冬虫夏草中国被毛孢漆酶、编码基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及两个来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与降解木质素、酚类中的漆酶(Laccase)，编码这个酶的基因及其应用。所述漆酶的氨基酸序列与SEQ?ID?No.1所示的蛋白具有90％以上同源性，其编码基因核苷酸序列与SEQ?ID?No.2所示序列具有90％以上同源性。本发明从原理上对酚类合成苯醌进行了详细研究，提供了“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与降解酚类中的漆酶及其编码基因，本发明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用来通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节催化酚类制备相应的苯醌的酶对应编码基因的表达，赋予宿主漆酶的高表达性，为扩大漆酶的生物应用提供了有效途径，具有重大应用前景。
【专利说明】冬虫夏草中国被毛孢漆酶、编码基因及其应用
(—)
【技术领域】
[0001]本发明涉及一个来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与降解木质素、酚类中的漆酶(Laccase)，编码这个酶的基因及其应用。
(二)
【背景技术】
[0002]冬虫夏草(Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.)是冬虫夏草菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆虫(Hepialus armoricanus Oberthur)幼虫上的子座及幼虫尸体上的复合体(包括子座和虫体)。冬虫夏草是一类珍惜的传统真菌药材资源，具有代谢产物和生物活性多样的特点，在生物医药领域展现出巨大的应用和发展前景。冬虫夏草以其多种药用功效广泛、明显而备受关注，在世界范围内备受推崇。中医认为，冬虫夏草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。现代药理学已证实，冬虫夏草具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素样作用等广泛的生物活性。
[0003]冬虫夏草菌是一种子囊菌，在其生活史中具有分生孢子阶段(无性型)和子囊孢子阶段(有性型)。而在人工培养、液体发酵等实际生产中使用的是无性阶段的冬虫夏草菌，因而冬虫夏草无性型的鉴定非常重要。国内外学者在冬虫夏草资源调查、无性型确证、活性成分分离分析和作用机理、开发应用方面做了大量工作。冬虫夏草中国被毛孢已被证明是冬虫夏草的无性型存在形式，具有与天然冬虫夏草相同的活性成分和药效。
[0004]但是，对冬虫夏草中国被毛孢中漆酶的研究几乎为空白，尤其在参与中国被毛孢木质素、酚类降解中的漆酶的研究上。
[0005]漆酶(EC: 1.10.3.2)是一种含铜的演化还原酶，学名应为对二酚:二氧氧化还原酶，属于氧化酶的蓝铜家族。它们广泛地存在于自然界中，植物中有，更是在几乎所有的真菌中都有。这一类酶最初发现于漆树的树脂中，也因此得名。迄今，在昆虫和原核生物中，都已经鉴定到这一类型的酶。它们可以是分泌的酶，也可以定位在细胞内，因物种而异。
[0006]漆酶在不同的物种发挥不同的功能:在昆虫中，它们参与甲壳的硬化；在植物中，参与细胞壁形成，还与木质素化和去木质素有关；在芽孢杆菌中，则是和抗紫外线的孢子组装有关；在一些植物致病性真菌利用这类酶免除植物抗毒素和鞣酸的作用，因此，漆酶也可看成是许多真菌疾病的毒力因子。
[0007]漆酶合适的底物分子是酚类，以及芳香性和脂肪性的胺类。它们催化的过程是底物的单电子氧化，生成相应的活性自由基。酶分子中含有4个铜原子构成的簇作为催化核心，实施氧化还原过程。在催化核心中铜原子的相互作用引起了强烈的电子吸收，产生了典型的蓝色。漆酶催化的循环过程，I分子的氧被还原为2分子的水同时4个底物分子氧化产生4个自由基，这些活性的中间物随后转变为二聚体、寡聚体和高聚物。
[0008] 漆酶催化的反应可以因为其他分子存在与否而分为3种不同的模式。最简单的模式是，只有一种底物分子，并不存在其它分子。在这样的情况下，酶直接催化底物的氧化，完成整个反应。第二种情况是，在酶和底物中存在着一个中介分子，通过中介分子的氧化还原过程，进行电子的传递。这种情况更常见，因为有时需要氧化的分子太大，无法与酶活性中心一铜簇接近，此时需要中介分子，或者因为底物分子的氧化还原电位太高，反应不能一次完成，此时也需要中介分子的帮助。
[0009]1996年，Debbie S.Yaver等人从白腐担子菌Trametes villosa分离到了 3个漆酶的基因，它们所编码的氨基酸序列和之前克隆岛的两个漆酶基因具有63-71%的同源性，它们分别包含12、10、11个内含子。
[0010]1997年，L.J..丨Snsson等人通过RNA-PCR的方法从木质素分解真菌Trametesversicolor中分离到了一个编码漆酶的cDNA，该cDNA编码一个498个氨基酸残基之前有一个22个残基的信号肽的漆酶同工酶。并且将该cDNA克隆到pHIL-D2载体上在AOXl启动子控制下的毕赤酵母中实现了表达。
[0011]2004年，张银波等人综合运用cDNA末端快速扩增(Rapid Amplificat1n of cDNAEnds, RACE)和基因组步行等技术克隆到一个金针燕(Flammulina velutipes)的漆酶结构基因和其对应的全长 cDNA，经测序和BLAST比对分析表明该基因属于多铜氧化酶基因家族，与已发表的漆酶基因(AF176230)的同源性最高。
[0012]2008年，郭梅等人以白腐菌杂色云芝RNA为模板，通过RT-PCR获得不带自身信号肽漆酶Lccl基因的cDNA片段。构建了重组表达载体pMET a A-Lccl，并将其线性化后用电穿孔法导入Pichia methabolica PMAD16, PCR结果表明Lccl基因已经整合到甲醇毕赤酵母染色体上。
[0013]2011年,Fangfang Fan等人从一种白腐真菌Trametes.sp中克隆和表征到了一个漆酶基因lac48424-l的全长cDNA序列。它具有高产漆酶和脱色不同染料的能力，这个全长1563bp的cDNA编码一个全长499个氨基酸的成熟漆酶蛋白，并且前面含有的21个氨基酸的信号肽，这个推导出来的蛋白序列显示出和其他已知的酵母漆酶有很高的相似性，含有4个铜离子结合的保守位点。
