制备重组牛肠激酶催化亚基蛋白的方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域重组蛋白的制备方法，具体是一种制备重组牛肠激酶催化亚基蛋白的方法，其步骤为：⑴在牛肠激酶催化亚基的基因EKL上构建突变体EKLM，突变体EKLM的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；⑵替换掉突变体EKLM中存在的大肠杆菌不利表达的密码子从而获得优化的基因序列EKLMO，EKLMO的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。利用本发明所述制备重组牛肠激酶催化亚基蛋白的方法，可以有效保持牛肠激酶催化亚基的活性，具有很高的蛋白得率，而且本发明所述的方法生产工艺简单，产品质量稳定。提纯后的蛋白可以用于生物工程或药物生产等多个目的，具有显著的应用价值。
【专利说明】制备重组牛肠激酶催化亚基蛋白的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域重组蛋白的制备方法，具体是一种制备重组牛肠激酶催 化亚基蛋白的方法。
【背景技术】
[0002] 肠激酶（Enterokinase，简写为EK)是存在于哺乳动物十二指肠内的一种异源二 聚体丝氨酸蛋白酶。其天然蛋白分子量为150kDa，由一条115kDa的重链和一条35kDa的轻 链组成，在pH值4. 5-9. 5和温度4-45°C之间均可以特异性的水解蛋白底物。肠激酶识别 底物蛋白的序列为DDDDK，它可以在赖氨酸残基的C端进行切割。这样的酶切优势使其成为 了融合蛋白表达体系中理想的工具酶。天然提取的肠激酶很容易混有其它种类蛋白酶，限 制了其在基因工程中的广泛应用。因此利用基因工程重组制备肠激酶逐渐成为大家选择的 方向。
[0003] 肠激酶由一条重链和一条轻链组成，重链又称结构亚基，轻链又称催化亚基，二者 通过分子间二硫键结合。结构亚基负责将肠激酶定位到小肠的刷状缘膜上，催化亚基行使 催化活性，将胰蛋白酶原激活成为胰蛋白酶。为了高效获得制备肠激酶催化亚基蛋白，有必 要开发基因工程重组肠激酶催化亚基。
【发明内容】
[0004] 本发明为了解决然提取的肠激酶很容易混有其它种类蛋白酶，限制了其在基因工 程中的广泛应用，提供了一种制备重组牛肠激酶催化亚基蛋白的方法。
[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的：制备重组牛肠激酶催化亚基蛋白的方法，其 步骤为： ⑴在牛肠激酶催化亚基的基因 EKL上构建突变体EKLM，突变体EKLM的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示； ⑵替换掉突变体EKLM中存在的大肠杆菌不利表达的密码子从而获得优化的基因序列 EKLMO, EKLM0的核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示； ⑶在EKLM0的5'末端加入牛肠激酶自身的酶切位点序列，在EKLM0的3'末端加入标 签序列，得到完整的表达基因片段； ⑷将上述表达基因片段克隆进入载体，构建得到高效表达载体，将其转入大肠杆菌 BL21，用IPTG诱导重组基因的表达； (5)收集菌体，提纯目的蛋白。
[0006] 本发明步骤⑴在牛肠激酶催化亚基的基因 EKL上构建突变体EKLM，目的在于提高 重组蛋白的活性和稳定性，突变位点包括C112S，S121P，Y175R。步骤⑵中为了便于在大肠杆 菌中的表达，替换掉不利表达的密码子从而获得优化的基因序列EKLM0。步骤⑶中在EKLM0 的5'末端加入牛肠激酶自身的酶切位点序列DDDDK，便于重组蛋白自酶切。
[0007] 进一步，所述步骤⑶中标签序列为四个连续的组氨酸标签序列HIS4。所述的标签 序列除了采用本发明提到的四个连续的组氨酸标签序列his4，还可采用本领域常用的其它 标签序列，例如Flag标签，HA标签，GST标签等等。
[0008] 进一步，所述步骤(5)中提纯目的蛋白采用的是包涵体变复性方法。
