一种基于dna银纳米簇均相筛选g-四链体配体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于抗肿瘤药物筛选的技术领域，特别涉及一种基于DNA-银纳米簇均相 筛选G-四链体配体的方法。
【背景技术】
[0002] 端粒是由端粒DNA和端粒结合蛋白构成的。端粒DNA是位于染色体末端并对染 色体具有保护作用的富含鸟嘌呤（G)的DNA重复序列，它由富GT链与富CA链配对的双螺 旋结构和一段3'末端悬突的富G单链的重复序列组成，人类端粒DNA为5' -TTAGGG-3' 重复序列。端粒酶是一种依赖于RNA的特殊聚合酶，由逆转录酶催化亚基（hTERT)、端粒 酶RNA和端粒酶其他聚合蛋白组成。端粒酶能以自身的RNA作为模板，在染色体末端合成 端粒序列，从而保持端粒长度稳定，使细胞永生化。研宄发现，端粒酶在正常体细胞中几 乎没有表达，但是在85%以上的癌症细胞中，端粒酶却呈阳性表达，而且进一步的研宄说 明，肿瘤细胞分化程度与端粒酶的活性直接相关，这表明端粒酶与肿瘤细胞的恶性转化及 快速增殖可能存在密切的关系（Shay J.W., Wright W.E.Telomerase therapeutics for cancer:challenges and new directions[J]. Nat. Rev. Drug Discov.2006, 5:577 - 584.), 因此恶性肿瘤与端粒酶的活性之间具有高度的相关性。
[0003] 富含G的端粒DNA单链在K+、Na+等离子以及一些药物分子的存在下可以通过G碱 基之间的Hoogsteen环状氢键形成稳定的G-四链体结构（Hupper J. L. , Balasubramanian S.Prevalence of quadruplexes in the human genome[J]. Nucleic. Acids. Res. 2005, 33(9) : 2908 - 2916.)。G-四链体的形成可以阻止端粒酶对端粒DNA序列的识别， 从而抑制端粒酶的活性。端粒酶活性的抑制可使肿瘤细胞端粒缩短直至细胞停止增殖，转 入细胞凋亡过程，从而抑制肿瘤的发展。因此这一发现使G-四链体成为端粒酶抑制剂作用 的新靶点，对于能够诱导形成或增强G-四链体稳定性的小分子化合物则很有可能对癌症 的治疗具有潜在的意义。
[0004] 在已报道的研宄工作中，X-射线衍射、表面等离子体共振（SPR)、核磁共振（NMR)、 等温滴定量热法（ITC)、电喷雾质谱法（ESI-MS)、凝胶电泳等多种分析方法被用来研宄 G-四链体及其配体的筛选。但是现在常用的方法均存在操作复杂，费时，成本较高、所要求 的实验条件较为苛刻等不足，因此，探寻一种低成本、简单操作且结果可靠的G-四链体及 配体的筛选方法是非常必要的。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是克服已有的技术的缺点，构建一种普适性强、低成 本、响应快速、灵敏可靠的基于DNA银纳米簇均相筛选G-四链体配体的方法。
[0006] 为了解决上述技术问题本发明所采用的技术方案是由下述步骤组成：
[0007] (1)用10mm〇l/LpH = 8.0的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液将单链核酸探针 配制为100 y mol/L的储备液备用，该单链核酸探针的序列为：5'-CCCCCCCCCCCCTTTTTTTA GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3'，再用相同方法将100 y mol/L单链核酸探针储备液浓度稀释 后加入原浓度为10mm〇l/L的硝酸银溶液，冰上孵育10~15分钟，再加入原浓度为lOmmol/ L的硼氢化钠溶液，使单链核酸探针在终混合液中的浓度达到20 y mol/L，单链核酸探针与 硝酸银、硼氢化钠的终浓度之比为1:5:5~1:12:12,混匀至反应完全，得到DNA-银纳米簇 溶液；
[0008] (2)用10mm〇l/L pH = 8. 0三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液将DNA-银纳米簇溶 液的浓度稀释至1. 0 U mol/L，在激发波长为460~470nm条件下检测其初始焚光值，并记录 为F〇;
