冬虫夏草中国被毛孢苹果酸脱氢酶a、编码基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一个来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与三羧酸循环用于柠檬酸合成中的苹果酸脱氢酶A，编码这个酶的基因及其应用。所述苹果酸脱氢酶A的氨基酸序列与SEQ?ID?No.1所示的蛋白具有90％以上同源性，其编码基因核苷酸序列与SEQ?ID?No.2所示序列具有90％以上同源性。本发明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用来通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节催化苹果酸制备相应的草酰乙酸的酶对应编码基因的表达，赋予宿主苹果酸脱氢酶A的高表达性，为扩大苹果酸脱氢酶A的生物应用提供了有效途径，具有重大应用前景。
【专利说明】冬虫夏草中国被毛孢苹果酸脱氢酶A、编码基因及其应用(—)
【技术领域】
[0001]本发明涉及一个来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与三羧酸循环用于柠檬酸合成中的苹果酸脱氢酶A (Malic dehydrogenase),编码这个酶的基因及其应用。
(二)
【背景技术】
[0002]冬虫夏草(Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.)是冬虫夏草菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆虫(Hepialus armoricanus Oberthur)幼虫上的子座及幼虫尸体上的复合体(包括子座和虫体)。冬虫夏草是一类珍惜的传统真菌药材资源，具有代谢产物和生物活性多样的特点，在生物医药领域展现出巨大的应用和发展前景。冬虫夏草以其多种药用功效广泛、明显而备受关注，在世界范围内备受推崇。中医认为，冬虫夏草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。现代药理学已证实，冬虫夏草具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素样作用等广泛的生物活性。
[0003]冬虫夏草菌是一种子囊菌，在其生活史中具有分生孢子阶段(无性型)和子囊孢子阶段(有性型)。而在人工培养、液体发酵等实际生产中使用的是无性阶段的冬虫夏草菌，因而冬虫夏草无性型的鉴定非常重要。国内外学者在冬虫夏草资源调查、无性型确证、活性成分分离分析和作用机理、开发应用方面做了大量工作。冬虫夏草中国被毛孢已被证明是冬虫夏草的无性型存在形式，具有与天然冬虫夏草相同的活性成分和药效。
[0004]但是，对冬虫夏草中国被毛孢中苹果酸脱氢酶的研究几乎为空白，尤其在参与三羧酸循环用于柠檬酸合成中的苹果酸脱氢酶的研究上。
[0005]苹果酸脱氢酶(EC: 1.1.1.37)是催化L-苹果酸脱氢变成草酰乙酸的酶。它以NAD+作为电子受体。广义上也包括以NAD+或NADP+作为受体而生成丙酮酸和碳酸的苹果酸酶(EC: 1.1.1.38-40)。与NADP+也有弱反应，也可将其它羟酸脱氢。广泛存在于线粒体、细菌细胞膜上，为三羧酸循环中的一种酶。由于酶的来源不同，其某些性质也不一样。苹果酸在苹果酸脱氢酶催化下脱氢生成草酰乙酸，脱下的氢由NAD+接受生成NADH+H+。再生的草酰乙酸可再次进入三羧酸循环用于柠檬酸的合成。
[0006]苹果酸脱氢酶普遍存在于动物，植物，细菌各种生物体中，具有高度的保守性。苹果酸脱氢酶不仅参与众多生理活动，包括C4循环，呼吸作用，脂肪酸的氧化，TCA循环等，而且在种子萌发，植物生长，花粉发育，果实发育，植物抗逆等方面发挥重要作用。
[0007]1993年,F Cendrin等人从极端嗜盐古细菌Haloarcula marismortui中分离和测序了一个编码的酶苹果酸脱氢酶(MDH)的基因。该酶是由303个氨基酸组成，其分子量为32638道尔顿。
[0008]2008年，朱文滴等人以实验室构建的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肠道cDNA文库苹果酸脱氢酶(cMDH)EST序列为基础，采用末端快速扩增法(RACE)，从健康雌性草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肠道细胞RNA中获得139Ibp的草鱼肠道cMDH的cDNA序列(NCBI登录号:EU569765)。结果显示:该序列包含62bp的5’非编码区(5’ -UTR)，330bp的3’非编码区(3’ -UTR)，典犁加尾信号AATAA位于polyA起点上游16bp。开放阅读框ORF长999bp，共编码333个氨基酸，预测蛋白等电点为6.67，大小为36kDa。
[0009]2008年，姚玉欣等人从苹果果实中分离了 cyMDH的全长cDNA序列，该序列含有一个996bp的开放阅读框(ORF)。序列同源性分析表明Mal-cyMDH与其他物种cyMDH有较高的同源性。原核表达得到一个37kD左右的融合蛋白，酶活测定表明该酶主要催化合成苹果酸。
[0010]2011年，李倩等人以大肠杆菌基因组DNA为模板，扩增得到苹果酸脱氢酶(mdh)编码基因mdh，构建了重组菌pET-28a-mdh/BL21并成功表达了苹果酸脱氢酶，大小约36000。选用Ni柱亲和层析法纯化具有活性的苹果酸脱氢酶，纯化后比酶活达到112.5U/mg，纯化倍数达2.62倍，回收率为59%。
