR扩增，得到扩增片段；
[0024] 其中，所述混合引物包含四对引物，核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 9~16所示； PCR扩增条件为94°C 4分钟，随之以94°C 45秒、60°C 45秒和72°C 50秒进行35个循环，最 后以72°C 10分钟结束；
[0025] (5)利用扩增片段构建表达载体，转化菌种后，利用核苷酸序列如SEQ ID NO. 17、 18所示的人引物对，对转化菌种中所含基因进行PCR检测筛选，得到一组具有较高免疫原 性的内源性因子基因；其中，PCR条件为94°C 4分钟，随之以94°C 45秒、66 °C 45秒和72 °C 50 秒进行35个循环，最后以72°C 10分钟结束；
[0026] (6)通过对步骤（5)得到的一组具有较高免疫原性的同源性因子基因进行筛选表 达，得到强免疫原性重组VEGF。
[0027] 上述强免疫原性重组VEGF的制备方法所获得的强免疫原性重组VEGF应该在本发 明的保护范围内。
[0028] 本发明还提供了上述增强VEGF免疫原性的方法在制备抗肿瘤疫苗以及抗视网膜 血管性疾病疫苗中的应用。
[0029] 其三，本发明提供了 一种强免疫原性重组VEGF蛋白抗原，它的分子量为 13934. 76,等电点（pi)为6. 69,其蛋白序列如SEQ ID NO. 20所示。
[0030] 本发明还提供了上述强免疫原性重组VEGF蛋白抗原的核苷酸编码序列，如核苷 酸序列 SEQ ID NO. 19。
[0031] 本发明还提供了上述强免疫原性重组VEGF蛋白抗原在制备抗肿瘤疫苗以及抗视 网膜血管性疾病疫苗中的应用。
[0032] 本发明的原理：
[0033] 肿瘤抗原大多为自身蛋白，一般来说免疫原性低下，通常的策略是使用免疫原性 较强的蛋白进行偶联或融合表达，如破伤风毒素、来自于结核分枝杆菌的热休克蛋白等，或 使用较强的佐剂进行免疫。然而，这些方法虽然对某些抗原有效，但并不能解决那些容易诱 导免疫耐受的自身抗原，如血管内皮生长因子（VEGF)。
[0034] 目前，尽管DNA shuffling已被广泛报道用于微生物酶的人工进化，但在抗原及疫 苗中的成功应用还比较少。虽然有研宄者将此技术用于改造病毒抗原，但未见其在改造内 源性因子的抗原及疫苗中的应用。
[0035] 我们利用DNA改组技术，首次将不同物种（大鼠，小鼠，人和鸡）的内源性因子的 基因序列进行重组，从而得到新的融合有不同物种基因片段的重组内源性因子的VEGF蛋 白疫苗。并且在理论上，内源性因子的免疫原性增强都可以通过DNA改组进行。
[0036] 本发明的有益效果：
[0037] 1、利用DNA shuffling技术，增强内源性因子的免疫原性，为改造自身抗原提供了 一种新的方向，并且可以由获得的强免疫原性内源性因子中挑选合适的制备抗多种肿瘤的 疫苗，具有较高的经济及社会效益。
[0038] 2、DNA shuffling技术成熟，用其增强内源性因子的免疫原性方法简单，成功率 高，可以筛选出效果较好的抗原。
[0039] 3、本发明所提供的VEGF疫苗，免疫原性强、用量少、成本低、副作用小、效果好。
【附图说明】
[0040] 图1为小鼠、大鼠、鸡及人的VEGF-A基因经DNase I酶切后的片段电泳图，大小约 50bp ；
[0041] 图2为以图1中小鼠、大鼠、鸡及人的VEGF-A基因酶切后的50bp片段互为引物和 模板，经PCR扩增得到的片