[0009] (3)在步骤⑵的基础上加入中药单体溶液至中药单体在混合液中的最终浓度达 到20 ymol/L，混匀，待反应完全后在与步骤（2)相同的激发波长条件下检测其反应后的荧 光值，并记录为F ;若荧光强度值降低，则表明该中药单体可以诱导DNA-银纳米簇的端粒识 别序列形成G-四链体结构，该中药单体为G-四链体配体；若否，则相反，其不属于G-四链 体配体，从而实现G-四链体配体的均相筛选。
[0010] 上述步骤（1)中单链核酸探针与硝酸银、硼氢化钠的终浓度比为1 :6 :6。
[0011] 上述步骤（3)筛选的G-四链体配体为芦荟大黄素衍生物3、白杨素、大豆苷元、槲 皮素、大黄素、芦荟大黄素、山奈酚、大黄酚、芹菜素以及木犀草素的中药单体。
[0012] 上述单链核酸探针是由5'末端12个胞嘧啶、3'末端d(TTAGGG)4以及5个胸腺 嘧啶相链接构成。
[0013] 本发明提供的一种基于DNA银纳米簇均相筛选G-四链体配体的方法，其基于富G 单链和G-四链体对DNA-银纳米簇荧光信号具有不同的影响，结合人类端粒DNA本身就是 富G序列，通过端粒DNA与其配体相互作用前后由单链转化为四链体构型进而引起银纳米 簇荧光信号的变化均相筛选G-四链体配体，本发明的方法具有操作简便、响应快速、灵敏 可靠、普适性强、易于推广而且成本较低的特点，而且通过细胞荧光成像实验和MTT细胞增 殖实验进一步验证本发明的方法所筛选出G-四链体配体的确可以抑制癌细胞的生长，其 对于以G-四链体为靶点的小分子端粒酶抑制剂的研宄和抗肿瘤药物的开发、肿瘤的临床 治疗等具有重要的理论意义和实际意义。
【附图说明】
[0014] 图1为合成的5. 0 y mol/L DNA-银纳米簇的透射电子显微镜结果；
[0015] 图2为1. 0 y mol/L DNA-银纳米簇的激发和发射光谱图；
[0016] 图3为1. 0 ymol/L DNA-银纳米簇与10 ymol/L芦荟大黄素衍生物3(AED3)作用 前后的荧光激发和发射光谱对比图；
[0017] 图4为l.Oymol/LDNA-银纳米簇与10ym〇l/L苦参碱作用前后的荧光激发和发 射光谱对比图；
[0018] 图5为不同中药单体作用于DNA-银纳米簇后荧光信号变化的柱状图，匕代表单独 DNA-银纳米簇的信号，F代表加入中药单体后的荧光信号；
[0019]图6为人端粒DNA分别与芦荟大黄素衍生物3和苦参碱作用后的圆二色光谱图。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
[0021] 实施例1
[0022] 以芦荟大黄素衍生物3 (AED3)为例，筛选其是否为G-四链体配体的方法由以下步 骤组成：
[0023] (1)按照常规方法制得浓度为10mm〇l/LpH=8.0的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓 冲溶液，用该缓冲溶液将单链核酸探针（12C5TG，序列为：5' -CCCCCCCCCCCCTTTTTTTAGGGT TAGGGTTAGGGTTAGGG-3')配制成浓度为 100 y mol/L 的储备液，备用；向 155. 2 y L lOmmol/ LpH=8.0三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液中加入40 y L 100 ymol/L单链核酸探针储 备液，向单链核酸探针稀释液中加入2. 4 y L 10mm〇l/L硝酸银溶液，冰上孵育15分钟，快速 向以上混合溶液中加入2. 4 y L 10mmol/L硼氢化钠，使单链核酸探针在终混合液中的浓度 达到20 ymol/L，单链核酸探针、硝酸银和硼氢化钠的最终浓度比例是1 :6 :6,在漩涡振荡 器中剧烈震荡1分钟，至反应完全，得到DNA-银纳米簇溶液，4°C避光放置。
[0024] 将所得DNA-银纳米簇溶液用透射电子显微镜进行观察表征，如图1，由图1可以 看出该DNA-银纳米簇分散均匀，与已有的文献（马坤.DNA-Ag纳米簇旳合成及生物传感研 宄.浙江师范大学.硕士毕业论文）报道一致，证明确实合成了 DNA银纳米簇。