[0009] 本发明提到的包涵体变复性方法可以有多种实现方法，但是通过发明人常识多种 方法之后，筛选得到了高产率的变复性方法，该方法相对于其他一般的包涵体变复性方法 其产率至少可以提高500%。所述的包涵体变复性方法的步骤为 ： ① 按照每l〇g菌体加入30ml比例加入到溶液A中重悬，破碎细胞，高速离心获得包涵 体；所述溶液A为50mM Tris，pH 7. 0 ; ② 利用溶液B清洗包涵体两次；溶液B为50mM Tris，pH 7. 0,500mM NaCl，20mM EDTA， 2% Triton X-100 ; ③ 向包涵体中加入20倍包涵体质量的溶液C，溶解24h ;溶液C为7. 5M盐酸胍，pH 9. 0， 50mM Tris，100mM 疏基乙醇； ④ 溶解24h后将溶液pH调整至3. 5,采用溶液D进行透析；透析完成后，高速离心去 掉沉淀，上清逐渐滴加到10倍上清体积的复性溶液E中；所述溶液D为7. 5M盐酸胍，50mM Tris，pH 4. 0 ;所述复性溶液E为0. 7M精氨酸，pH 8. 6, 2mM还原性谷胱甘肽，ImM EDTA ; ⑤ 复性72h后，采用溶液F对添加有上清的复性溶液E进行透析，透析完成后，高速离 心去掉沉淀，获得目的蛋白溶液；溶液F为20mM Tris，PH7. 6,20mM NaCl，lmM CaCl2。
[0010] 通过包涵体变复性提纯获得目的蛋白溶液后采用镍离子亲和柱快速纯化目的蛋 白。通过该纯化处理产物浓度可以得到有效地提高，SDS-PAGE分析纯化处理后的目的蛋白 纯度在95%以上，浓度超过lmg/ml。 toon] 利用本发明所述制备重组牛肠激酶催化亚基蛋白的方法，可以有效保持牛肠激酶 催化亚基的活性，具有很高的蛋白得率，而且本发明所述的方法生产工艺简单，产品质量稳 定。提纯后的蛋白可以用于生物工程或药物生产等多个目的，具有显著的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图 1 为 pET-26b-DDDDK-EKLM0-HIS4 的质粒构建图谱。
[0013] 图2为SDS-PAGE实验显示提纯产物中EKLM0蛋白的浓度和纯度。
[0014] 图3 :SDS-PAGE实验显示EKLM0蛋白的酶切活性，图中Marker右边的A为待酶切 蛋白，B为待酶切蛋白加入对照EKL酶的酶切效果，C为待酶切蛋白加入本发明制备的EKLM0 蛋白的酶切效果，加入酶的量均为1/1000质量比，酶切时间为2小时。
【具体实施方式】
[0015] 制备重组牛肠激酶催化亚基蛋白的方法，其步骤为： ⑴为了提高重组蛋白的活性和稳定性，基于牛肠激酶的晶体结构，以牛肠激酶催化亚 基的基因 EKL为模板，设计突变体蛋白EKLM，突变位点包括C112S，S121P和Y175R。突变后 的EKLM的全长核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0016] ⑵为了提高蛋白产量，替换掉突变体EKLM中存在的大肠杆菌不利表达的密码子 从而获得优化的基因序列EKLMO, EKLM0的核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0017] ⑶为了后续提纯方便，在EKLM0的5'末端加入牛肠激酶自身的酶切位点序列 DDDDK，在EKLMO的3'末端加入四个连续的组氨酸标签序列HIS4，得到完整的表达基因片段 ddddk-eklmo-his4。
[0018] ⑷设计引物P1和P2如下所示： P1 ： GGGAATTCCATATGGGTCCGATCGATGACGACGACAAGATCGTGGGCGGTAGCGACAG P2 ： CCGCTCGAGTTAATGATGATGATGGTGCAGGAAGCTCTGTATCCACTCG 引物稀释成50ρπι〇1/μ 1，然后进行PCR步骤。琼脂糖凝胶电泳检测DDDDK-EKLM0-HIS4 条带位于750bp左右，胶回收目的基因，用ΜΜ和通ο I将基因酶切成粘性末端，同样处理 pET-26b载体，加入T4 DNA连接酶，4°C连接12小时，转化大肠杆菌DH5 α。用硫酸卡那霉 素-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，利用酶切 和PCR的方法鉴定正确，然后核苷酸序序列分析含有正确的基因序列阅读框架，构建成功 pET-26b- DDDDK-EKLM0-HIS4载体。将EKLM0的表达载体转化BL21菌，常规扩增培养，加入 0. 5mM IPTG进行诱导，37度诱导4小时，此时表达出的蛋白为DDDDK-EKLM0-HIS4蛋白，即 可以收集菌体。