[0014]2012年,华欣春等人通过反转录反应从Coprinopsis cinerea okayama中克隆得到一个漆酶Iaccasel,应用SignalP3.0Server软件分析其氨基酸序列后,设计不含信号肽序列的新引物扩增得到漆酶基因，构建重组酵母表达载体pPIC9K-lacl，电击转化毕赤酵母GS1115，并用甲醇诱导表达，之后研究重组酶的酶学性质。克隆得到的Iaccasel碱基数为1593bp，编码530个氨基酸，其中信号肽包含18个氨基酸。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示重组蛋白的大小约为65kDa。
[0015]2012年，张永亮等人利用RT-PCR方法,克隆了野桑蚕Bombyx mandarina漆酶基因，获得了其cDNA序列。该序列长2317bp，含有一个2295bp的完整开放阅读框，有8个外显子，7个内含子，编码一个由764个氨基酸残基组成的蛋白质，其蛋白质的分子量和等电点分别为84.3kDa和6.61。推导的氨基酸序列与其它鳞翅目昆虫漆酶基因相应氨基酸序列有较高的同源性，该序列具有它们的漆酶基因所共有的典型特征。
[0016]2012年，马文寅等人比较了几种不同真菌DNA提取方法对血红密孔菌基因组的提取的影响，根据genbank中真菌漆酶氨基酸保守序列设计的简并引物，以血红密孔菌基因组总DNA为模板，扩增到一条长度为1084bp的DNA片段。通过blast比对，其基因序列与密孔菌属同源性最高为99%，氨基酸同源性为88%，说明扩增的片段确为密孔菌漆酶基因。
[0017]2013 年,Lin-Feng You 等人从一个白腐真菌 Ganoderma lucidum TR6 中克隆岛了一个基因组的漆酶基因，它包含有2086bp的内含子，包含1563bp的开放读码框，推测成熟的蛋白由520个氨基酸组成，并且它的cDNA序列在毕赤酵母中实现了表达。
[0018]2013年，Lei Lu等人从从地衣芽孢杆菌中克隆到了一个热碱稳定性的漆酶基因，并且在毕赤酵母中实现了表达，该重组的漆酶分泌到培养基中的最大的酶活达到了227.9U/L。
[0019]但是，目前NCBI数据库中目前还检索不到中国被毛孢中漆酶的基因相关信息。
(三)
【发明内容】
[0020]本发明目的在于针对以上存在的不足和需要解决的技术问题，对“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢降解木质素、酚类中的酶及其编码基因进行深入研究，提供了“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢降解木质素、酚类中的一种漆酶、以及编码的基因及其应用。
[0021]本发明采用的技术方案是:
[0022]一种参与中国被毛孢降解木质素、酚类中的漆酶，所述漆酶的氨基酸序列与SEQID N0.1所示序列具有90%以上同源性。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90%以上，均属于本发明保护范围之列。具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
[0023]优选的，所述漆酶氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示(记为IacA蛋白)；该酶可催化苯二酚制备相应的苯醌。
[0024]本发明述漆酶来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢。
[0025]由苯二酚经过漆酶的催化获得对应苯醌的路径如下所示:
[0026]
【权利要求】
1.一种冬虫夏草中国被毛孢漆酶，其特征在于所述漆酶氨基酸序列如SEQ ID N0.1所/Jn ο
2.如权利要求1所述的漆酶在生物催化苯二酚制备苯醌中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为:将含漆酶基因的重组工程菌经诱导培养获得湿菌体用PH8.0磷酸盐缓冲液悬浮，超声破碎后，离心，取上清液作为催化剂，以0.1M的2，2’ - 二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)铵盐水溶液为底物，于pH值为4.6的醋酸缓冲液中，37°C下反应，反应结束后，将反应液离心，获得含苯醌的混合液。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于:所述底物的用量以2，2’- 二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)铵盐质量计，所述2，2’ - 二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)铵盐的初始浓度为0.02M，所述催化剂的体积用量以破碎前湿菌体的质量计为4.8g/L。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备:将含漆酶的重组工程菌接种于含终浓度50 μ g/ml的Kan抗性的LB液体培养基中，37°C、250r/min培养过夜，取培养物，以体积浓度2%接种量转接于含有50 μ g/ml Kan抗性的LB液体培养基中，37°C、250r/min培养至菌体浓度0D600为0.6~0.8，向培养物中加入终浓度0.05mmol/L的IPTG诱导培养8h，收集湿菌体，将湿菌体在功率40%、破Is停Is条件下超声破碎，离心，取上清液即为催化剂。
6.一种编码权利要求1所述漆酶的基因。
7.如权利要求6所述的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。
8.如权利要求6或7所述的编码基因在构建能够生物催化苯二酚制备苯醌的基因工程菌中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的应用为:构建含有所述漆酶基因的重组载体，将所述重 组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化获得含有漆酶基因的菌体细胞。
【文档编号】C12P7/66GK104130983SQ201410308600
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】柳志强, 郑裕国, 林善, 薛亚平, 吴晖, 李邦良, 许静, 许峰, 王鸿艳 申请人:浙江工业大学, 杭州中美华东制药有限公司