一种嗜酸乳酸足球菌及定向生产瓜氨酸和鸟氨酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种嗜酸乳酸足球菌及定向生产瓜氨酸和鸟氨酸的方法，属于食品生物【技术领域】。所述嗜酸乳酸足球菌(Pediococcus?acidilactici)BBE1120，已于2013年12月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC?NO:M2013732。以该菌全细胞为催化剂转化精氨酸产瓜氨酸或鸟氨酸，净转化率可达80-90％。
【专利说明】一种嗜酸乳酸足球菌及定向生产瓜氨酸和鸟氨酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种嗜酸乳酸足球菌及定向生产瓜氨酸和鸟氨酸的方法，属于食品生 物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 瓜氨酸能够提高机体免疫力，平衡血糖水平，帮助保持胆固醇的正常水平。也可以 保持血管松弛，增强男性性功能，以及治疗性功能障碍。还可以维护健康的肺功能以及提高 脑力清晰度，降低压力和克服沮丧情绪。瓜氨酸作为抗氧化剂，可广泛的用于化妆品，保健 食品，食品添加剂以及营养强化剂，同时还可对厌氧物质提供保护。目前，瓜氨酸的生产方 法主要有化学法、酶法和发酵法。化学法存在一定安全性隐患，而酶法生产成本较高。发酵 法是直接利用发酵所得微生物进行全细胞转化反应，此方法成本低，产量高，可直接获得产 物，易操作，但是产品纯度较低，可能存在其他代谢产物。
[0003] 鸟氨酸能够提高机体激素水平，因此，对于机体抗衰老是非常必要的。它有助于维 持肌肉和身体组织营养需求。鸟氨酸的作用包括机体的创伤，烧伤快速恢复，能够有效预防 感染甚至对癌症等疾病的康复治疗有着非常重要的作用。它对于治疗肝硬化造成的大脑异 常（肝性脑病）有非常良好的效果。在临床试验中，每天使用10_30g鸟氨酸的烧伤病人可 以更快愈合。此外，癌症和外伤患者通过服用鸟氨酸可以加快愈合，缩短住院时间。鸟氨酸 也可以增加胰岛素和激素水平。有助于减少衰老过程中的肌肉损失。鸟氨酸的生产主要有 合成法、酶法和发酵法3种方法。合成法是早期研究鸟氨酸时的制备方法，其过程复杂，成 本较高，而且产生的鸟氨酸同时有L型和D型两种。酶法生产主要存在酶制剂的制取困难 以及生产成本较高的问题。发酵法的优势在于具有极低的生产成本，但菌种的精氨酸利用 能力是制约其产能的重要因素。
[0004] 乳酸菌可以把精氨酸通过精氨酸脱亚氨基途径（ADI途径）转化成瓜氨酸。ADI途 径主要由三个关键酶（图1)，ADI，0TC和CK。不同的培养条件将导致精氨酸代谢流向不同 的方向，可积累中间产物瓜氨酸或终产物鸟氨酸。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一株嗜酸乳酸足球菌（Pediococcus acidilactici)BBE1120,已于 2013年12月31日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏地址是中国武汉，武汉大 学，保藏编号为CCTCC N0:M2013732。
[0006] 所述嗜酸乳酸足球菌分离自传统酱油工艺的成曲，能够耐受18-20% NaCl。其保 藏条件如下：从生长良好的平板上挑取单菌落转接入MRS培养基中，在37°C静置培养四天， 取500 μ L培养液移入含有500 μ L40%甘油的保藏管中，置于-80°C冰箱保存。所述MRS培 养基为培养乳酸杆菌专用，购于0XI0D公司。
[0007] 所述P.acidilactici BBE1120在高盐、弱碱性以及添加 CTAB (十六烷基三甲基溴 化铵）的条件下消耗精氨酸积累瓜氨酸。
[0008] 所述高盐条件优选含10% -15% (质量分数）NaCl的环境。
[0009] 所述弱碱性条件优选ρΗ7· 5-8. 5。
[0010] 所述CATB的用量范围优选0· 5-1. Og/L。
[0011] 所述P.acidilactici BBE1120在酸性和/或添加 DNP(2,4-二硝基苯酚）的条件 下消耗精氨酸积累鸟氨酸。
[0012] 所述酸性条件优选ρΗ3· 5-4. 5。
[0013] 所述DNP的用量范围优选2. 5mmol/L-5mmol/L。
[0014] 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种应用所述嗜酸乳酸足球菌全细胞转 化生产瓜氨酸的方法。