[0019] (5)收集菌体，提纯目的蛋白： ① 按照每l〇g菌体加入30ml比例加入到溶液A中重悬，破碎细胞，高速离心获得包涵 体；所述溶液A为50mM Tris，pH 7. 0 ; ② 利用溶液B清洗包涵体两次；溶液B为50mM Tris，pH 7. 0,500mM NaCl，20mM EDTA， 2% Triton X-100 ; ③ 向包涵体中加入20倍包涵体质量的溶液C，溶解24h ;溶液C为7. 5M盐酸胍，pH 9. 0， 50mM Tris，100mM 疏基乙醇； ④ 溶解24h后将溶液pH调整至3. 5,采用溶液D进行透析；透析完成后，高速离心去 掉沉淀，上清逐渐滴加到10倍上清体积的复性溶液E中；所述溶液D为7. 5M盐酸胍，50mM Tris，pH 4. 0 ;所述复性溶液E为0. 7M精氨酸，pH 8. 6, 2mM还原性谷胱甘肽，ImM EDTA ; ⑤ 复性72h后，采用溶液F对添加有上清的复性溶液E进行透析，透析完成后，高速离 心去掉沉淀，获得目的蛋白溶液；溶液F为20mM Tris，PH7. 6,20mM NaCl，lmM CaCl2。包涵 体变复性处理过程中发生了自酶切反应获得目的蛋白eklmo-his4。
[0020] (6)通过包涵体变复性提纯获得目的蛋白溶液后采用镍离子亲和柱快速纯化目的 蛋白，利用SDS-PAGE鉴定分析纯度和活性，其实验结果见图2和图3。 〈110>杨霞 〈120>制备重组牛肠激酶催化亚基蛋白的方法 <160>2 <210>1 <211>705 <212>DNA <213> Bos indicus 〈400> attgtcggag gaagtgactc cagagaagga gcctggcctt gggtcgttgc 50 tctgtatttc gacgatcaac aggtctgcgg agcttctctg gtgagcaggg 100 attggctggt gtcggccgcc cactgcgtgt acgggagaaa tatggagccg 150 tctaagtgga aagcagtgct aggcctgcat atggcatcaa atctgacttc 200 tcctcagata gaaactaggt tgattgacca aattgtcata aacccacact 250 acaataaacg gagaaagaac aatgacattg ccatgatgca tcttgaaatg 300 aaagtgaact acacagatta tatacagcct atttcattac cagaagaaaa 350 tcaagttttt cccccaggaa gaatttgttc tattgctggc tggggggcac 400 ttatatatca aggttctact gcagacgtac tgcaagaagc tgacgttccc 450 cttctatcaa atgagaaatg tcaacaacag atgccagaat ataacattac 500 ggaaaatatg gtgtgtgcag gcagagaagc aggaggggta gattcttgtc 550 agggggattc aggcggacca ctcatgtgcc aagaaaacaa cagatggctc 600 ctggctggcg tgacatcatt tggatatcaa tgtgcactgc ctaatcgccc 650 aggggtgtat gcccgggtgc caaggttcac agagtggata caaagttttc 700 tacat 705 <210>2 <211>705 <212>DNA <213> Bos indicus 〈400〉 atcgtgggcg gtagcgacag tcgtgaaggc gcatggcctt gggtggtggc 50 cctgtacttc gacgaccaac aggtgtgtgg cgcaagcctg gttagtcgcg 100 actggctggt tagcgccgcc cactgtgtgt acggccgtaa catggagccg 150 agcaagtgga aagccgtgct gggcctgcac