一种多负电荷血红蛋白α亚基的制作方法
【专利摘要】一种多负电荷血红蛋白α亚基，涉及一种构成血红蛋白类红细胞代用品人造血的组成成分，属于生物医药【技术领域】，是由人血清白蛋白和人血红蛋白α亚基组成的融合蛋白，人血清白蛋白和人血红蛋白之间由连接肽连接而成；其制备方法：通过PCR扩增的方法或用化学方法全合成方法合成所述的融合蛋白多肽链氨基酸序列；将融合蛋白多肽链氨基酸序列克隆至原核表达载体中；将表达载体转化至表达体系的细胞中；通过诱导的方法鉴定含有有效的细胞；对细胞进行分离和纯化；所述的融合蛋白的分子量大和携带很多负电荷这两个因素导致即便是单体的形式也不能够通过肾过滤，降低对人体的副作用；人血清白蛋白也可以结合血红素；因此用该融合蛋白制备人造血有更强的结合和运输氧气的能力。
【专利说明】—种多负电荷血红蛋白α亚基
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种构成血红蛋白类红细胞代用品人造血的组成成分:多负电荷血红蛋白α亚基，属于生物医药【技术领域】。
【背景技术】
[0002]输血属于临床治疗必须的基本治疗手段。中国作为世界上人口最多的国家，每天都有大量的外伤、手术和急诊患者需要输血救治。特别是在各种自然灾害、重大突发公共卫生事件和军事冲突发生的现场，血液的需要量会大幅度增加，容易保藏和使用的人造血对于挽救生命具有重要的意义。此外，我国将逐渐进入老龄化社会，血液供给和需求的矛盾会更加突出。目前，我国血液制品数量不足或质量不高，不能满足临床需求，媒体经常报道某个城市闹“血荒” 的新闻。除了鼓励更多人参加义务献血之外，研究和掌握红细胞代用品人造血制造技术并在临床推广使用才能彻底解决日益突出的血液供需矛盾。
[0003]因此，人造血产品的研究和开发关系到人民群众的健康和和谐社会的建设，是社会发展中迫切需要解决的关键科技问题之一，具有重大的经济价值和社会效益。人造血(artifical blood)或血液替代品(blood substitute),是指能够替代血液某一功能的制品。本发明所指的人造血是人工生产的，能够替代红细胞(red blood cells，RBCs)，具有吸收、运输和释放氧气到组织功能的产品，又称人造氧载体(oxygen carriers)。
[0004]血红蛋白类红细胞代用品是利用人或动物的血红蛋白做原料经修饰后用作人造血的一类。人的血红蛋白是由两个α亚基和两个β亚基组成的四聚体。不在红细胞之内，在循环系统中游离的血红蛋白四聚体能够首先解离成α β 二聚体，然后继续解离成单体。由于分子量比较小，α β 二聚体以及单体都可以通过肾过滤，有肾毒性的副作用。为了降低和避免这个不良反应，目前多采用化学修饰的办法，如交联，聚合和偶联等，加大血红蛋白分子量。但是，这些方法并不能完全消除副作用。如，用化学交联的血红蛋白总有一定比例的血红蛋白没有被修饰。在动物实验中甚至已交联的血红蛋白也可以解离产生肾过滤而大量出现在尿液中。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种构成血红蛋白类红细胞代用品人造血的组成成分:多负电荷血红蛋白α亚基。
[0006]为了实现本发明的目的，我们采用如下的技术方案予以实施:
[0007]一种多负电荷血红蛋白Ct亚基，其特征在于:
[0008]所述的多负电荷血红蛋白Ct亚基是由人血清白蛋白和人血红蛋白α亚基组成的融合蛋白；
[0009]所述的融合蛋白是由人血清白蛋白和人血红蛋白之间由连接肽连接而成；
[0010]所述的融合蛋白的N-末端由带负电荷的人血清白蛋白结构域和C-末端的人血红蛋白α结构域组成；
[0011]所述的融合蛋白多肽链氨基酸序列如序列表一所示。
[0012]进一步，所述的连接肽的改变相应改变融合蛋白多肽链氨基酸序列和长度，但整个融合蛋白结构和功能不变。
[0013]进一步，所述的融合蛋白的结构为折叠后三维结构。
[0014]一种多负电荷血红蛋白α亚基的制备方法，其特征在于:所述的制备方法步骤如下:
[0015]一、通过用血液和肝脏组织中所提取的RNA用RT-PCR扩增的方法获得所述的融合蛋白多肽链氨基酸序列或用化学方法全合成方法合成所述的融合蛋白多肽链氨基酸序列；
[0016]二、将步骤一所述的融合蛋白多肽链氨基酸序列克隆至原核表达载体中；
[0017]三、将步骤二所述的表达载体转化至表达体系的细胞中；
[0018]四、通过IPTG诱导的方法鉴定含有所述的融合蛋白多肽链氨基酸序列的细胞；
[0019]五、对步骤四所述的细胞进行分离和纯化。
[0020]进一步，所述的原核表达载体为pSumo-Mut。
[0021]再进一步所述的pSumo-Mut含有6xHis_Sumo标签。
[0022]更进一步，所述的标签被克隆所用的酶切位点保证正确地加到重组表达的多负电荷血红蛋白α亚基的N末端。
[0023]有益.说明
[0024]本发明所述的一种多负电荷血红蛋白α亚基的制备方法，用于生产血红蛋白类红细胞代用品人造血的组成成分:多负电荷血红蛋白α亚基，彻底解决血红蛋白四聚体解离后的亚基经肾过滤引起人体不良反应的难题。