[0015] 所述方法优选将菌体在高盐弱碱性或添加 CTAB的条件下消耗精氨酸积累瓜氨 酸。
[0016] 所述方法进一步优选将菌体按l-5g/L添加到含50-100g/L精氨酸、0.5-lg/L CTAB、20g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨、2g/L柠檬酸三胺的全细胞转化液中，在37°C下进行转化 反应48h。
[0017] 所述方法进一步优选将菌体按lg/L添加到含100g/L精氨酸、0. 5g/L CTAB、20g/L 葡萄糖、5g/L蛋白胨、2g/L柠檬酸三胺的全细胞转化液中，在37°C下进行转化反应48h。
[0018] 所述方法还优选菌体按l_5g/L添加到含50-100g/L精氨酸和150g/L NaCl、20g/ L葡萄糖、5g/L蛋白胨、2g/L柠檬酸三胺的pH7. 5-8. 5的全细胞转化液中，在37°C下进行转 化反应120h。
[0019] 所述方法还进一步优选菌体按lg/L添加到含100g/L精氨酸和150g/L NaCl、20g/ L葡萄糖、5g/L蛋白胨、2g/L柠檬酸三胺的pH为8. 0全细胞转化液中，在37°C下进行转化 反应120h。
[0020] 所述全细胞转化液优选柠檬酸磷酸盐缓冲液，通过柠檬酸磷酸盐缓冲液来调控反 应体系的pH。
[0021] 本发明要解决的第三个技术问题是提供一种应用所述嗜酸乳酸足球菌全细胞转 化生产鸟氨酸的方法。
[0022] 所述方法优选将菌体按l_5g/L添加到含100g/L精氨酸、20g/L葡萄糖、5g/L蛋白 胨、2g/L柠檬酸三胺的pH为3. 5-4. 5的全细胞转化液中，在30°C下进行转化反应48h。
[0023] 所述方法将菌体按lg/L添加到含100g/L精氨酸、20g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨、2g/ L柠檬酸三胺的pH3. 5的全细胞转化液中，在30°C下进行转化反应48h。
[0024] 所述方法进一步优选向反应体系中添加 DNP以进一步提高转化率，DNP的用量范 围优选 2. 5mmol/L-5mmol/L〇
[0025] 所述全细胞转化液优选柠檬酸磷酸盐缓冲液，通过柠檬酸磷酸盐缓冲液来调控反 应体系的pH。
[0026] 用于全细胞转化产瓜氨酸或鸟氨酸的细胞优选通过以下步骤获得：将保藏的所述 嗜酸乳酸足球菌在MRS固体培养基上划线，于37°C静置培养48h，挑取单菌落接入MRS液体 培养基，37°C静置培养16h。将获得的培养液以10%的接种比例接种至发酵培养基中，37°C 静置培养1611，101^11(8000印111，4°〇低温离心后去上清并取菌体沉淀，使用0.85%的生理 盐水冲洗两次后，加入到全细胞转化液中用于催化反应。
[0027] 所述发酵培养基为含有lOg/L精氨酸的MRS培养基，pH5. 5。
[0028] 本发明的有益效果是找到一株可以通过改变生产条件而能够同时用于生产瓜氨 酸和鸟氨酸的具有高精氨酸利用率的嗜酸乳酸足球菌。本发明的菌株，以精氨酸为底物、 全细胞为催化剂，在高盐、弱碱性以及添加 CTAB条件下消耗精氨酸积累瓜氨酸，净转化率 90%左右；在酸性以及添加 DNP(2,4_二硝基苯酚）的条件下消耗精氨酸积累鸟氨酸，净转 化率80%以上。
[0029] 生物材料保藏
[0030] 嗜酸乳酸足球菌（Pediococcus acidilactici)BBE1120，已于 2013 年 12 月 31日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC N0:M2013732〇
【专利附图】
【附图说明】
[0031] 图1精氨酸脱亚氨基途径
【具体实施方式】
[0032] 样品中精氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸含量的测定：
[0033] (1)样品预处理：取200 μ L转化上清液，加入lmL EP管中。加入800 μ L5%的三 氯乙酸，静置5min。lmL样品经过0. 22 μ m水性滤头过滤后lOOOOrpm离心lOmin，处理后的 样品通过HPLC检测样品中氨基酸含量。
[0034] (2)检测条件：安捷伦液相色谱仪Agilentl200 (美国安捷伦公司）；分 析方法：采用邻二甲苯（〇PA)、9-芴甲基氯甲酰酯（FM0C)进行柱前衍生；色谱柱： 0DS-2Hypersil(250mmX4. 6mmX5ym);柱温：40°C ;流速：1. OmL/min ;紫外检测器：激发波 长 338nm。