[0011]2011年，G Nava等人从猪带绦虫胞浆中克隆到了一个苹果酸脱氢酶的完整编码序列。这个苹果酸脱氢酶的cDNA序列从猪带绦虫基因组项目数据库发现，编码332个氨基酸残基的蛋白质，分子量大约为36.5kDa。
[0012]2012年，李文爽等人利用电子克隆技术获得大豆中的苹果酸脱氢酶基因cDNA序列，并对基因及其编码蛋白进行生物信息学分析和预测，为进一步克隆该基因、解决植物磷高效基因数量缺乏等问题提供依据。结果表明，大豆中的苹果酸脱氢酶基因(GmMDHl)cDNA序列长度为1574bp，开放阅读框1230bp，编码409个氨基酸残基。
[0013]2013年，YY Chang等人从Thermus thermophilus的基因组中扩增到了一个苹果酸脱氢酶基因，并且克隆岛pET21b载体上进行了表达。该蛋白在大肠杆菌菌株BL21 (DE3)中以可溶形式存在。
[0014]但是，目前NCBI数据库中目前还检索不到中国被毛孢中苹果酸脱氢酶的基因相关信息。
(三)
【发明内容】
[0015]本发明目的在于针对以上存在的不足和需要解决的技术问题，对“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢在参与三羧酸循环用于柠檬酸合成中的酶及其编码基因进行深入研究，提供了 “百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢在参与三羧酸循环用于柠檬酸合成中的一种苹果酸脱氢酶A、以及编码基因及其应用。
[0016]本发明采用的技术方案是:
[0017]一种参与中国被毛孢在三羧酸循环用于柠檬酸合成中的苹果酸脱氢酶A (Malicdehydrogenase),与SEQ ID N0.1所示氨基酸序列具有90%以上同源性。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90%以上，均属于本发明保护范围之列。具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
[0018]优选的，所述苹果酸脱氢酶A氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示(记为mdhA蛋白);该酶可催化苹果酸制备相应的草酰乙酸。
[0019]本发明述苹果酸脱氢酶A来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢。
[0020]由苹果酸经过苹果酸脱氢酶A的催化获得对应草酰乙酸的路径如下所示:
[0021]
【权利要求】
1.一种冬虫夏草中国被毛孢苹果酸脱氢酶A，其特征在于所述脱氢酶A的氨基酸序列如 SEQ ID N0.1 所示。
2.如权利要求1所述的苹果酸脱氢酶A在生物催化苹果酸制备草酰乙酸中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为:以含苹果酸脱氢酶A基因的重组工程菌经诱导培养获得的湿菌体用pH8.0磷酸盐缓冲液悬浮，超声破碎后，离心，取上清液为催化剂，以0.1M苹果酸水溶液为底物，以3.75mM的NADH水溶液为辅酶，于pH值为7.0的磷酸缓冲液中，37°C下反应，反应结束后，将反应液离心，取上清液即获得含草酰乙酸的混合液。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于:所述底物的体积用量以苹果酸质量计，所述苹果酸的初始浓度为0.05M，所述催化剂的体积用量以破碎前湿菌体的质量计为4.2g/L，所述反应体系中NADH的用量为3.75 μ mol/L。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备:将含苹果酸脱氢酶A基因的重组工程菌接种于含终浓度50 μ g/ml的Kan抗性的LB液体培养基中，37°C、250r/min培养过夜，取培养物，以体积浓度2%接种量转接于含有终浓度50 μ g/ml Kan抗性的LB液体培养基中，37°C、250r/min培养至菌体浓度0D600为0.6~0.8，向培养物中加入终浓度0.05mmol/L的IPTG诱导培养8h，收集湿菌体，将湿菌体在功率40%、破Is停Is条件下超声破碎，离心，取上清液即为催化剂。
6.一种编码权利要求1所述苹果酸脱氢酶A的基因。
7.如权利要求6所述 的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。
8.如权利要求6或7所述的编码基因在构建能够生物催化苹果酸制备草酰乙酸的基因工程菌中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的应用为:构建含有所述苹果酸脱氢酶A基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化获得含有苹果酸脱氢酶A基因的菌体细胞。
【文档编号】C12N15/70GK104130985SQ201410308610
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】柳志强, 郑裕国, 林善, 薛亚平, 吴晖, 李邦良, 许静, 许峰, 袁水金, 王鸿艳 申请人:浙江工业大学, 杭州中美华东制药有限公司