atggccagca acctgaccag 200 ccctcaaatc gagacccgcc tgatcgacca gatcgttatc aacccgcact 250 ataacaagcg ccgcaagaac aacgacatcg ccatgatgca cctggagatg 300 aaagtgaatt acaccgatta catccaacct attagtctgc cggaggagaa 350 ccaggtgttc ccgccgggtc gtatctgcag tatcgccggc tggggcgcac 400 tgatttacca aggcagcacc gccgacgtgc tgcaggaagc agacgtgccg 450 ctgctgagca acgagaagtg ccagcagcag atgccggagt acaatatcac 500 cgagaatatg gtgtgtgccg gccgtgaagc aggcggtgtg gatagttgcc 550 agggtgatag cggcggcccg ctgatgtgcc aggagaacaa ccgctggctg 600 ctggcaggcg tgaccagttt tggctatcaa tgcgccctgc cgaaccgtcc 650 gggtgtgtat gcacgcgttc cgcgtttcac cgagtggata cagagcttcc 700 tgcac 705
【权利要求】
1. 制备重组牛肠激酶催化亚基蛋白的方法，其特征在于，其步骤为： ⑴在牛肠激酶催化亚基的基因 EKL上构建突变体EKLM，突变体EKLM的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示； ⑵替换掉突变体EKLM中存在的大肠杆菌不利表达的密码子从而获得优化的基因序列 EKLMO, EKLM0的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示； ⑶在EKLM0的5'末端加入牛肠激酶自身的酶切位点序列，在EKLM0的3'末端加入标 签序列，得到完整的表达基因片段； ⑷将上述表达基因片段克隆进入载体，构建得到高效表达载体，将其转入大肠杆菌 BL21，用IPTG诱导重组基因的表达； (5)收集菌体，提纯目的蛋白。
2. 根据权利要求1所述的制备重组牛肠激酶催化亚基蛋白的方法，其特征在于，所述 步骤⑶中标签序列为四个连续的组氨酸标签序列HIS 4。
3. 根据权利要求1或2所述的制备重组牛肠激酶催化亚基蛋白的方法，其特征在于，所 述步骤(5)中提纯目的蛋白采用的是包涵体变复性方法。
4. 根据权利要求3所述的制备重组牛肠激酶催化亚基蛋白的方法，其特征在于，所述 包涵体变复性方法的步骤为： ① 按照每l〇g菌体加入30ml比例加入到溶液A中重悬，破碎细胞，高速离心获得包涵 体；所述溶液A为50mM Tris，pH 7. 0 ; ② 利用溶液B清洗包涵体两次；溶液B为50mM Tris，pH 7. 0,500mM NaCl，20mM EDTA， 2% Triton X-100 ; ③ 向包涵体中加入20倍包涵体质量的溶液C，溶解24h ;溶液C为7. 5M盐酸胍，pH 9. 0， 50mM Tris，100mM 疏基乙醇； ④ 溶解24h后将溶液pH调整至3. 5,采用溶液D进行透析；透析完成后，高速离心去 掉沉淀，上清逐渐滴加到10倍上清体积的复性溶液E中；所述溶液D为7. 5M盐酸胍，50mM Tris，pH 4. 0 ;所述复性溶液E为0. 7M精氨酸，pH 8. 6, 2mM还原性谷胱甘肽，ImM EDTA ; ⑤ 复性72h后，采用溶液F对添加有上清的复性溶液E进行透析，透析完成后，高速离 心去掉沉淀，获得目的蛋白溶液；溶液F为20mM Tris，PH7. 6,20mM NaCl，lmM CaCl2。
5. 根据权利要求4所述的制备重组牛肠激酶催化亚基蛋白的方法，其特征在于，通过 包涵体变复性提纯获得目的蛋白溶液后采用镍离子亲和柱快速纯化目的蛋白。
【文档编号】C12N15/70GK104059896SQ201410309168
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年7月2日 优先权日:2014年7月2日
【发明者】杨霞 申请人:杨霞