[0035] ⑶流动相A相：称取5. 0g无水乙酸钠于1000mL烧杯中，加入1000mL水搅拌至充 分溶解，再加入200 μ L三乙胺，搅拌并滴加5%的醋酸，将pH调到7. 20±0. 05 ;加入5 μ L四 氢呋喃，混合后备用。流动相Β液：称取5. 0g结晶乙酸钠于1000mL烧杯中，加入200mL搅 拌至所有结晶溶解，滴加5 %醋酸将pH调到7. 20 ± 0. 05，将此溶液加入400mL乙腈和400mL 甲醇，混合后备用。梯度洗脱程序见表1。
[0036] 表1氨基酸分析梯度洗脱表
[0037]
【权利要求】
1. 一株嗜酸乳酸足球菌（Pediococcus acidilactici)BBE1120,于 2013 年 12 月 31 日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC N0:M2013732〇
2. 根据权利要求1所述的嗜酸乳酸足球菌BBE1120,其特征在于，在高盐、弱碱性以及 添加十六烷基三甲基溴化铵的条件下消耗精氨酸积累瓜氨酸；在酸性以及添加2,4_二硝 基苯酚的条件下消耗精氨酸积累鸟氨酸；所述高盐条件是含100-150g/L NaCl，所述弱碱性 条件是ρΗ7· 5-8. 5,所述酸性条件是ρΗ3· 5-4. 5。
3. -种应用权利要求1所述嗜酸乳酸足球菌全细胞转化生产瓜氨酸的方法，其特征在 于，是将菌体在高盐弱碱性或添加CTAB的条件下消耗精氨酸积累瓜氨酸，所述高盐条件是 含100-150g/L NaCl，所述弱碱性条件是ρΗ7· 5-8. 5。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将菌体按l-5g/L添加到含50-100g/L精 氨酸、0. 5-lg/L CTAB、20g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨、2g/L柠檬酸三胺的全细胞转化液中，在 37°C下进行转化反应48h。
5. 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，将菌体按lg/L添加到含100g/L精氨 酸、0. 5g/L CTAB、20g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨、2g/L柠檬酸三胺的全细胞转化液中，在37 °C 下进行转化反应48h。
6. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将菌体按l-5g/L添加到含50-100g/L精 氨酸和100-150g/L NaCl、20g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨、2g/L柠檬酸三胺的pH7. 5-8. 5的全 细胞转化液中，在37°C下进行转化反应120h。
7. 根据权利要求3或6所述的方法，其特征在于，菌体按lg/L添加到含100g/L精氨 酸和150g/L NaCl、20g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨、2g/L柠檬酸三胺的pH为8. 0全细胞转化液 中，在37°C下进行转化反应120h。
8. -种应用权利要求1所述嗜酸乳酸足球菌全细胞转化生产鸟氨酸的方法，其特征在 于，将菌体按l_5g/L添加到含100g/L精氨酸、20g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨，2g/L柠檬酸三胺 的pH为3. 5-4. 5的全细胞转化液中，在30°C下进行转化反应48h。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将菌体按lg/L添加到含100g/L精氨酸、 20g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨、2g/L柠檬酸三胺的pH3. 5的全细胞转化液中，在30°C下进行转 化反应48h。
10. 根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，还包括向反应体系中添加 DNP以进 一步提高转化率。
【文档编号】C12R1/01GK104099270SQ201410308979
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月1日 优先权日:2014年7月1日
【发明者】陈坚, 方芳, 张继冉, 刘晓慧, 张丽梅, 堵国成 申请人:江南大学