[0025] 进一步，为了表征本实施例合成的DNA-银纳米簇具有荧光特性，用普通的荧光测 试仪通过对DNA-银纳米簇激发和发射光谱的检测，结果如图2所示，该DNA-银纳米簇的最 大激发波长和最大发射波长分别在470nm和564nm，且具有较高的荧光强度，表明该DNA-银 纳米簇具有良好的荧光特性。
[0026] (2)用10mm〇l/LpH= 8. 0三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液将DNA-银纳米簇溶 液浓度稀释至1. 〇 U mol/L，在激发波长为470nm条件下检测其初始荧光值，并记录为F。。
[0027] (3)向步骤⑵的DNA-银纳米簇稀释液中加入10 y mol/L的芦荟大黄素衍生物 3 (AED3
【主权项】
1. 一种基于DNA银纳米簇均相筛选G-四链体配体的方法，其特征在于由以下步骤组 成： (1) 用lOmmol/LpH=8. O的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液将单链核酸探针配制 为100ymol/L的储备液备用，该单链核酸探针的序列为：5' -CCCCCCCCCCCCTTTTTTTAGGG TTAGGGTTAGGGTTAGGG-3'，再用相同方法将100ymol/L单链核酸探针储备液浓度稀释后 加入原浓度为lOmmol/L的硝酸银溶液，冰上孵育10~15分钟，再加入原浓度为lOmmol/L 的硼氢化钠溶液，使单链核酸探针在终混合液中的浓度达到20ymol/L，单链核酸探针与硝 酸银、硼氢化钠的终浓度之比为1:5:5~1:12:12,混匀至反应完全，得到DNA-银纳米簇溶 液； (2) 用lOmmol/LpH= 8. 0三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液将DNA-银纳米簇溶液 的浓度稀释至1. 〇Umol/L，在激发波长为460~470nm条件下检测其初始焚光值，并记录为 F0; (3) 在步骤（2)的基础上加入中药单体溶液至中药单体在混合液中的最终浓度达到 20ymol/L，混匀，待反应完全后在与步骤（2)相同的激发波长条件下检测其反应后的荧光 值，并记录为F;若荧光强度值降低，则表明该中药单体可以诱导DNA-银纳米簇的端粒识别 序列形成G-四链体结构，该中药单体为G-四链体配体；若否，则相反，其不属于G-四链体 配体，从而实现G-四链体配体的均相筛选。
2. 根据权利要求1所述的基于DNA银纳米簇均相筛选G-四链体配体的方法，其特征在 于：所述步骤（1)中单链核酸探针与硝酸银、硼氢化钠的终浓度比为1 :6 :6。
3. 根据权利要求1所述的基于DNA银纳米簇均相筛选G-四链体配体的方法，其特征在 于：所述步骤（3)筛选的G-四链体配体为芦荟大黄素衍生物3、白杨素、大豆苷元、槲皮素、 大黄素、芦荟大黄素、山奈酚、大黄酚、芹菜素以及木犀草素的中药单体。
4. 根据权利要求1所述的基于DNA银纳米簇均相筛选G-四链体配体的方法，其特征在 于：所述单链核酸探针是由5'末端12个胞嘧啶、3'末端d(TTAGGG)4以及5个胸腺嘧啶相 链接构成。
【专利摘要】本发明涉及一种基于DNA银纳米簇均相筛选G-四链体配体的方法，其是在稀释的单链核酸探针溶液中先后加入硝酸银溶液，冰上孵育后，再加入硼氢化钠溶液，先得到DNA-银纳米簇溶液；在460～470nm条件下检测DNA-银纳米簇溶液在加入中药单体前后的荧光强度，若加入中药单体后荧光强度降低，则说明该中药单体可以诱导DNA-银纳米簇的端粒识别序列形成G-四链体结构，该中药单体为G-四链体配体；否则，相反，从而实现G-四链体配体的均相筛选。本发明的筛选方法具有操作简便、响应快速、灵敏可靠、普适性强、易于推广而且成本较低的特点。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104694633
【申请号】CN201510063935
【发明人】金燕, 成锐, 张琦
【申请人】陕西师范大学
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年2月6日