[0025]本发明利用基因重组技术，将人血清白蛋白和人血红蛋白通过连接肽构建成融合蛋白。由于融合蛋白的人血清白蛋白部分是血红蛋白分子量的四倍，整个融合蛋白五倍于未经修饰的血红蛋白的分子量。同时，人血清白蛋白在生理条件下有大量的负电荷，因此，所生产出的修饰后的血红蛋白会也会携带这些负电荷。分子量大和携带很多负电荷这两个因素导致即便是单体的形式也不能够通过肾过滤，降低对人体的副作用。同时，人血清白蛋白也可以结合血红素。因此用本发明所描述的多负电荷血红蛋白α亚基作为组成成分制备人造血有更强的结合和运输氧气的能力。
【具体实施方式】
[0026]实施例:
[0027]—、用化学全合成的方法合成编码融合蛋白多肽链氨基酸序列，其DNA序列如下序列表二所示。
[0028]所述的DNA序列有以下氨基酸序列的蛋白质:氨基酸1-586是人血清白蛋白序列；587-595是连接肽(斜体)；最后596-736是人血红蛋白α亚基，如序列表三所示。
[0029] 二、将上述序列克隆至原核表达载体pSumo-Mut中，pSumo-Mut表达载体中含有6xHis-Sumo “标签”。克隆所用的酶切位点保证这个“标签”可以正确地加到重组表达的多负电荷血红蛋白α亚基的N末端。
[0030]三、将所述的pSumo-Mut表达载体转化至大肠杆菌细胞中；
[0031]四、通过IPTG诱导的方法鉴定大肠杆菌细胞中含有所述的融合蛋白多肽链氨基酸序列的细胞；
[0032]五、A、分离:将多负电荷血红蛋白α亚基原核表达载体转化进入至大肠杆菌细胞中，采用IPTG的方法诱导后，收集含有多负电荷血红蛋白α亚基原核表达载体大肠杆菌细胞，经破碎、离心后，将大肠杆菌细胞用SDS-PAGE电泳分析法分离蛋白质，然后经过沉淀、上清液、根据所述融合蛋白的分子量分离出表达的多负电荷血红蛋白α亚基的融合蛋白；B、纯化:由于所表达的多负电荷血红蛋白α亚基含有6xHis-Sumo “标签”，因此可以用Ni柱层析法将本发明构建的带负电荷血红蛋白纯化出来，纯度可达90%以上。
【权利要求】
1.一种多负电荷血红蛋白Ct亚基，其特征在于: 所述的多负电荷血红蛋白α亚基是由人血清白蛋白和人血红蛋白α亚基组成的融合蛋白； 所述的融合蛋白是由人血清白蛋白和人血红蛋白之间由连接肽连接而成； 所述的融合蛋白的N-末端由带负电荷的人血清白蛋白结构域和C-末端的人血红蛋白α结构域组成； 所述的融合蛋白多肽链氨基酸序列:
MDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAffAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL-连接肽-VLSPADKTNVKAAffGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHFDLSHGSAQVKGHGKKVADALTNAVAHVDDMPNALSALSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHCLLVTLAAHLPAEFTPAVHASLDKFLASVSTVLTSKYRo
2.一种多负电荷血红蛋白α亚基的制备方法，其特征在于:所述的制备方法步骤如 下: 一、通过用血液和肝脏组织中所提取的RNA用RT-PCR扩增的方法获得所述的融合蛋白多肽链氨基酸序列或用化学方法全合成方法合成所述的融合蛋白多肽链氨基酸序列； 二、将步骤一所述的融合蛋白多肽链氨基酸序列克隆至原核表达载体中； 三、将步骤二所述的表达载体转化至表达体系的细胞中； 四、通过IPTG诱导的方法鉴定含有所述的融合蛋白多肽链氨基酸序列的细胞； 五、对步骤四所述的细胞进行分离和纯化。
3.根据权利要求1所述的一种多负电荷血红蛋白α亚基，其特征在于:所述的连接肽的改变相应改变融合蛋白多肽链氨基酸序列和长度，但整个融合蛋白结构和功能不变。
4.根据权利要求2所述的一种多负电荷血红蛋白α亚基的制备方法，其特征在于:所述的原核表达载体为pSumo-Mut。
5.根据权利要求5所述的一种多负电荷血红蛋白α亚基的制备方法，其特征在于:所述的 pSumo-Mut 含有 6xHi s-Sumo 标签。
6.根据权利要求6所述的一种多负电荷血红蛋白α亚基的制备方法，其特征在于:所述的标签被克隆所用的酶切位点保证正确地加到重组表达的多负电荷血红蛋白α亚基的N末端。
7.根据权利要求1或3所述的一种多负电荷血红蛋白α亚基的制备方法，其特征在于:所述的融合蛋白的结构为折叠后三维结构。
【文档编号】C07K19/00GK104163867SQ201310184846
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2013年5月20日 优先权日:2013年5月20日
【发明者】王子元, 许铁, 刘抗, 王菲, 傅学斌, 燕宪亮, 杨红宁 申请人:王子元, 许铁, 王烽宇